miR-33參與動脈粥樣硬化的調(diào)控靶點分析及中藥干預研究?

張 瑋，董縉蕓，李雯雯，王新杰，吳建萍

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，鄭州 450052)

目前，心腦血管疾病仍嚴重威脅著人類的健康。動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種常見的動脈硬化性血管疾病，通常以血管內(nèi)皮損傷為始點，伴隨著炎癥、免疫反應以及脂質(zhì)浸潤等多過程[1]。微小RNA(microRNA, miRNA)是高度保守的小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3'UTR非翻譯區(qū)互補配對參與基因表達的調(diào)控，參與多種系統(tǒng)的生理病理過程，包括腫瘤、心腦血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌等[3，4]。研究顯示，miR-33在調(diào)節(jié)平滑肌細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞等方面發(fā)揮著重要作用，調(diào)控AS發(fā)生發(fā)展的各個階段。因此，miR-33可能成為AS的診斷、鑒別診斷、危險分層及預后判斷的新型生物標志物。大量中醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)，miR-33與AS的脾虛痰濁證、氣虛血瘀證等證型密切聯(lián)系，中藥復方或單體可通過抑制miR-33改善炎癥和脂質(zhì)代謝起到防治AS的作用。本文就miR-33調(diào)控AS的相關(guān)靶點及中藥調(diào)控miR-33防治AS的研究進行分析，為進一步研究miR-33提供理論依據(jù)，也為AS的診斷和中藥治療尋找新的靶點。

1 miR-33調(diào)控AS的作用機制

1.1 miR-33與炎癥

炎癥反應的激活在AS的啟動和進展中起著核心作用，炎癥細胞的積累導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)和細胞因子的產(chǎn)生，并促進AS發(fā)生發(fā)展[5]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)信號通路是介導炎癥反應的常見通路，通過誘導miR-33激活NF-κB途徑上調(diào)腫瘤壞死因子(tumor Necrosis Factor, TNF)α和白介素(interleukin, IL)6的表達，增加炎癥反應[6]。除此之外，miR-33通過靶向于核受體相互作用蛋白(nuclear receptor interacting protein, NRIP)1的3'UTR來抑制NRIP1信號通路的活化，從而負性調(diào)控THP-1巨噬細胞的炎癥應答[7]。AS斑塊中的巨噬細胞分為促炎巨噬細胞(M1型)和抗炎巨噬細胞(M2型)，巨噬細胞極化為M2型是AS斑塊消退的關(guān)鍵特征，抑制miR-33可以促進巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，延緩動脈內(nèi)壁纖維化和減少炎癥的發(fā)生，從而減輕AS斑塊的負擔[8]。在miR-33介導的M2極化的過程中，需要腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)的激活[9]，并下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子肌筋膜纖維肉瘤癌基因同源物(musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog, Maf)B的表達[10]。由此推測，抑制miR-33減少炎癥因子的表達并促進巨噬細胞的M2極化，可能是AS的潛在防治方法。

1.2 miR-33與自噬

巨噬細胞的自噬會導致膽固醇代謝受損和不良的胞葬等多種病理過程。在自噬過程中，蓄積在細胞質(zhì)中的脂滴被雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬小體后，與溶酶體結(jié)合并被溶酶體中的酸性水解酶水解，形成游離膽固醇，在跨膜蛋白的介導下從細胞質(zhì)流出至細胞外，隨血液循環(huán)回到肝臟進行代謝，參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運[11]。自噬關(guān)鍵效應因子，如自噬基因相關(guān)蛋白(autophagy-related protein, ATG)5/12、溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein, LAMP)1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)及AMPK信號通路依賴的轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白O3(forkhead box O3, FOXO3)、轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)共同調(diào)節(jié)自噬反應，沉默miR-33啟動以上自噬調(diào)節(jié)因子，促進自噬通量，從而增強脂質(zhì)分解代謝和促進凋亡細胞清除以減少斑塊壞死[12，13]。膽固醇流出實驗表明，miR-33靶向人沉默調(diào)節(jié)蛋白(sirtuin, SIRT)6通過誘導巨噬細胞自噬促進細胞內(nèi)膽固醇水解和流出，減少巨噬泡沫細胞的形成，進而減少AS斑塊損傷面積[14]。因此，miR-33通過靶向自噬基因調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)和控制炎癥反應，是延緩AS發(fā)生發(fā)展的重要途徑之一。

1.3 miR-33與線粒體功能

線粒體的主要功能是提供能量。目前研究證明，線粒體功能障礙會加重機體炎癥反應及膽固醇蓄積的病理過程，加速AS病變的進程。線粒體功能障礙激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NOD-like receptor protein, NLRP)3炎性小體，釋放活性IL-1β，血液單核細胞被招募到炎癥血管壁，發(fā)展成M1型巨噬細胞[15]。同時線粒體功能障礙也會導致巨噬細胞內(nèi)膽固醇的積累，減少細胞膽固醇流出[16]。在維持線粒體功能中，8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase, OGG)1修復線粒體的氧化應激損傷；過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferation-activated receptors, PPARs)調(diào)節(jié)線粒體氧化代謝；過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子(peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator, PGC)1α和線粒體膜溶質(zhì)運載蛋白家族25中第25號成員(solute carrier family 25 member 25, SLC25A25)參與線粒體生物合成；丙酮酸脫氫酶激酶同工酶(Pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme, PDK)4負責線粒體呼吸；核呼吸因子(nuclear respiratory factor, Nrf)1和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)對線粒體DNA的復制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[17，18，19]。抑制miR-33后可增加以上述基因的表達，促進巨噬細胞線粒體功能恢復，同時增強巨噬細胞膽固醇流出和改善巨噬細胞炎癥反應[20，21]。此外，線粒體功能障礙會增加線粒體源性ROS、細胞色素C(cytochrome C, CytC)和凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF)的釋放，導致冠狀動脈內(nèi)皮細胞的線粒體氧化應激損傷和凋亡。miR-33可通過線粒體功能靶點改善脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應，然而miR-33對細胞氧化應激和凋亡的調(diào)控作用尚未明確，需要進一步研究完善miR-33在線粒體功能中的重要作用。

1.4 miR-33與脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)代謝紊亂是AS的主要危險因素之一，脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂時，脂質(zhì)聚積在動脈內(nèi)壁上進而形成斑塊，并對斑塊的穩(wěn)定性和血管腔狹窄造成影響[22]。大量研究表明，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的miRNAs中，miR-33被認為是最重要的miRNAs之一，因為miR-33能夠調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵功能，包括膽固醇的合成、轉(zhuǎn)運和攝取、脂肪酸降解以及膽汁酸的合成與分泌。

細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運對于維持細胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在多種靶點的調(diào)控下，將膽固醇運送到膽固醇合成、酯化、攝取和流出的適當位置。單核巨噬細胞表面存在3種膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，即三磷酸腺甘結(jié)合轉(zhuǎn)運子(adenosine triphosphate-binding cassette, ABC)A1、G1及B類I型清道夫受體(scavenger receptor BI, SR-BI)[23]，通過抑制miR-33可調(diào)節(jié)ABCA1、ABCG1和SR-BI的表達，改善AS的膽固醇轉(zhuǎn)運[24]。C型1類尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1 protein, NPC1)是晚期核內(nèi)體和溶酶體中膽固醇轉(zhuǎn)運的兩個重要調(diào)節(jié)因子，是膽固醇流出和脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，miR-33直接靶向并抑制NPC1的表達[25]。敲除羥甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(oxysterol-binding protein-related protein, OSBPL)6可導致核內(nèi)體異常聚集，促進細胞中游離膽固醇的積累，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇酯化減少。miRNA靶標預測發(fā)現(xiàn)，在OSBPL6中識別出miR-33結(jié)合位點，并在體內(nèi)和體外實驗中得到驗證[26]。與此同時，NF-κB信號通路被發(fā)現(xiàn)不僅介導AS進程中的炎癥反應，還可以通過NF-κB/miR-33a途徑上調(diào)THP-1巨噬細胞ABCA1表達，促進膽固醇流出，可緩解胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[27]。

脂肪酸氧化水平降低和脂肪酸合成水平提高，會導致細胞脂質(zhì)蓄積，形成高甘油三酯引發(fā)AS。抑制miR-33能夠增加參與編碼脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶的表達，如肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A)、肉堿氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(carnitine O-Octanoyltransferase, CROT)、羥?；o酶a脫氫酶三功能多酶復合體亞基β(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit beta, HADHB)、蛋白激酶AMP活化催化亞基α1(protein kinase AMP activatedα1, PRKAA1)，同時可減少參與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶的表達，如甾醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(sterol regulatory element-binding transcription factor, SREBF)1、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)、三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶(adenosine triphosphate citrate lyase, ACLY)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase, ACACA)，明顯抑制血漿超低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)和甘油三酸酯(triglyceride, TG)水平，減少脂質(zhì)在血管內(nèi)皮的沉積，降低AS發(fā)生發(fā)展的幾率[28]。

除此以外，膽汁酸合成和分泌等對調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。膽汁酸合成、分泌及排泄障礙，體內(nèi)膽汁酸不足影響脂類物質(zhì)的吸收和代謝，使大量膽固醇在體內(nèi)積聚。在miR-33的沉默后，膽汁酸分泌的關(guān)鍵酶ABCB11、腺苷三磷酸酶酶I類8B成員1(ATPase class I type 8b member 1, ATP8B1)和膽汁酸合成的關(guān)鍵酶膽固醇7α羥化酶(cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1, CYP7A1)的表達明顯上調(diào)，促進膽汁酸的合成與分泌，加速脂質(zhì)的體內(nèi)代謝[29，30]。以上結(jié)果說明，miR-33通過膽固醇的流轉(zhuǎn)和攝取、脂肪酸降解以及膽汁酸的合成與分泌調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，通過靶向miR-33調(diào)控脂質(zhì)代謝在AS的進程中起到重大作用。

筆者對上述miR-33調(diào)節(jié)AS的相關(guān)靶基因進行總結(jié)，并利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建miR-33靶基因的蛋白間互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡圖(圖1)，綜合得分>0.4的交互作用具有統(tǒng)計學意義。STRING[31]在線數(shù)據(jù)庫，分析蛋白質(zhì)之間的功能相互作用，可提供對疾病發(fā)生和發(fā)展機制的見解。Cytoscape(版本3.8.2)[32]是一個開放源碼的生物信息學軟件平臺，用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡。

2 中藥調(diào)節(jié)miR-33在防治AS中的作用機制

目前，AS的臨床治療主要采用降脂類及抗血小板類藥物，該治療方案作用靶點單一，會不可避免地阻斷正常生理運行所需物質(zhì)的合成，造成肝腎功能損害。而miR-33通過調(diào)控AS進程中的多靶點發(fā)揮療效作用，與中醫(yī)整體觀念與辨證論治相契合，具有多靶點、多環(huán)節(jié)和雙向性的特征。因此，深入研究中醫(yī)藥對miR-33的調(diào)控，將會為克服AS做出重大貢獻。

根據(jù)中醫(yī)證候分析，AS屬于“血濁”“瘀血”“痰濁”等范疇，臨床主要以活血化瘀通脈、健脾補氣、祛痰降濁、清熱解毒等為主要治則。近年來國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，不論是中藥復方湯劑還是中藥單體，都可通過miR-33及miR-33的靶向基因，有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展進程。在中藥復方研究方面，通過細胞和動物模型實驗發(fā)現(xiàn)，張立的健脾祛痰化瘀自擬方[33]、劉仕利的通脈降濁煎劑[34]、秦合偉的血管軟化丸[35]、梁健的清脂通脈顆粒[36]均能抑制miR-33表達，同時還可影響SREBPs信號途徑及下游通路ABCG1、ABCA1、NPC1基因及蛋白表達，從而提高膽固醇的流出率，降低泡沫細胞內(nèi)膽固醇的含量。

中藥復方成分復雜，在現(xiàn)代技術(shù)的基礎(chǔ)上提取出中藥單體，即復方中的有效成分。臨床治療心血管疾病的常見藥物有血脂康、冠心康膠囊等，血脂康、冠心康分別由紅曲、丹參單藥制成。在臨床試驗中，Cao[37]等發(fā)現(xiàn)血脂康治療提高了患者血漿miR-33水平，同時增加細胞膽固醇輸出，減少AS的發(fā)生。丹參酮ⅡA是丹參酮中含量最豐富的生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、保護心腦血管等多種藥理活性作用。Yang C[38]等證實，丹參酮ⅡA可以通過下調(diào)THP-1巨噬細胞中miR-33的表達，抑制促炎細胞因子的分泌，發(fā)揮對AS的保護作用。除此以外，黃芪甲苷[39]、黃芪總黃酮[40]、枸杞多糖[41]、兒茶素[42]、荷葉生物堿[43]等通過減少miR-33的生成，調(diào)控ABCA1和NF-κB表達，促進細胞膽固醇流出和抑制炎癥反應以改善AS。

miR-33在炎癥和脂質(zhì)代謝方面的常用靶點ABCA1、ABCG1、NPC1、NF-κB等已經(jīng)在中醫(yī)藥的研究中得到廣泛證實，但還有許多與炎癥和脂質(zhì)代謝相關(guān)靶點的作用機制尚需進一步驗證，如OSBPL6、CROT、CPT1A、HADHB、CYP7A1等。同時自噬與線粒體功能障礙也受miR-33的調(diào)控，并在AS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，而中醫(yī)藥在自噬與線粒體功能障礙等方面的研究還未展開。因此，在miR-33的網(wǎng)絡調(diào)控中，這些都是尚未研究的調(diào)控靶點，中醫(yī)藥能否通過控制miR-33及下游靶點，發(fā)揮防治AS的作用，需要進一步的明確。

3 展望

綜上所述，miR-33在AS的炎癥反應、自噬、線粒體功能障礙和脂質(zhì)代謝等方面起到重要的調(diào)節(jié)作用。miR-33具有在血液中穩(wěn)定存在并可被檢測的特點，同時miR-33通過多個下游靶點形成網(wǎng)絡調(diào)控機制，提示其具有作為AS診斷性生物標志物和治療作用靶點的潛力。至今為止，AS的致病率、致殘率和病死率雖然有所下降，但仍然是導致血管疾病的主要病因。西藥通常使用的降脂藥和降血小板藥，雖對疾病有較高的治愈率，但存在胃腸道反應、肝腎功能損傷及影響其他正常生理功能等毒副作用，且西藥作用靶點單一，容易產(chǎn)生耐藥性。中藥是由天然物質(zhì)為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)變而來的，對人體傷害性較小，作用于人體也具有多靶點、多環(huán)節(jié)、雙向性的特征。現(xiàn)如今，從中醫(yī)藥處方中已挖掘出一部分中藥單體或復方，并在臨床與實驗研究過程中被驗證，中藥可通過miR-33調(diào)節(jié)炎癥、脂質(zhì)代謝等方面，對AS有明顯的療效。因此，進行科學的實驗深入研究中醫(yī)藥對miR-33的多靶點調(diào)控機制，可以挖掘出更多治療AS的中藥單體或復方，并且為中醫(yī)藥防治AS提供堅實的理論依據(jù)。