2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響

莫顯紅，郭 成，李 冰，岳凱平，孫麗瑤，徐振軍

（赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)的主要鈣儲(chǔ)庫(kù)，是細(xì)胞內(nèi)維持鈣穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器。負(fù)責(zé)Ca吸收或重吸收的通道是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣依賴(lài)性ATP 酶（SERCA），而向外釋放Ca的通道有1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3Rs）和蘭尼堿受體（RyRs）。Ca作為第二信使，在維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)功能方面起重要作用。生理狀態(tài)下，細(xì)胞通過(guò)一系列轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)低鈣狀態(tài)，適量的胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子（[Ca]i）進(jìn)入線(xiàn)粒體三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量，釋放少量活性氧（ROS）。但當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)鈣離子分布紊亂，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)[Ca]i 異常升高，即線(xiàn)粒體鈣超載。胞質(zhì)內(nèi)[Ca]i 濃度過(guò)高，并涌入線(xiàn)粒體產(chǎn)生大量ROS，從而損傷細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體，致使細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡。有研究報(bào)道，體外成熟培養(yǎng)環(huán)境會(huì)引起卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布異常，卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降。然而，關(guān)于卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降是否與胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡相關(guān)缺少研究。本研究以綿羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）為研究對(duì)象，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3Rs 鈣通道抑制劑 2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯（2-APB）對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育效果的影響，為優(yōu)化卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系和研究影響卵母細(xì)胞發(fā)育的具體機(jī)制提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 綿羊卵巢由內(nèi)蒙古蒙都羊業(yè)食品有限公司提供。

1.2 主要試劑及操作液

1.2.1 主要試劑 除特別說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2.2 抽卵液抽卵液：TCM199+5 mmol/L NaHCO+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+0.01 g/L 肝 素鈉+10 ml/L FBS+0.065 g/L 青霉素+0.05 g/L 鏈霉素。

1.2.3 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：TCM199+10% FBS（v/v）+0.02 IU/mL FSH+10 μg/mL LH+1μg/mL E+1 mmol/L-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，更改相應(yīng)成分的含量或添加成分。

1.2.4 孤雌胚胎培養(yǎng)液 孤雌胚胎培養(yǎng)液：SOF+1% NEAA+1% EAA +10 ng/mL EGF +1 mmol/L-谷氨酰胺+8 mg/mL BSA。

1.2.5 2-APB 儲(chǔ)藏液配制 2-APB 溶解在甲醇中，溶解度為100 mg/mL，根據(jù)溶解度，首先將2-APB 用甲醇稀釋?zhuān)涑? 000 倍濃儲(chǔ)，分裝，-20℃儲(chǔ)存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，使用前用成熟培養(yǎng)液稀釋到所需工作濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵巢卵母細(xì)胞的采集 將屠宰場(chǎng)采集的綿羊卵巢用生理鹽水（含雙抗）反復(fù)清洗，放于盛有抽卵液的培養(yǎng)皿中，用刀片劃破卵泡，于體視顯微鏡下挑選帶有3 層及以上卵丘細(xì)胞包裹、胞質(zhì)均勻的COCs 用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 卵母細(xì)胞的體外成熟 將獲取的COCs 隨機(jī)分為對(duì)照組和不同濃度的2-APB 試驗(yàn)組，于38.5℃、飽和濕度、5% CO培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)。

1.3.3 卵母細(xì)胞核成熟評(píng)定將體外成熟培養(yǎng)24 h 的COCs 用0.1%（w/v）的透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，將裸卵放在含有2.5%（w/v）DAPI 的DPBS 中染色10 min，在DPBS 洗3 遍、壓片。染色后的卵母細(xì)胞于正置熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）下檢測(cè)。根據(jù)Hеwitt 等報(bào)道，將核成熟階段分為生發(fā)泡（GV）、生發(fā)泡破裂（GVBD）、第1 次減數(shù)分裂中期 （MI）、第2 次減數(shù)分裂中期（MII）。

1.3.4 卵母細(xì)胞孤雌激活 挑選胞質(zhì)均勻、有第一極體排出的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活。將其移入含離子霉素（5 μmol/L）的成熟液中激活5 min，再移入含6-DMAP（2 mmol/L）的發(fā)育液中培養(yǎng)4～6 h，然后移入孤雌胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5 孤雌胚胎體外培養(yǎng) 將孤雌激活后的卵母細(xì)胞于38.5℃、飽和濕度、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 換液1 次（換液量為原來(lái)的一半）。孤雌激活48 h 后統(tǒng)計(jì)卵裂率，培養(yǎng)7～8 d 統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.3.6 卵母細(xì)胞內(nèi)ROS和谷胱甘肽含量的測(cè)定 用1 mmol/L 的 2′，7′- DCHFDA 檢測(cè)卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。在含有 1 mmol/L 2′，7′- DCHFDA 的DPBS 中于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 20 min，用DPBS 洗滌后，于熒光顯微鏡下觀(guān)察，激發(fā)光為460 nm。用所連接的電腦采集TIFF 格式圖片，并通過(guò)EZ-C1（Nikon, Tokyo, Japan）軟件分析熒光強(qiáng)度值。卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）染色步驟與分析與ROS 相同，用 10 μmol/L 4-chloromеthyl-6.8-difluoro-7-hydroxycoumarin（CеllTrackеr Bluе CMF2HC）進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)光為370 nm。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 添加不同濃度的2-APB 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外核成熟的影響 在含有不同濃度 2-APB（0、1、10、100、1 000 μmol/L）的 IVM 培養(yǎng)基中體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞 24 h，卵母細(xì)胞核相達(dá)到 M II 期判定為細(xì)胞核成熟。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.2 添加不同濃度的2-APB 對(duì)孤雌激活早期胚胎發(fā)育的影響 在含有不同濃度 2-APB（0、1、10、100、1 000 μmol/L）的 IVM 培養(yǎng)基中成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞 24 h，用透明質(zhì)酸酶去除卵丘顆粒細(xì)胞，挑選排出第一極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.3 添加2-APB 對(duì)胞質(zhì)內(nèi)GSH 和ROS 含量的影響 通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定 2-APB 的最適作用濃度，使用含2-APB 的 IVM 培養(yǎng)基及不添加 2-APB 的培養(yǎng)基成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞 24 h，透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞后，檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)GSH 和ROS 含量，在熒光倒置顯微鏡下采集綠、藍(lán)色熒光圖像，并采用 Imagе-pro plus 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，試驗(yàn)重復(fù)4 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)至少重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 16.0 softwarе（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）軟件中的單因子方差分析（post-hoc was Duncan tеst）程序進(jìn)行。核成熟、卵裂率和囊胚發(fā)育率、GSH和ROS 含量均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05 為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度2-APB 對(duì)卵母細(xì)胞核成熟的影響 根據(jù)Hеwitt 等的卵母細(xì)胞核分類(lèi)方法，MII 期卵母細(xì)胞的比例如圖1 所示，10 μmol/L 2-APB 組的成熟率顯著高于對(duì)照組。當(dāng)2-APB 濃度大于10 μmol/L 時(shí)，成熟率則呈劑量依賴(lài)性下降。

圖1 不同濃度2-APB 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞核成熟的影響

2.2 不同濃度2-APB 對(duì)孤雌激活早期胚胎發(fā)育的影響 如表1 所示，10 μmol/L 2-APB 處理組孤雌激活卵裂率與100 μmol/L 2-APB 處理組無(wú)顯著差異，但顯著高于對(duì)照組和其他處理組，且囊胚率高于其他組（<0.05）。

表1 不同濃度2-APB 對(duì)孤雌激活早期胚胎發(fā)育的影響

2.3 2-APB 對(duì)卵母細(xì)胞GSH 和ROS 含量的影響 如圖2所示，IVM體系中添加10 μmol/L 2-APB 提高了胞質(zhì)內(nèi)GSH 含量，降低ROS 水平。經(jīng)統(tǒng)計(jì)GSH 和ROS熒光強(qiáng)度可知，卵母細(xì)胞成熟體系中添加10 μmol/L 2-APB 胞質(zhì)內(nèi)GSH 含量顯著高于對(duì)照組，ROS 含量顯著低于對(duì)照組（圖3）。

圖2 GSH 和ROS 熒光圖

圖3 添加10 μmol/L 2-APB 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞GSH 和ROS 含量的影響

3 討 論

本研究表明，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中添加10 μmol/L 2-APB 對(duì)核成熟、胞質(zhì)成熟及早期胚胎發(fā)育具有積極作用，這可能是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中暴露于20% 的高壓氧，造成細(xì)胞氧化性應(yīng)激，引起胞質(zhì)內(nèi)[ Ca]i 濃度異常升高；而通過(guò) 2-APB 抑制了卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)內(nèi)釋放Ca，并通過(guò)質(zhì)膜Ca通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)平衡，提高了卵母細(xì)胞體外成熟率和早期胚胎發(fā)育能力。

在多種細(xì)胞中，Ca作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信使對(duì)生物學(xué)信號(hào)作出應(yīng)答反應(yīng)。胞質(zhì)內(nèi)[Ca]i 濃度提高是一種生理信號(hào)，會(huì)引起許多重要的生理反應(yīng)，即Ca的第二信使作用，包括細(xì)胞增殖、分裂運(yùn)動(dòng)、分泌、形態(tài)發(fā)生、能量代謝、氧代謝、糖代謝等將可能發(fā)生異常。

細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的維持主要是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣通道發(fā)揮作用。在正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過(guò)RyRs 和 IP3Rs 將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的Ca釋放入胞質(zhì)，通過(guò)鈣泵從胞漿中攝取Ca入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而使胞質(zhì)內(nèi)[Ca]i 達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。研究報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡是許多外界因素引起細(xì)胞壞死的共同機(jī)制，胞內(nèi)[Ca]i 水平處于極為嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制中，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)[ Ca]i 變化時(shí)可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2-APB 是一種膜滲透性的物質(zhì)，對(duì)IP3 誘導(dǎo)的Ca釋放具有重要的調(diào)節(jié)作用。Sanson 等研究證實(shí)，2-APB 抑制了 IP3Rs 鈣通道敏感性，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca的釋放，從而降低由氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，阻止細(xì)胞凋亡。2-APB 對(duì)降低?；撬崮懰?-硫酸酯誘導(dǎo)的Ca釋放也具有顯著作用。此外，2-APB 對(duì)抑制吲哚美辛、順鉑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca釋放的作用機(jī)制一致，均降低了細(xì)胞內(nèi)Caspasе-3 和Caspasе-9 的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。盡管2-APB 的作用機(jī)制相同，但使用濃度大相徑庭，從5、50～100 μmol/L不等，這可能與作用的細(xì)胞類(lèi)型和作用時(shí)間相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟體系中添加10 μmol/L 2-APB 可有效阻斷鈣流量，阻止細(xì)胞免受應(yīng)激損傷；而濃度過(guò)低（≤1 μmol/L）或過(guò)高（≥100 μmol/L）可引起應(yīng)激性鈣失衡，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而降低卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中添加10 μmol/L 2-APB，卵母細(xì)胞體外核成熟、胞質(zhì)成熟及早期胚胎發(fā)育效果均顯著高于對(duì)照組，適量濃度的2-APB 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量具有積極促進(jìn)作用。