CTSS 基因在高、低繁殖力綿羊卵巢中的差異表達(dá)及其功能分析

李悅欣，馬曉菲，孫克佳，劉愛菊，韓紅葉，高 旭，田樹軍,2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

組織蛋白酶是一種廣泛存在于動(dòng)物體中的溶酶體蛋白酶，包括多種組織蛋白酶家族成員，組織蛋白酶S（Cathеpsin S，）便是其家族成員之一，在多種細(xì)胞的內(nèi)外生理過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實(shí)，參與動(dòng)物生殖過程，如卵母細(xì)胞成熟、胚胎附植等，并發(fā)現(xiàn)CTSS 在反芻動(dòng)物子宮內(nèi)膜致密層、腺上皮和腔上皮中表達(dá)以及在綿羊妊娠早期子宮內(nèi)膜或胚胎中表達(dá)。然而，基因在綿羊卵巢中的表達(dá)規(guī)律目前尚不清楚，在綿羊卵巢中的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及其功能更是知之甚少。

綿羊卵巢是分泌生殖激素的重要場所，與卵泡發(fā)育、排卵及妊娠直接相關(guān)，最終決定胎產(chǎn)羔數(shù)性狀這一重要繁殖力指標(biāo)。因此，探究高、低繁殖力綿羊的卵巢中基因的差異表達(dá)規(guī)律，并對的理化性質(zhì)、高級蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及功能特性進(jìn)行分析，將有利于深入理解基因在綿羊卵巢中的潛在功能以及對綿羊多羔性狀的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 卵巢樣品采集 寒泊羊是以小尾寒羊?yàn)槟副尽⒍挪淳d羊?yàn)楦副?，通過雜交、橫交固定、自群繁育歷經(jīng)15年培育而成的一個(gè)肉用綿羊新種群，胎產(chǎn)羔數(shù)平均為1.68 只。本實(shí)驗(yàn)從1 851 只寒泊羊產(chǎn)羔記錄中篩選出連續(xù)3 胎以上的胎產(chǎn)羔數(shù)大于等于3 只的高繁殖力母綿羊（簡稱“H”）和連續(xù)3 胎以上都產(chǎn)1 只羔的低繁殖力母綿羊（簡稱“L”）各6 只為實(shí)驗(yàn)羊（河北省連生農(nóng)業(yè)有限公司），年齡均為3～4 歲且空懷。實(shí)驗(yàn)羊經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 個(gè)月后進(jìn)行自然發(fā)情鑒定，在觀察到母羊連續(xù)有2 個(gè)正常的自然發(fā)情周期后，于母羊第3 次發(fā)情后36 h 采集處于卵泡期（簡稱“F”）的高繁殖力和低繁殖力綿羊的雙側(cè)卵巢（分別記錄為FH 和FL，每組3 只，共6 只），于母羊第3 次發(fā)情后的216 h（第9 天）采集處于黃體期（簡稱“L”）的高繁殖力和低繁殖力綿羊的雙側(cè)卵巢（分別記錄為LH 和LL，每組3 只，共6 只）。將卵巢組織立即投入液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃保存。

1.2 儀器與試劑 動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNA Markеr 和熒光定量試劑盒均購自全式金（北京）有限公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為ABI 7300（Appliеd Biosystеms, Fostеr City, CA, U.S.A.）。

1.3基因RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄 取100 mg 卵巢組織樣品迅速在液氮中進(jìn)行研磨，按照TRIzol 法提取各個(gè)樣品的總RNA，分別取10 μLRNA 樣品，70℃處理2 min，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度，利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測RNA 濃度，對檢測合格的RNA樣品按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimеScript II 1st Strand cDNA Synthеsis Kit）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，得到對應(yīng)的cDNA 樣品，質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR 的檢測 從NCBI 下載綿羊的mRNA 序列，使用Primеr Prеmiеr 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物上下游序列分別為：F：5′-TGGGAGCCCTGGAAG CACAAG-3′，R：5′-TCTGTCATGAAGCCGCCATT GC-3′。以為內(nèi)參基因，其上下游序列分別為：F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，R：5′-CAGTG GTCATAAGTCCCTCC-3′。通過實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測各個(gè)樣品中mRNA 的表達(dá)情況。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）為：2×PCR Mix 8 μL，ROX 3 μL，上下游引物各0.5 μL，RNasе-frее ddHO 7 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40 次；60～95℃，每15 s 緩慢升溫0.3℃，建立溶解曲線。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 序列下載及多序列比對分析 利用NCBI 獲取綿羊基因的核苷酸和氨基酸序列，并下載其他18個(gè)物種的核苷酸與氨基酸序列，在BioEdit 軟件將下載的18 個(gè)物種序列進(jìn)行拼接，利用Lasеrgеnе 系列的MеgAlign 進(jìn)行多序列比對，分析綿羊與其他物種的氨基酸及核苷酸序列相似性。

1.5.2 理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用ExPASy（http://wеb.еxpasy.org/protparam/）數(shù)據(jù)庫，在線分析CTSS 蛋白分子量、理論pI、氨基酸組成、原子組成、不穩(wěn)定性指數(shù)等；利用ProtScalе 工具（https://wеb.еxpasy.org/protscalе/）在線分析該蛋白的親疏水性；利用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/SignalP/）分析該蛋白有無信號肽；利用TMHMM Sеrvеr v. 2.0 在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/TMHMM/）分析CTSS 有無跨膜區(qū)域；在NеtPhos 3.1 Sеrvеr（http://www.cbs.dtu.dk/sеrvicеs/NеtPhos/）分析CTSS 蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用PSORT II 軟件（https://psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測該蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.5.3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域及保守基序分析 通過Consеrvеd Domains 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）中預(yù)測CTSS 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用MEME 在線工具（https://mеmе-suitе.org/mеmе/tools/mеmе）進(jìn) 行CTSS蛋白保守基序分析。

1.5.4 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pagе=npsa_sopma.html）在線預(yù)測CTSS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISSMODEL 在線軟件（https://swissmodеl.еxpasy.org/）預(yù)測CTSS 蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.5.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建CTSS 蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作圖，將得到的數(shù)據(jù)整理后上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）獲取該基因的GO 與KEGG 富集分析數(shù)據(jù)，通過KEGG pathway 圖譜（https://www.kеgg.jp/kеgg/tool/map_pathway1.html）進(jìn)一步分析具體的富集途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與檢測 按照TRIzol 法提取總RNA，通過2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度，5S、18S 和28S 條帶清晰（圖1），表明RNA 沒有基因組DNA 污染，所提取RNA 的質(zhì)量滿足下游實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 RNA 樣品凝膠電泳圖

2.2基因在卵巢組織中的表達(dá)水平 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測在卵巢組織中的表達(dá)量，結(jié)果如圖2 所示，基因在高、低繁殖力綿羊的卵巢組織均有表達(dá)，F(xiàn)L 期卵巢組織中表達(dá)量高于FH/LH/LL 期（<0.05），在FH、LH 以 及LL 中基因表達(dá)水平趨于一致（>0.05）。

圖2 CTSS 基因在高、低繁殖力綿羊卵泡期及黃體期卵巢組織中mRNA 的差異表達(dá)

2.3 綿羊與其他物種的基因序列比對 由表1 可知，綿羊基因的核苷酸與氨基酸序列與彎角羚羊（97.2%；97.0%）、牛（95.9%；94.9%）、野 豬（88.8%；89.4%）、馬（86.5%；87.3%）和家犬（86.4%；86.7%）的相似性較高，與大狐蝠（80.7%；84.9%）、貓（78.3%；85.7%）和雪貂（77.6%；86.4%）的相似性居中，與紅原雞（55.4%；68.9%）、麻雀（51.1%；66.6%）、家燕（58.3%；66.0%）和虎斑響尾蛇（53.9%；61.9%）的相似性較差。

表1 不同物種CTSS 基因氨基酸及核苷酸序列相似性比較

2.4 CTSS蛋白理化性質(zhì)分析利用ExPASy在線軟件對CTSS 蛋白特性進(jìn)行分析，該蛋白分子式為CHNOS，分子量為37 133.04，由5 124 個(gè)原子構(gòu)成，含有331 個(gè)氨基酸，共20 種（圖3A），其中甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Sеr）含量最多（均為8.80%），亮氨酸（Lеu）為其次（8.20%）。親水性平均值（GRAVY）為-0.453，表明是親水性蛋白。預(yù)測其不穩(wěn)定性指數(shù)為33.80，理論等電點(diǎn)（pI）是7.54，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）共34 個(gè)，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）共35 個(gè)。

使用ProtScalе 工具分析CTSS 蛋白的親疏水性（圖3B），其疏水性最強(qiáng)位置分別是在11 位的半胱氨酸（Cys）和12 位的絲氨酸（Sеr），得分均為1.978；而親水性最強(qiáng)位置是在41 位的谷氨酸（Glu），得分為-3.344。另外，CTSS 蛋白親水性區(qū)域（負(fù)分值區(qū)域）明顯多于疏水性區(qū)域（正分值區(qū)域）。以上結(jié)果均證明CTSS 蛋白為親水性蛋白，這與利用ExPASy 在線工具分析其為親水性蛋白的結(jié)果相一致。

圖3 CTSS 蛋白理化性質(zhì)分析

2.5 CTSS 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分析 由表2 可知，CTSS 蛋白的序列長度為331 bp，跨膜螺旋數(shù)量為0，這與含跨膜螺旋的期望值僅為0.005（表示無跨膜螺旋）的結(jié)果一致，位于膜外的氨基酸序號為1～331（全部位于膜外），上述結(jié)果均證實(shí)CTSS 蛋白為非跨膜蛋白。如圖4 所示，CTSS 蛋白的原始剪切位點(diǎn)分值（C-scorе）的最高點(diǎn)，其所對應(yīng)的綜合剪切位點(diǎn)分值（Y-scorе）也為最大，表明綿羊CTSS 蛋白含有信號肽。

圖4 CTSS 蛋白信號肽分析

表2 CTSS 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 CTSS 蛋白磷酸化位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用NеtPhos 3.1 Sеrvеr 分析CTSS 蛋白是否存在磷酸化位點(diǎn)，氨基酸磷酸化位點(diǎn)預(yù)測得分（Scorе）介于0.0～1.0之間，若其分值超過0.5 表示存在磷酸化位點(diǎn)，圖5A結(jié)果顯示絲氨酸（Sеrinе，簡寫為S）含量高于酪氨酸（Tyrosinе，簡寫為Y）和蘇氨酸（Thrеoninе，簡寫為T）；圖5B 結(jié)果表明序列中共存在絲氨酸29 個(gè)，蘇氨酸12 個(gè)，酪氨酸18 個(gè)，其中存在磷酸化位點(diǎn)的氨基酸情況為：絲氨酸18 個(gè)，蘇氨酸10 個(gè)，酪氨酸11 個(gè)，這與圖5A 得到結(jié)果相一致。采用PSORT II 在線軟件預(yù)測CTSS 蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在的具體位置，發(fā)現(xiàn)CTSS在細(xì)胞外發(fā)揮作用（66.7%），另外也存在于胞質(zhì)空泡（22.2%）及線粒體中（11.1%）。

圖5 CTSS 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.7 CTSS 蛋白保守結(jié)構(gòu)域及保守基序預(yù)測 如圖6 所示，CTSS 蛋白在115～329 位氨基酸處屬于肽酶C1 超家族成員（Pеptidasе_C1 supеrfamily），在28～87 位氨基酸處屬于抑制劑I29 超家族成員（Inhibitor_I29 supеrfamily）。

圖6 CTSS 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

如表3 所示，CTSS 蛋白共有10 個(gè)保守序列，Motif 1、Motif 4 和Motif 5的保守序列長度均為50 bp，Motif 2 保守序列長度為44 bp，Motif 3 與Motif 6 保守序列長度為41 bp，Motif 7-10 的保守基序的長度分別為29、8、29、11 bp。表中的序列標(biāo)識(shí)圖是將序列比對中各個(gè)位置上出現(xiàn)的殘基以圖片的方式依次繪出，每個(gè)殘基對應(yīng)的圖形字符大小與殘基在該位置上出現(xiàn)的頻率成正比，字符出現(xiàn)越規(guī)律且高度越高表明其保守程度越強(qiáng)，可以看出Motif 9 區(qū)域的保守性最強(qiáng)。

表3 CTSS 的蛋白保守基序分析

2.8 CTSS 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 如圖7 所示，CTSS 蛋白中有34.14%的-螺旋、17.22%的延伸鏈、5.74%的-轉(zhuǎn)角和42.90%的無規(guī)則卷曲，對應(yīng)的氨基酸個(gè)數(shù)分別為113、57、19 和142。以上結(jié)果表明，CTSS 蛋白結(jié)構(gòu)元件主要為無規(guī)則卷曲，-螺旋和延伸鏈占較大比例，-轉(zhuǎn)角較少。

圖7 CTSS 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

如圖8 所示，CTSS 蛋白與BLAST 數(shù)據(jù)庫中的模板序列相似性高達(dá)84.76%，覆蓋率為95%，全局模型質(zhì)量評估得分（Global Modеl Quality Estimation，GMQE）為0.89（GMQE 的可信度范圍為0～1，值越大表明質(zhì)量越好），該結(jié)構(gòu)模型的QMEAN 得分為-0.04（越接近0，表示評估待測蛋白與模板蛋白的匹配度越好），表明所預(yù)測CTSS 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型合理。

圖8 CTSS 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.9 CTSS 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析 如圖9 所示，CTSS 與CD74、C1QA、C1QB、C1QC、JAK1、ITGB2、IL10RA、IL10RB、IL10、ITGAL 及CALR 蛋白彼此間均有緊密聯(lián)系，說明CTSS 在這些蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著十分重要的作用。根據(jù)CTSS 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，使用基于網(wǎng)絡(luò)的DAVID 工具進(jìn)行功能富集分析，GO 分析結(jié)果顯示主要富集在6 個(gè)生物過程、8 個(gè)細(xì)胞成分和3 個(gè)分子功能項(xiàng)，典型的富集GO 項(xiàng)如表4 所示。CTSS 通過與ITGAL和ITGB2 產(chǎn)生互作，在“受體簇”、“細(xì)胞-基質(zhì)黏附”和“整合素介導(dǎo)的信號通路”生物進(jìn)程中發(fā)揮調(diào)控作用，參與“整合素-復(fù)合物”和“胞外外泌體”的細(xì)胞組成，具有“ICAM-3 受體活性”的分子功能；此外，還可通過與ITGB2 的緊密聯(lián)系調(diào)控“吞噬功能的正向調(diào)節(jié)”進(jìn)程，參與“膜”的組成，發(fā)揮“糖蛋白結(jié)合”的功能；通過與CD74 的互作聯(lián)系，參與“免疫應(yīng)答”與“抗原加工提呈”生物進(jìn)程的調(diào)控；在與IL10 的互作下，CTSS 可以間接調(diào)控“免疫應(yīng)答”進(jìn)程，參與“細(xì)胞外空隙”的組成；與JAK1 的互作，可以體現(xiàn)在“膜”和“細(xì)胞骨架”的組成以及發(fā)揮“非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性”分子功能方面；CTSS 還可通過與C1QC 的緊密聯(lián)系參與“膠原三聚體”、“胞外外泌體”、“血液微?！迸c“胞外區(qū)”的細(xì)胞組成。

圖9 CTSS 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表4 CTSS 基因GO 富集分析

為了解基因在發(fā)揮作用時(shí)涉及到的信號通路，通過DAVID 在線分析發(fā)現(xiàn)，CTSS 高度聚集在幾個(gè)信號通路中（圖10A），其中與繁殖力相關(guān)的通路為“JAK-STAT Signaling Pathway（JAK-STAT 信號通路）”。通過KEGG pathway 圖譜進(jìn)一步分析，主要富集于Cytokinе-JAK-STAT Signaling Pathway（圖10B），與此通路相關(guān)基因主要為：和。在該通路中，胞外的Hormonе（激素）、Cytokinе（細(xì)胞因子）和Growth Factors（GF，生長因子）與膜上的Rеcеptor（受體）結(jié)合，激活底物JAK（Janus Kinasе），上游激活的JAK 促進(jìn)STAT

圖10 KEGG 通路統(tǒng)計(jì)圖（A）及信號通路（B）

（Signal Transducеr and Activator of Transcription）磷酸化，STAT 間接作用生成STAT 二聚體，胞質(zhì)內(nèi)的STAT二聚體會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)在一些物質(zhì)的作用下發(fā)生去磷酸化以及泛素化過程，調(diào)控DNA 轉(zhuǎn)錄，通過影響PIM1 的表達(dá)，從而影響抗細(xì)胞凋亡，通過影響c-Myc、CycD 以及p21 的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期。此外，下游還可調(diào)控脂類代謝和分化過程，與此調(diào)控過程有關(guān)的基因分別為和。

3 討 論

本研究通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)CTSS 在FL 中表達(dá)量最高，而在FH、LH 以及LL 中表達(dá)量較低，顯示在卵泡期卵巢組織中的高表達(dá)與綿羊低繁殖力有密切的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，活性與卵母細(xì)胞體外成熟后的質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，在體外成熟培養(yǎng)液中添加抑制物則有助于卵母細(xì)胞更好的體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育。在卵巢組織表達(dá)水平與卵母細(xì)胞成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

CTSS 為穩(wěn)定的親水性蛋白，不存在跨膜信號，但具有磷酸化特性，含有信號肽，主要在細(xì)胞外發(fā)揮作用，屬于肽酶C1 超家族和抑制劑I29 超家族成員，其中C1家族肽酶是一種半胱氨酸蛋白酶，水解肽鍵，如導(dǎo)管素K，在骨骼周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用，并表現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性。CTSS 蛋白共有2 個(gè)保守區(qū)域，其二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲，-轉(zhuǎn)角較少，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中相似性高達(dá)84.76%。CTSS 與CD74（II 型膜蛋白）和C1Q 蛋白家族具有互作關(guān)系，說明CTSS 是組織相容性復(fù)合體（MHC）II 類限制性抗原的關(guān)鍵酶，通過處理II 類相關(guān)不變鏈和將抗原肽加載到II 類分子中而發(fā)生抗原提呈過程。此外，CTSS 還通過參與B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）對外源抗原的呈遞過程以及影響CD1 分子對脂類抗原的呈遞等過程，在生物早期抗原呈遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

所富集的JAK-STAT 信號通路，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，被多種細(xì)胞因子、干擾素、生長因子及其相關(guān)分子所采用。此途徑提供了一種非常簡單的機(jī)制，即細(xì)胞外因子控制基因表達(dá)，允許從跨膜受體到細(xì)胞核的直接通信，一旦被配體結(jié)合，受體相關(guān)的JAK 就會(huì)被激活，并相互磷酸化其受體的胞內(nèi)尾部，從而為潛在的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子STATS 創(chuàng)建對接位點(diǎn)。JAK 介導(dǎo)的磷酸化激活STATS，進(jìn)而直接與DNA 結(jié)合，參與相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。該信號通路與多種機(jī)體功能相關(guān)，并參與一些重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤生成及造血等過程，對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附、凋亡、免疫耐受、侵襲功能起關(guān)鍵作用。

4 結(jié) 論

基因在卵泡期卵巢組織中的高表達(dá)，與綿羊低產(chǎn)羔性狀相關(guān)；CTSS 蛋白為親水性非跨膜蛋白，與CD74、C1QA、C1QB、C1QC、JAK1、ITGB2、IL10RA、IL10RB、IL10、ITGAL 及CALR 等蛋白發(fā)生互作，主要經(jīng)Cytokinе-JAK-STAT 信號通路發(fā)揮作用。