NOD1基因在Hp感染小鼠炎性反應(yīng)及免疫功能的作用*

王 劍，賈純亮，梁 磊，張 磊，李翰嵩，劉遠(yuǎn)廷

(河北省唐山市人民醫(yī)院胃腸外科 063000)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭陰性螺旋形細(xì)菌，普遍存在于人的胃黏膜中，可定植于人胃黏膜上皮細(xì)胞，據(jù)報道全球已有超過一半的人感染Hp，是功能性消化不良、慢性萎縮性胃炎、腸黏膜腸化生、胃黏膜異常增生和胃癌的主要病因[1-3]。胃癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，Hp參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，被WHO列為Ⅰ類致癌物[4]。雖然眾多研究表明，Hp的根除有助于潰瘍愈合，可降低胃癌發(fā)生風(fēng)險，延緩淋巴瘤的進(jìn)程，但到目前為止，Hp感染的預(yù)防及治療效果仍不理想。因此，Hp感染對機(jī)體炎性反應(yīng)及免疫功能的作用機(jī)制研究具有重要意義。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(nucleotide binding oligomerization domain like receptor，NLR)是一類重要的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)模式受體，可以識別、結(jié)合病原相關(guān)分子模式并激活一系列信號通路，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生固有免疫應(yīng)答[5]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1(nucleotide binding oligomerization domain 1,NOD1)是NLR家族中一個重要的病原模式識別受體，可通過激活轉(zhuǎn)錄因子如核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，在炎癥相關(guān)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。本研究擬通過建立正常小鼠經(jīng)胃感染Hp模型，探討Hp感染對小鼠炎性反應(yīng)及免疫功能的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種和實驗動物

Hp菌種購自美國菌種保藏中心(ATCC)，編號：700392。80只無特殊病原體(SPF)級C57BL/6小鼠，6～8周齡，雌雄各半，體重18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～55%，光照周期12 h，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2主要儀器與試劑

反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自美國Fermantas公司；小鼠干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)、小鼠干擾素β(interferon β，IFN-β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自深圳欣博生物科技有限公司；兔抗鼠p65多克隆抗體、核纖層蛋白B1(lamin B1)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自英國Abcam公司；FITC標(biāo)記的兔抗鼠CD4、PE標(biāo)記的兔抗鼠CD8a購自美國BD公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司；核酸蛋白分析儀購自美國Beckman公司；PCR儀購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；凝膠圖像分析儀購自美國Kodak公司；全自動酶標(biāo)儀購自芬蘭Lad systems公司；水平電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1Hp的培養(yǎng)

從液氮中取出Hp菌種，立即放入40 ℃溫水中迅速攪拌使其融化，1 000 r/min(離心半徑10 cm)低速離心2 min，棄上清液，用接種環(huán)三線法將Hp菌株分離劃線于哥倫比亞血瓊脂平板，微需氧條件(10% CO2，5% O2，85% N2)，37 ℃培養(yǎng)48 h復(fù)蘇Hp。將復(fù)蘇的菌種在含萬古霉素(Vancomycin，10 mg/L)、兩性霉素B(Amphotericin B，10 mg/L)、多粘菌素B(Polymyxin B，2 500 U/L)、頭孢氨芐-甲氧芐啶(TMP，5 mg/L)和7%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平板上分區(qū)劃線，微需氧環(huán)境(10% CO2，5% O2，85% N2)、37 ℃培養(yǎng)48 h。取單菌落進(jìn)行生化反應(yīng)、革蘭染色和PCR擴(kuò)增鑒定，鑒定為陽性后，用滅菌的生理鹽水將Hp從血瓊脂平板上洗下，調(diào)整菌液濃度至1×109CFU/mL。

1.2.2Hp感染小鼠模型的建立與分組

80只C57BL/6小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和感染組，各40只。實驗前24 h禁食，感染組灌胃Hp培養(yǎng)懸液(1×109CFU/mL，每只0.5 mL)，對照組灌胃等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。間隔48 h灌胃1次，共5次。實驗期間自由飲食、飲水。

1.2.3Hp感染鑒定

末次灌胃后24 h，CO2麻醉處死兩組各5只小鼠，無菌條件下解剖打開小鼠腹腔取出全胃，沿胃大彎解剖，用滅菌的PBS洗去胃內(nèi)殘留物，將胃黏膜置于液體尿素酶試劑中進(jìn)行快速尿素酶試驗，觀察5 min，如試劑變?yōu)榧t色則表示陽性。

1.2.4PCR檢測小鼠胃組織中NOD1和受體相互作用蛋白2(RIP2)mRNA的表達(dá)水平

末次灌胃后24、48、72、120 h各處死5只小鼠，解剖取其胃組織，加液氮研磨，TRIzol法提取小鼠胃組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，測定總RNA濃度和純度，按照Fermantas RNA PCR(AMV)試劑盒說明書對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系：25 mmol/L MgCl22 μL，5×PCR緩沖液4 μL，上下游引物各0.5 μL，聚合酶2 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O 9 μL；反應(yīng)程序：94 ℃，2 min；94 ℃，40 s；50～65 ℃，40 s；72 ℃，1 min，30個循環(huán)，72 ℃，補延伸5 min，終止反應(yīng)。PCR引物應(yīng)用premier 6.0設(shè)計，序列見表1。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后凝膠圖像分析系統(tǒng)灰度掃描確定密度積分值。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，以目的基因產(chǎn)物電泳條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值來表示目的基因mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.2.5Western blot檢測小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)水平

取部分胃組織置于勻漿器中，加入400 μL核蛋白提取液A液充分研磨，冰上作用15 min，4 ℃ 12 000 r/min(離心半徑8 cm)離心2 min，棄上清液，加50 μL核蛋白提取液B液，輕輕吹打以重懸沉淀，冰上繼續(xù)作用20 min，4 ℃ 12 000 r/min(離心半徑8 cm)離心15 min,吸取上清液即為細(xì)胞核蛋白提取液，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，100 ℃使蛋白變性，10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，NF-κB p65一抗(1∶1 000)、Lamin B1一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，加電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測的發(fā)光液反應(yīng)，暗室中曝光顯影，以目蛋白條帶灰度值與內(nèi)參Lamin B1條帶灰度值的比值來表示目的蛋白相對表達(dá)水平，BandScan軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6ELISA檢測小鼠血清IP-10及IFN-β水平

末次灌胃后8、12、16周兩組各處死5只小鼠，采集其下腔靜脈血，室溫靜置1 h，3 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，上清液即為血清樣品，酶標(biāo)包被板上設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔，空白孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，再加血清樣品10 μL(最終稀釋度為5倍)，輕輕晃動混勻，封板膜封板，37 ℃孵育30 min，洗滌液清洗5次，吸水紙上拍干，除空白孔外每孔加50 μL酶標(biāo)試劑，封板膜封板，37 ℃孵育1 h，洗滌液清洗5次，吸水紙上拍干，每孔加入100 μL顯色液TMB輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色20 min，待標(biāo)準(zhǔn)品孔前5孔出現(xiàn)明顯的顏色梯度變化時，每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)，15 min內(nèi)以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量各孔的吸光度值(A值)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，使用CurveExpert軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品濃度。

1.2.7蘇木素-伊紅(HE)染色鏡檢小鼠胃黏膜組織的病變程度

取灌胃Hp后第8、12、16周小鼠部分胃組織，10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片厚度為4 μm，二甲苯、乙醇脫蠟、水化，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠加蓋玻片封片，顯微鏡下觀察胃黏膜炎癥情況并拍照保存結(jié)果，胃組織病理改變情況參照Miyashita標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[7]。

1.2.8流式細(xì)胞技術(shù)分析CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例

取灌胃Hp后第8、12、16周小鼠脾臟組織，用手術(shù)剪剪碎，70 μm篩網(wǎng)過濾后加入預(yù)冷的PBS混勻，1 500 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，棄上清液，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液充分混勻，避光裂解10 min，1 500 r/min(離心半徑8 cm)4 ℃離心5 min，棄上清液，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，取300 μL細(xì)胞懸液至流式管，將FITC標(biāo)記的兔抗鼠CD4、PE標(biāo)記的兔抗鼠CD8加入管中混合均勻，同時設(shè)置不加抗體的空白對照組，4 ℃避光反應(yīng)0.5 h，1 500 r/min(離心半徑8 cm)4 ℃離心5 min，棄上清液，PBS洗滌后加入200 μL PBS將其重懸，上機(jī)檢測，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)并計算CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Hp感染結(jié)果

對照組5只小鼠胃黏膜快速尿素酶試驗均為陰性，感染率為0；感染組5只小鼠胃黏膜快速尿素酶試驗均為陽性，感染率為100%。

2.2 各組小鼠胃組織中NOD1、RIP2 mRNA表達(dá)水平

Hp感染24 h后，與對照組比較，感染組小鼠胃組織NOD1 mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，RIP2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；Hp感染48、72、120 h后，與對照組比較，感染組胃組織NOD1、RIP2 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；對照組NOD1、RIP2 mRNA表達(dá)水平隨感染時間增加無明顯變化，感染組NOD1 mRNA、RIP2 mRNA表達(dá)水平隨感染時間增加先升高后降低，其中NOD1 mRNA在Hp感染48 h后表達(dá)水平最高，RIP2 mRNA在Hp感染72 h后表達(dá)水平最高，見表2，圖1。

表2 各組小鼠胃組織中NOD1、RIP2 mRNA表達(dá)水平比較

圖1 各組小鼠胃組織中NOD1、RIP2 mRNA的表達(dá)

2.3 各組小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平

Hp感染24、48、72、120 h后，與對照組比較，感染組小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；對照組小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平隨感染時間增加無明顯變化，感染組小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平隨感染時間增加先升高后降低，在Hp感染72 h后表達(dá)水平最高，見表3，圖2。

表3 各組小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平比較

圖2 各組小鼠胃組織細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)

2.4 各組小鼠血清IP-10、IFN-β水平

Hp感染8、12、16周后，與對照組比較，感染組小鼠血清IP-10、IFN-β水平明顯升高(P<0.05)；感染組小鼠血清IP-10、IFN-β水平隨感染時間增加逐漸升高，在Hp感染16周后最高，見表4。

表4 各組小鼠血清中IP-10、IFN-β水平

2.5 HE染色觀察小鼠胃黏膜組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，可見黏液細(xì)胞，無明顯炎癥損傷；Hp感染8、12和16周后，小鼠胃組織腺體結(jié)構(gòu)破壞、減少、萎縮，肌層間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，隨著時間延長，胃黏膜病理損傷逐漸加重，見圖3。感染8、12、16周后小鼠胃黏膜組織病理損傷評分分別為(2.31±0.21)、(3.68±0.35)、(4.73±0.37)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=72.783，P<0.001)，且各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：對照組；B：Hp感染8周；C：Hp感染12周；D：Hp感染16周。

2.6 各組小鼠脾臟組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比

Hp感染8周后，與對照組比較，感染組小鼠脾臟組織CD4+T淋巴細(xì)胞百分比無明顯變化(P>0.05)，CD8+T淋巴細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)；Hp感染12、16周后，與對照組比較，感染組小鼠脾臟組織CD4+T淋巴細(xì)胞百分比明顯降低(P<0.05)，CD8+T淋巴細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)；小鼠脾臟組織CD4+T淋巴細(xì)胞百分比隨感染時間增加先降低后升高，在Hp感染12周后最低；小鼠脾臟組織CD8+T淋巴細(xì)胞百分比隨感染時間增加先升高后降低，在Hp感染12周后最高，見表5，圖4。

表5 各組小鼠脾臟組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比

A：對照組；B：Hp感染8周；C：Hp感染12周；D：Hp感染16周。

3 討 論

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界胃癌患者約106.4萬，死亡人數(shù)約78.3萬，且均呈上升趨勢，其中死亡人數(shù)約占癌癥死亡總數(shù)的8.2%，病死率僅次于肺癌，居第2位[8]。胃癌產(chǎn)生的危險因素包括Hp感染、年齡、高鹽攝入等，由內(nèi)鏡活檢后組織學(xué)診斷，CT、內(nèi)鏡超聲及腹腔鏡等進(jìn)行分期，是一種分子和表型高度異質(zhì)的疾病[9]。胃癌的發(fā)病機(jī)制主要是原癌基因和抑癌基因的遺傳及表觀遺傳學(xué)改變積累導(dǎo)致多種信號通路失調(diào)，從而打破細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡[10]。目前，手術(shù)是胃癌唯一的根治性治療手段，隨著外科手術(shù)、放療、化療的進(jìn)步和新輔助療法的實施，早期胃癌的5年生存率可達(dá)到95%以上，晚期胃癌主要采用新輔助放化療、分子靶向治療和免疫治療的聯(lián)合治療方案[11]。分子靶向治療是以腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的分子作為靶點，選擇特異性阻斷劑，對其進(jìn)行有效控制，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[12]。分子靶向治療聯(lián)合胃癌傳統(tǒng)治療效果顯著，且毒副作用少。因此，研究胃癌的分子發(fā)病機(jī)制，尋找有效的新分子靶標(biāo)對提高治療效果具有重要意義。

Hp感染是導(dǎo)致十二指腸潰瘍、胃癌及其他類型胃和胃外疾病的主要致病因素，占腸道型胃癌病例的近60%[13-14]。SAYED等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染下調(diào)Nei樣DNA糖基化酶2，導(dǎo)致基因組損傷增加，胃上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)放大并引發(fā)胃癌。LV等[16]研究顯示，Hp感染誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-10，可促進(jìn)胃細(xì)菌定植和胃炎。SEMPER等[17]研究表明，Hp誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-18以NF-κB依賴性方式抑制β-防御素1的表達(dá)，導(dǎo)致更多的細(xì)菌定植，同時炎癥小體活化增強中性粒細(xì)胞浸潤，從而導(dǎo)致炎癥。本研究結(jié)果顯示，正常小鼠經(jīng)Hp感染后，胃組織腺體結(jié)構(gòu)破壞、減少、萎縮，肌層間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，血清IP-10、IFN-β水平升高，脾臟組織CD4+淋巴細(xì)胞百分比降低，CD8+T淋巴細(xì)胞百分比升高，提示Hp感染誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生炎性反應(yīng)，降低其免疫功能。

NOD1主要表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞，此外在部分胃腸道細(xì)胞系中也有表達(dá)，在宿主防御病原體發(fā)生固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。NOD1可以識別并結(jié)合革蘭陰性細(xì)菌肽聚糖的保守結(jié)構(gòu)，通過半胱天冬酶活化募集結(jié)構(gòu)域發(fā)出信號后與接頭蛋白RIP2相互作用[18]。NOD1/RIP2激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子及趨化因子[19]。ASANO等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染通過NOD1介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)調(diào)控尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)，引起腸上皮化生。TRAN等[21]研究表明，Hp通過激活NOD1和其配體相互作用的絲氨酸-蘇氨酸激酶2信號，誘導(dǎo)IL-33反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，Hp感染組小鼠胃組織NOD1、RIP2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞核NF-κB p65表達(dá)水平升高，提示Hp感染可以調(diào)控NOD1基因及下游相關(guān)分子的表達(dá)。

綜上所述，NOD1及NF-κB的激活，可能參與Hp感染誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生炎性反應(yīng)，致其免疫功能下降，為Hp感染導(dǎo)致胃癌的分子靶向治療提供了理論依據(jù)。