動(dòng)物疫病熒光PCR檢測(cè)中假陽性的原因分析與控制

張梅，高軍軍，康文彪

（甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)特異性強(qiáng)，可以從低微含量樣本中擴(kuò)增病原特異性核酸片段，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的精準(zhǔn)檢測(cè)[1-2]，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物病原學(xué)檢測(cè)，是目前獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)工作中必不可少的檢測(cè)手段。假陽性是指原本的陰性樣品被檢測(cè)為陽性結(jié)果[3]。隨著動(dòng)物病原學(xué)檢測(cè)量的不斷增多，加之熒光PCR敏感度高，試驗(yàn)人員為快速完成檢測(cè)任務(wù)易忽視檢測(cè)中關(guān)鍵步驟的細(xì)節(jié)問題，以致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對(duì)疫情準(zhǔn)確診斷造成了困擾。本文通過分析動(dòng)物疫病熒光PCR檢測(cè)中可能形成假陽性的原因，并提出控制措施，以期為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)工作提供參考。

1 動(dòng)物疫病熒光PCR檢測(cè)中假陽性的原因分析

造成假陽性的原因主要是樣品、試劑、環(huán)境、儀器等被污染。

1.1 樣品間交叉污染

放置樣本時(shí)由于離心管質(zhì)量問題或密封不嚴(yán)，容器外粘有樣品導(dǎo)致樣品間相互污染；核酸污染物通過氣流或?qū)嶒?yàn)人員流動(dòng)污染實(shí)驗(yàn)室局部環(huán)境、離心機(jī)、槍頭等導(dǎo)致檢測(cè)樣品間相互污染；加核酸模板時(shí)未及時(shí)更換槍頭導(dǎo)致相鄰樣品相互污染等。

1.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染是動(dòng)物疫病熒光PCR試驗(yàn)中常見的污染問題，因熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物拷貝基數(shù)大，呈指數(shù)倍增長(zhǎng)[3]，極微量的污染就會(huì)造成分析結(jié)果中單一通道的翹尾現(xiàn)象，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)大量的假陽性結(jié)果。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑污染

在熒光PCR反應(yīng)體系配制過程中，由于實(shí)驗(yàn)室局部環(huán)境、移液器、耗材、反應(yīng)體系已被氣溶膠或陽性對(duì)照污染，或在DNA或RNA提取過程中使用已經(jīng)被污染的提取試劑，會(huì)出現(xiàn)樣品孔大面積陽性的結(jié)果，這也是導(dǎo)致假陽性的原因之一[4]。此外，有的廠家生產(chǎn)的不同批次的熒光PCR反應(yīng)體系試劑檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性低，也會(huì)造成假陽性結(jié)果。

1.4 氣溶膠污染

PCR實(shí)驗(yàn)室一半以上的污染來自氣溶膠，氣溶膠在流通的空氣中擴(kuò)散，導(dǎo)致室內(nèi)環(huán)境、儀器被污染，造成假陽性結(jié)果。加樣過程中移液器加樣力度太大，或加完樣往廢液缸中打廢棄槍頭的速度太快產(chǎn)生反沖，導(dǎo)致氣泡和樣品液進(jìn)入移液器頭部套筒，對(duì)活塞密封圈造成損傷，同時(shí)帶入的氣霧造成氣溶膠污染[5]；樣品開蓋前未離心或顛倒混勻時(shí)用力過猛形成氣溶膠，導(dǎo)致操作環(huán)境被污染。

1.5 陽性質(zhì)控品污染

目前獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用成熟的商品化熒光PCR試劑盒，商品化試劑盒陽性質(zhì)控品多為克隆質(zhì)粒，如非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒、口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，質(zhì)粒生長(zhǎng)繁殖快、生命力頑強(qiáng)，極易造成污染[5]，在操作不規(guī)范的情況下質(zhì)粒外溢致使假陽性概率增大。

1.6 試驗(yàn)操作者的污染

檢測(cè)過程中檢測(cè)任務(wù)量大，由于過于追求檢測(cè)效率而沒有注意操作細(xì)節(jié)，不規(guī)范操作容易造成氣溶膠或擴(kuò)增產(chǎn)物污染。同時(shí)，試驗(yàn)操作者的實(shí)驗(yàn)服、工作鞋及未經(jīng)消毒的物料外包裝等攜帶的核酸片段也會(huì)造成PCR污染[6]。

2 動(dòng)物疫病熒光PCR檢測(cè)中假陽性控制措施

2.1 規(guī)范采集和運(yùn)輸樣品

嚴(yán)格遵守樣品采集操作規(guī)范，確保采集樣品的容器（離心管、采血管、OP液管等）密封嚴(yán)密、運(yùn)輸過程中不發(fā)生交叉污染。所采集的樣品容器管口用封口膜密封處理，送入二級(jí)生物安全柜內(nèi)無菌取樣處理，每份樣品分裝成兩份，一份檢測(cè)，一份留樣（目的是確保樣品可溯源、試驗(yàn)結(jié)果有誤差時(shí)用于復(fù)核）。留樣樣品檢測(cè)完密封包裝，表面用有效消毒劑噴灑消毒后，保存于-20 ℃專用冰柜。運(yùn)輸樣品需要三層包裝和專業(yè)包裝箱，以防止發(fā)生生物安全事故，最外層包裝設(shè)置向上箭頭標(biāo)志；路途較遠(yuǎn)時(shí)需全程冷鏈運(yùn)輸或航空運(yùn)輸。

2.2 加強(qiáng)儀器設(shè)備操作管理

使用儀器時(shí)嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行，定期對(duì)精密儀器等進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)。如定期維護(hù)移液器精確度、離心機(jī)轉(zhuǎn)速、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的溫控模板和性能穩(wěn)定性；定期更換生物安全柜的過濾器和空調(diào)過濾網(wǎng)。嚴(yán)禁儀器在各功能區(qū)混用，尤其是配液區(qū)的移液器不能與其他區(qū)混用。推薦使用全自動(dòng)核酸提取儀[7]，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和封閉式操作，避免人員反復(fù)開蓋加入或倒出試劑的過程中導(dǎo)致氣溶膠污染，減少核酸抽提過程中的假陽性發(fā)生率。試驗(yàn)完成后做好熒光PCR儀、金屬浴、生物安全柜、混勻振蕩器等儀器使用情況及運(yùn)行狀況的記錄。儀器校準(zhǔn)維修后做好校準(zhǔn)、維護(hù)保養(yǎng)及驗(yàn)收記錄，確保相關(guān)記錄可追溯。

2.3 健全試劑、耗材管理制度

采購國(guó)家批準(zhǔn)廠家生產(chǎn)的特異性高、穩(wěn)定性好的熒光PCR試劑盒[8]，禁止使用過期或質(zhì)量不合格的試劑。每一批次的試劑均須加陽性質(zhì)控品或進(jìn)行盲樣驗(yàn)證，合格后可正常進(jìn)行PCR試驗(yàn)。所有熒光PCR反應(yīng)體系的分裝應(yīng)在配液區(qū)進(jìn)行，試劑盒中的陽性對(duì)照及陽性質(zhì)控品應(yīng)保存在樣品制備區(qū)的冰箱[9]。及時(shí)清理配液區(qū)、樣品制備區(qū)和擴(kuò)增分析區(qū)所有長(zhǎng)時(shí)間暴露的試劑、耗材，做好試劑、耗材出入庫和使用記錄，及時(shí)對(duì)采購的試劑、耗材進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證，不斷完善試劑、耗材管理制度。

2.4 加強(qiáng)對(duì)試驗(yàn)人員的技術(shù)培訓(xùn)和管理

新員工開展檢測(cè)前對(duì)其進(jìn)行PCR試驗(yàn)檢測(cè)操作規(guī)程、試驗(yàn)原理、質(zhì)量體系、生物安全管理等方面的培訓(xùn)，并通過理論考試、內(nèi)部人員比對(duì)試驗(yàn)、盲樣比對(duì)等方式進(jìn)行考核。所有試驗(yàn)人員需經(jīng)檢測(cè)能力驗(yàn)證、儀器規(guī)范操作等培訓(xùn)后持崗上證，并每年對(duì)試驗(yàn)人員進(jìn)行盲樣考核[10]。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量負(fù)責(zé)人要加強(qiáng)對(duì)檢測(cè)人員的監(jiān)督，實(shí)行責(zé)任制。檢測(cè)人員要嚴(yán)格按照檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)，從配液區(qū)到擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)須單向流動(dòng)，注意容易發(fā)生污染的每一個(gè)細(xì)節(jié)。每次的PCR檢測(cè)需設(shè)立陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照；已加入核酸模板的PCR反應(yīng)管禁止再次打開管蓋，避免樣本間的交叉污染；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的物品及工作服禁止帶出，避免擴(kuò)增產(chǎn)物污染；樣品使用前需先離心，再輕柔開蓋，防止液體濺出造成污染；提取核酸的關(guān)鍵步驟要及時(shí)更換一次性手套；樣品核酸模板的加樣順序依次為陰性對(duì)照、檢測(cè)樣品、陽性對(duì)照；設(shè)計(jì)好試驗(yàn)對(duì)照，便于分析假陽性結(jié)果[11]。

2.5 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境管理

2.5.1 合理設(shè)計(jì)各工作區(qū)域 PCR實(shí)驗(yàn)室至少有3個(gè)工作區(qū)，各工作區(qū)按照單方向進(jìn)行PCR檢測(cè)，即配液區(qū)→樣品制備區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行[6]。各工作區(qū)域內(nèi)的儀器、物品不得交叉使用[12]，各區(qū)域的儀器設(shè)備（移液器、生物安全柜、高速離心機(jī)等）和物品（96孔板、工作服、抹布、生物安全垃圾桶等）用防水標(biāo)簽標(biāo)記清楚，以便于鑒別。廢棄物臨時(shí)貯存室應(yīng)遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室。

2.5.2 規(guī)范開展日常消毒 每次試驗(yàn)前打開空調(diào)系統(tǒng)，對(duì)工作臺(tái)面、地面進(jìn)行清潔，并用2.3%有效氯消毒劑擦拭消毒；對(duì)生物安全柜的內(nèi)表面和移液器的頭部用75%酒精和2.3%有效氯消毒劑擦拭消毒。但含氯消毒劑具有腐蝕性，消毒完成后需用純水再次擦拭。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)廢液缸里的廢棄物進(jìn)行高壓滅菌處理，并將廢液缸用84消毒液浸泡消毒；移出生物安全柜內(nèi)的所有耗材和剩余試劑樣品，將生物安全柜臺(tái)面、移液器頭部、離心機(jī)等先用75%酒精擦拭2遍，再用核酸清除劑擦拭消毒2遍，工作臺(tái)面和地面用2.3%有效氯消毒劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）擦拭至少5 min（各工作區(qū)消毒器具不可混用）；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用5%有效氯消毒劑浸泡12 h以上；96孔板、試管架等可重復(fù)使用的物品用5%有效氯消毒劑浸泡消毒12 h；消毒完成后打開安全柜，用移動(dòng)紫外燈照射1 h。此外，要定期對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行徹底清掃消毒，并對(duì)生物安全柜用3%過氧化氫熏蒸消毒4 h以上。

2.5.3 加強(qiáng)通風(fēng) 氣溶膠是PCR實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生污染的原因之一，每隔一定時(shí)間須更換空調(diào)過濾網(wǎng)，并定期打開空調(diào)系統(tǒng)進(jìn)行通風(fēng)換氣，降低氣溶膠造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)語

動(dòng)物疫病熒光PCR檢測(cè)中出現(xiàn)大量陽性結(jié)果時(shí)，應(yīng)懷疑是否為PCR實(shí)驗(yàn)室污染，并通過人員比對(duì)、試劑比對(duì)、盲樣比對(duì)查找原因，若為PCR實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)須采取科學(xué)的控制措施，并重新采樣，更換實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。假陽性會(huì)造成疫情誤判，診斷某種動(dòng)物疾病時(shí)，須結(jié)合臨床癥狀和國(guó)家制定的確診標(biāo)準(zhǔn)[13]。此外，要加強(qiáng)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室的日常管理，規(guī)范檢驗(yàn)人員的操作，做好PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控，及時(shí)規(guī)范處置危險(xiǎn)廢棄物（廢棄試劑、耗材、樣品、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、防護(hù)用品等），確保熒光PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。