禽致病性大腸桿菌hcp2a基因?qū)﹄r雞脾臟細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的影響

何琪　孫晨晨　侯曼曼　肖福泉　龔柳菲　黃燕　段少儀　祁克宗　宋祥軍

摘要： 探究禽致病性大腸桿菌（APEC）hcp2a基因缺失對雛雞脾臟轉(zhuǎn)錄組的影響，為深入研究禽致病性大腸桿菌的致病機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。將7日齡雛雞隨機(jī)分成2組，用APEC野生株（AE17）及其hcp2a基因缺失株（AE17△hcp2a）分別感染雛雞，采集脾臟組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序篩選hcp2a基因缺失株感染后的差異表達(dá)基因，利用實(shí)時熒光定量PCR方法對測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG分析。AE17和AE17△hcp2a均能引起雛雞脾臟的病理變化，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AE17△hcp2a感染雛雞脾臟中篩選到512個差異表達(dá)基因，其中221個基因上調(diào)表達(dá)，291個基因下調(diào)表達(dá)。選擇部分差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證，差異表達(dá)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢與測序結(jié)果一致。GO分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因富集在生物膜、生物膜的組成成分、氧化還原過程、免疫反應(yīng)、水解酶活性等條目。KEGG分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、細(xì)胞粘附分子（CAMs）通路等。禽致病性大腸桿菌hcp2a基因缺失后感染雛雞，會影響其脾臟mRNA表達(dá)譜，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路等。

關(guān)鍵詞： 禽致病性大腸桿菌;hcp2a基因;脾臟;雛雞;細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路

中圖分類號： S831 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0151-06

Abstract： In order to explore the role of hcp2a gene in the process of avian pathogenic Escherichia coli （APEC） infection， the spleen transcriptome of chicken infected with hcp2a-delected APEC was analyzed. Seven-day-old chickens were divided into two groups randomly， which were infected with APEC wild strain （AE17） and hcp2a-delected strain （AE17△hcp2a） by intramuscular injection. Then infected spleen tissues were collected for hematoxylin-eosin （HE） sections. Differentially expressed genes infected by AE17△hcp2a were screened by transcriptome sequencing. The sequencing results were verified by real-time fluorescent quantitative PCR， and the differentially expressed genes were analyzed by Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）. Splenic lesions caused by AE17 and the AE17△hcp2a were observed. The results of transcriptome sequencing indicated that 512 differentially expressed genes were screened from the spleens of chicks infected with AE17△hcp2a， and 221 genes were up-regulated and 291 genes were down-regulated. Some differentially expressed genes were selected for real-time fluorescent quantitative PCR verification， and the variation trend was consistent with the sequencing results. The results of GO analysis showed that the differentially expressed genes were enriched in biofilm and membrane components， oxidation-reduction process， immune response and hydrolase activity. The results of KEGG analysis indicated that the differentially expressed genes were enriched in the cytokine-cytokine receptor interaction pathway and cell adhesion molecules （CAMs） pathway. The mRNA expression profile in spleen of chicken infected with AE17△hcp2a is affected， and the differentially expressed genes are mainly enriched in the cytokine-cytokine receptor interaction pathway.

Key words： avian pathogenic Escherichia coli;hcp2a gene;spleen;chick;cytokine-cytokine receptor interaction pathway

VI型分泌系統(tǒng)（T6SS）是一種存在于革蘭氏陰性菌中的新型蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，在細(xì)菌侵入宿主感染機(jī)體的過程中發(fā)揮重要作用，其整體結(jié)構(gòu)是由13種核心結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（TssA-M）[1]組成的收縮裝置，由跨膜復(fù)合體、底板復(fù)合體、尾刺3部分構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)促使其通過類似于注射器的方式首先穿過宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，然后將分泌的效應(yīng)因子注入宿主細(xì)胞內(nèi)[2-4]。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）是T6SS核心組分之一，以六聚體的形式形成尾刺內(nèi)管，是重要的通道蛋白[3]，可以作為結(jié)構(gòu)蛋白將效應(yīng)因子注入靶細(xì)胞，也可以作為效應(yīng)蛋白在禽致病性大腸桿菌（APEC）的致病過程中發(fā)揮作用[5-6]。

禽致病性大腸桿菌是一種禽腸道外致病性大腸桿菌，是革蘭氏陰性菌，通過先感染呼吸道再侵入其他組織和器官的方式感染禽類，臨床上還會出現(xiàn)敗血癥、心包炎和輸卵管炎等反應(yīng)[7-9]。禽類沒有發(fā)育良好的淋巴管和淋巴結(jié)，并且胸腺在禽類成熟后會逐漸退化失去免疫作用，所以脾臟是家禽最重要的外周免疫器官[10]。脾臟能在識別病原體后立即誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，脾臟的淋巴細(xì)胞排列緊密，還存在較多的巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以清除血液中的異物、抗原、病菌以及衰老損傷的細(xì)胞[11]。

T6SS效應(yīng)蛋白Hcp2a在APEC感染雛雞脾臟過程中具體發(fā)揮的作用尚不清楚，本研究擬利用禽致病性大腸桿菌hcp2a基因缺失株感染雛雞，觀察其脾臟病變，篩選脾臟中差異表達(dá)的mRNA，確定感染雛雞脾臟在轉(zhuǎn)錄水平的變化，以期為后續(xù)禽致病性大腸桿菌致病過程的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株包括禽致病性大腸桿菌野生株（AE17）及其hcp2a基因缺失株（AE17△hcp2a），均由本實(shí)驗(yàn)室保存。1日齡羅曼雛雞購自安徽省安禽禽業(yè)有限公司。

1.2 感染雛雞

AE17和AE17△hcp2a均在37 ℃下過夜培養(yǎng)，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0，采用無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3遍后調(diào)整菌落含量為1×106CFU/ml。讓購入的1日齡雛雞自由飲水和采食（飼料中不添加抗生素），飼養(yǎng)至7日齡后選擇精神狀況良好的雛雞隨機(jī)分為2組，每組8只，其中1組雛雞通過大腿肌肉注射1 ml處理好的菌液。

1.3 病理組織切片

將采集的脾臟組織置于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定，然后取出沖洗，采用不同體積濃度乙醇脫水，脫水后經(jīng)二甲苯透明后浸蠟，再將其包埋于石蠟中，待凝固后依次進(jìn)行切片、貼片和烤片，完成后經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色、脫水、透明和封片，得到感染禽致病性大腸桿菌的雛雞脾臟組織HE切片。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序

1.4.1 組織樣品準(zhǔn)備和比對 取感染AE17及AE17△hcp2a的雛雞脾臟，置于液氮中速凍，然后于-80 ℃下保存，樣品寄送杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司，采用Illumina HiSeq 4000[因美納（中國）科學(xué)器材有限公司產(chǎn)品]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)利用Cutadapt軟件過濾掉帶接頭（Adaptor）、低質(zhì)量和含無法確定信息的堿基，對有效測序量、Q20值（質(zhì)量大于20的堿基占總被測堿基的比值）、Q30值（質(zhì)量大于30的堿基占總被測堿基的比值）、G+C含量[基因中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的總量在雙股DNA 4種堿基中的占比]進(jìn)行綜合測評，得到有效數(shù)據(jù)，與參考基因進(jìn)行對比。

1.4.2 差異表達(dá)基因的篩選 利用EdgeR軟件分析雛雞脾臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測序結(jié)果，在獲得高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，以P≤0.05且|log2 Fold_Change|≥1為條件，篩選出差異表達(dá)基因。

1.4.3 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證 提取感染禽致病性大腸桿菌的雛雞脾臟RNA，參考Takashi等[12]的研究方法提取IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因，對提取的基因使用型號為Step one plus的熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品）進(jìn)行測定，以β-actin為內(nèi)參基因，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，所用引物信息詳見表1。

1.4.4 差異表達(dá)基因的GO、KEGG富集分析 根據(jù)GO、KEGG數(shù)據(jù)庫中各個條目映射的差異表達(dá)基因數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)，對比基因組，篩選出差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目和KEGG條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 APEC感染雛雞脾臟組織病理學(xué)觀察

取APEC感染雛雞的脾臟組織切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)AE17和AE17△hcp2a均可引起雛雞脾臟水腫、充血（圖1）。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

對轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示，與AE17感染雛雞相比，AE17△hcp2a感染雛雞的脾臟中共篩選到512個差異表達(dá)基因，其中221個基因上調(diào)表達(dá)，291個基因下調(diào)表達(dá)。

2.3 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證測序結(jié)果

利用實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證IL-22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因的mRNA水平，結(jié)果（圖3）顯示，與AE17感染雛雞脾臟相比，AE17△hcp2a感染雛雞脾臟中IL-22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因的mRNA轉(zhuǎn)錄均為下調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序結(jié)果一致。

2.4 GO富集結(jié)果

對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，GO富集結(jié)果顯示，AE17△hcp2a感染雛雞脾臟差異表達(dá)基因富集在生物膜、生物膜的組成成分、氧化還原過程、免疫反應(yīng)、水解酶活性等條目，主要富集的GO通路和相應(yīng)通路富集的差異表達(dá)基因數(shù)量如表2顯示。

2.5 KEGG通路分析

差異表達(dá)基因KEGG富集結(jié)果（圖4）顯示，有279個差異表達(dá)基因富集于107個條目。AE17△hcp2a感染雛雞脾臟的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、細(xì)胞粘附分子（CAMs）通路等。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路富集了13個差異表達(dá)基因，上調(diào)表達(dá)的有4個，下調(diào)表達(dá)的有9個（表3）。

3 討論

禽致病性大腸桿菌的主要感染途徑為呼吸道感染，進(jìn)而演變成嚴(yán)重的敗血癥，并在脾臟、肺、肝臟等多個內(nèi)臟器官內(nèi)定植[13-14]。脾臟是禽類重要的淋巴器官，能在識別病原體后立即誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在禽類全身性免疫反應(yīng)中起重要作用[15]。因此本研究以雛雞脾臟為研究對象，采用AE17和AE17△hcp2a感染雛雞，觀察其脾臟的病理變化，發(fā)現(xiàn)禽致病性大腸桿菌野生株及其hcp2a基因缺失株均能引起雛雞脾臟病變，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析脾臟基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)禽致病性大腸桿菌hcp2a基因缺失株感染雛雞后會影響脾臟mRNA表達(dá)譜。

對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，KEGG富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、細(xì)胞粘附分子通路等，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路富集了13個差異表達(dá)基因，上調(diào)表達(dá)的有4個，下調(diào)表達(dá)的有9個。通過實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)IL-22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測序結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測序結(jié)果是可信的。細(xì)胞粘附分子通路介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，在免疫細(xì)胞受到抗原刺激時作為輔助受體傳遞輔助活化信號，使免疫細(xì)胞活化，還在白細(xì)胞粘附過程、炎癥發(fā)生過程和淋巴細(xì)胞定向移動過程中發(fā)揮作用[16]。

細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路在天然免疫和獲得性免疫中均具有重要意義[17-18]，在細(xì)菌感染宿主的炎癥過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。細(xì)胞因子是一類小分子蛋白質(zhì)，細(xì)胞受到刺激時分泌細(xì)胞因子，與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子根據(jù)其生物學(xué)功能可分為白細(xì)胞介素、干擾素、趨化因子等，它們與細(xì)胞因子受體結(jié)合發(fā)揮作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路中有4個基因上調(diào)表達(dá)。CX3CL1作為一種趨化因子，有誘導(dǎo)白細(xì)胞向炎癥組織游走、抑制炎癥等功能[20];9個基因下調(diào)表達(dá)，其中IL-6、IL-22、IL1R2均屬于白細(xì)胞介素家庭成員，白細(xì)胞介素是一類淋巴因子，在免疫過程中可以傳遞信息，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞工作。IL-6為促炎因子，在發(fā)生感染或組織損傷時可發(fā)出從局部到全身的炎癥信號，以便于宿主防御[21]，也可以促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖分化，在炎癥急性期發(fā)揮重要作用[22]。IL-22在黏膜表面的抗菌防御以及組織修復(fù)中發(fā)揮功能，同時具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用，與多種免疫疾病密切相關(guān)[23-25]。綜上所述，禽致病性大腸桿菌hcp2a基因缺失株可以通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫過程。

本研究初步討論了hcp2a基因缺失對APEC感染雛雞脾臟轉(zhuǎn)錄組的影響，AE17△hcp2a感染雛雞后影響雛雞脾臟的mRNA表達(dá)譜，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路。

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（責(zé)任編輯：王 妮）

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