miR-27a-3p介導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制研究*

李寧寧，雷 蕾，郝冬林，劉 喆，戴冰冰△

(1.大連市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，遼寧大連 116083；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇蘇州 215008；3.駐馬店市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南駐馬店 463000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種最常見的炎癥性疾病，全球范圍內(nèi)發(fā)病率約為1%。其主要表現(xiàn)為炎癥、滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨及骨損傷，且治療效果欠佳，40%～70%的患者最終會發(fā)展為殘疾[1]。病程較長的患者除累及關(guān)節(jié)外，還可出現(xiàn)間質(zhì)性肺疾病、心血管疾病等多種關(guān)節(jié)以外表現(xiàn)[2]。目前，對于RA的治療已有針對炎癥和免疫信號通路的免疫療法，雖然這些治療是有效的，但大部分RA患者在脫離藥物后出現(xiàn)病情反復(fù)或加重[3]?；ぱ装Y是由固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞浸潤滑膜組織引起的免疫相關(guān)疾病，活化的滑膜成纖維細(xì)胞(resident synovial fibroblasts，SFs)是RA的主要病理改變[4]。SFs的主要功能是提供滑膜組織結(jié)構(gòu)支持，分泌滑膜液潤滑關(guān)節(jié)，減少摩擦運(yùn)動，滋養(yǎng)無血管的軟骨[5]。而在RA的滑膜中，SFs被活化，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡減少、遷移和侵襲增強(qiáng)的特征，成為侵襲性血管膜的主要效應(yīng)細(xì)胞，參與RA的炎癥過程[6]。活化態(tài)的SFs表現(xiàn)出具有腫瘤細(xì)胞樣的侵襲性表型，并通過產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6等促炎細(xì)胞因子，以及基質(zhì)金屬蛋白酶和血管生成因子在RA的發(fā)展中發(fā)揮主要作用[7]。

微RNA(microRNAs，miRs)是一種短鏈的非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在多種細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRs主要通過與信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslation region，3′UTR)或5′非翻譯區(qū)(5′-untranslation region，5′UTR)結(jié)合，特異性地抑制mRNA的翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解，以此來沉默靶基因的表達(dá)[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)中miR-27a-3p可以通過靶向分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)參與RA的病理生理過程，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本研究經(jīng)大連市中心醫(yī)院和駐馬店市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》，所有參與者均簽署書面知情同意書。選取2017—2019年于大連市中心醫(yī)院和駐馬店市中心醫(yī)院行關(guān)節(jié)手術(shù)的RA患者20例獲取滑膜組織標(biāo)本，男11例，女9例，年齡34～69歲，平均(52±17)歲。所有RA患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會疾病分類標(biāo)準(zhǔn)[9]。另選取同期于大連市中心醫(yī)院和駐馬店市中心醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換手術(shù)的關(guān)節(jié)外傷患者10例，獲取對照組標(biāo)本，男5例，女5例，年齡28～67歲，平均(45±13)歲。所有對照組患者無自身免疫病、傳染病、惡性腫瘤等其他基礎(chǔ)疾病。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

獲取新鮮滑膜組織，2 h內(nèi)無菌條件下剪碎，胰蛋白酶2.5 g/L消化2 h，1 000 r/min離心10 min，獲得目的細(xì)胞。DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)加10%胎牛血清(美國Gibco公司)、青霉素和鏈霉素(P/S，美國Gibco公司)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長約80%時傳代，選取傳代3～8代的RASFs進(jìn)行試驗(yàn)。以Lipofectamine 2000為載體將miR-27a-3p類似物(mimic組)、抑制劑(inhibitor組)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞(mimic、inhibitor購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司)，以未處理組為空白對照(NC組)，脂質(zhì)體組為陰性對照(Liposome組)。

1.2.2實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)

從細(xì)胞中分離得到總RNA。使用Super RT cDNA合成試劑盒(日本TAKARA公司)將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用特異性引物對miRNA進(jìn)行RT-PCR檢測。選擇U6作為管家基因。7500 Fast RT-PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)水平，重復(fù)3次。miR-27a-3p的上游引物序列為5′-ATG GTT CGT GGG TTC ACA-3′，下游引物序列為5′-GTG GCT AAG TTC CGA CG-3′；SFRP1的上游引物序列為5′-GGT CTT AGT TCT GGT TGA TTC-3′，下游引物序列為5′-CTG CTC TTC CGT ATT CTG T-3′；U6的上游引物序列為5′-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3′，下游引物序列為5′-CAC TAT TGC GGG CTG C-3′。

1.2.3Western blot

提取總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。隨后，轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(美國Millipore公司)。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后與SFRP1(1∶2 000，美國Proteintech公司)和β-actin(1∶5 000，美國Proteintech公司)一抗孵育過夜。膜洗滌3次，二抗(1∶5 000，美國Proteintech公司)室溫孵育1 h，顯影成像，ImageJ分條帶灰度值。

1.2.4靶基因預(yù)測

基于PITA(genie.weizmann.ac.il/)，miRmap(mirmap.ezlab.org/)，microT(microrna.gr/microT)，miRanda(microrna.org/microrna/home.do)，PicTar(pictar.org/)，TargetScan(http://www.targetscan.org/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-27a-3p靶基因。

1.2.5熒光素酶報告試驗(yàn)

設(shè)計并合成含有miR-27a-3p結(jié)合位點(diǎn)的SFRP1 3′UTR正常片段(WT)及其突變體(MUT)，置于pMIR-REPORT載體的報告基因下游區(qū)域，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000將miR-27a-3p mimics與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，48 h后使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測螢光素酶相對活性。

1.2.6Transwell

采用Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力。Transwell上室預(yù)先涂基質(zhì)膠(美國BD Biosciences公司)，上、下小室分別加入100 μL無血清培養(yǎng)基和600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞接種于上室，在37 ℃孵育24 h。用棉簽從小室的上表面去除未遷移的細(xì)胞。遷移的細(xì)胞用0.1%的結(jié)晶紫染色，IX81數(shù)字顯微鏡(日本Olympus公司)計數(shù)。

1.2.7細(xì)胞增殖檢測試驗(yàn)

依據(jù)細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)系統(tǒng)(日本Dojindo公司)測定細(xì)胞活力。細(xì)胞接種在96孔板中(每孔1×104個細(xì)胞)。細(xì)胞于37 ℃黑暗孵育，于0、24、48、72 h分別加入10 μL CCK-8溶液，再孵育1 h。然后使用酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)在450 nm處測定每個孔的吸光度(A450)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-27a-3p在RASFs細(xì)胞中過表達(dá)

在獲取RASFs和SFs后，首先通過RT-PCR檢測miR-27a-3p在兩種細(xì)胞中的表達(dá)。與SFs中的表達(dá)水平(1.00±0.21)比較，miR-27a-3p在RASFs中表達(dá)水平(3.24±0.45，P<0.05)升高，見圖1A。隨后通過Lipofectamine 2000將miR-27a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染入RASFs，共分3組：未處理的RASFs(NC組)，空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入細(xì)胞(Liposome組)，脂質(zhì)體攜帶miR-27a-3p抑制劑轉(zhuǎn)入細(xì)胞(inhibitor組)。同NC組比較，Liposome組中miR-27a-3p表達(dá)水平無明顯變化(0.05)，而inhibitor組miR-27a-3p表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，見圖1B。

A：miR-27a-3p在RASFs中過表達(dá)；B：miR-27a-3p抑制劑抑制miR-27a-3p表達(dá)；a：P<0.05。

2.2 miR-27a-3p抑制SFRP1表達(dá)

通過PITA，miRmap，microT，miRanda，PicTar，TargetScan數(shù)據(jù)庫對miR-27a-3p可能結(jié)合的靶基因進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示，分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRPs)家族成員SFRP1可能是miR-27a-3p的潛在靶基因，見圖2A。雙熒光素酶報告試驗(yàn)顯示，與SFRP1-3′UTR-WT NC組相比，miR-27a-3p mimics與SFRP1-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染使熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見圖2B；而miR-27a-3p mimics與SFRP1-3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶的活性無明顯變化(P>0.05)，見圖2B。Western blot顯示，SFRP1在RASFs中表達(dá)低于其在SFs中表達(dá)(P<0.05)，見圖2C。抑制RASFs中miR-27a-3p表達(dá)后，SFRP1的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見圖2D。SFRP1的siRNA能夠抑制SFRP1的表達(dá)(P<0.05)，見圖3。

A：miR-27a-3p與SFRP1的靶向關(guān)系；B：雙熒光素酶報告基因試驗(yàn)證實(shí)靶向關(guān)系；C：Western blot檢測SFRP1蛋白表達(dá)；D：抑制RASFs中miR-27a-3p表達(dá)后SFRP1表達(dá)增加；a：P<0.05。

a：P<0.05。

2.3 miR-27a-3p和SFRP1影響RASFs侵襲

Transwell試驗(yàn)中，將miR-27a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染RASFs后，穿膜細(xì)胞數(shù)量從(179±14)個減少到(124±8)個；而在此基礎(chǔ)上同時轉(zhuǎn)染si-SFRP1，穿膜細(xì)胞數(shù)量增加到(155±11)個(P<0.05)，見圖4。

A：細(xì)胞侵襲檢測圖(Transwell，×100)；B：轉(zhuǎn)染后穿膜細(xì)胞柱狀圖；a：P<0.05。

2.4 miR-27a-3p和SFRP1影響RASFs增殖

采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測試驗(yàn)評估m(xù)iR-27a-3p和SFRP1對細(xì)胞增殖的影響。在RASFs中抑制miR-27a-3p的表達(dá)后，細(xì)胞增殖減少，而同時抑制SFRP1后細(xì)胞增殖增加(P<0.05)，見圖5。

a：P<0.05。

3 討 論

RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜組織的慢性炎癥，進(jìn)而發(fā)展為不可逆的關(guān)節(jié)破壞，包括滑膜增生、關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)炎癥和侵襲，以及軟骨和滑膜損傷等[10]。與惡性腫瘤細(xì)胞類似，RASFs具有內(nèi)在的能力來抵抗微環(huán)境中氧自由基和其他有毒代謝物的攻擊[11]。因此，RASFs生物學(xué)功能及表型的改變，可促進(jìn)滑膜血管膜的形成并侵犯鄰近的軟骨和骨組織，這是RA形成的關(guān)鍵?，F(xiàn)有的RA治療藥物可能不直接針對紊亂的RASFs細(xì)胞表型，導(dǎo)致對該類患者的治療有效性不足。RASFs的具體激活機(jī)制尚不清楚，但近期研究發(fā)現(xiàn)Wnt/catenin通路可能參與了RASFs的激活和RA的發(fā)生[12]。

SFRPs是Wnt抑制劑，能夠在細(xì)胞外與Wnts結(jié)合[13]。有報道顯示，SFRP1與炎性反應(yīng)相關(guān)，并在RASFs中表達(dá)下降[14]。此外，啟動子超甲基化引起的SFRP1下調(diào)可以激活Wnt/catenin信號通路，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)，參與誘導(dǎo)瘢痕疙瘩發(fā)育[15]。既往研究報道，miRs可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與免疫細(xì)胞的增殖、分化，以及某些組織損傷過程[16]。如miR-146a可能是治療RA的新靶點(diǎn)[17]，miR-125b是評估類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎對利妥昔單抗治療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在RASFs中過表達(dá)，miR-27a-3p可以靶向作用于SFRP1的3′UTR，抑制SFRP1的表達(dá)。在RASFs中抑制miR-27a-3p的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和侵襲能力減弱，而在此基礎(chǔ)上同時抑制SFRP1的表達(dá)，細(xì)胞的增殖和侵襲能力恢復(fù)，提示miR-27a-3p促RA發(fā)生、發(fā)展的作用是通過抑制SFRP1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。在一項(xiàng)阿達(dá)木單抗聯(lián)合氨甲蝶呤治療RA的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，治療前后血液中miR-27a-3p的表達(dá)變化同RA的緩解密切相關(guān)[19]。此外，在乳腺癌中過表達(dá)的miR-27a-3p參與腫瘤對阿霉素的化療耐藥[20]，過表達(dá)的miR-27a-3p參與糖尿病腎病腎纖維化[21]等。

綜上所述，miR-27a-3p在RASFs中過表達(dá)，促進(jìn)RASFs的侵襲和增殖，而該功能可能是miR-27a-3p通過抑制SFRP1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。但miR-27a-3p/SFRP1軸的上、下游調(diào)控關(guān)系仍需在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討，該系列研究的順利實(shí)施，有望成為RA靶向治療的有效靶點(diǎn)。