不同調(diào)制方式對煙葉和煙梗TSNAs形成和積累的影響

張晶云，趙園園，劉德水，程玉淵，周 駿，馮雨晴，吳 疆，史宏志*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，河南 鄭州 450002；2.上海煙草集團有限公司 技術中心 北京工作站，北京 101121；3.河南省煙草公司 南陽市公司，河南 南陽 473000）

硝酸鹽和生物堿是煙草特有強致癌物質(zhì)亞硝胺(TSNAs)的前體物，煙草特有亞硝胺主要包括4種：N′-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙草堿(NAT)［1］。一般認為，TSNAs在進入調(diào)制前的鮮煙葉中是不存在的［2］，其形成和積累主要發(fā)生在調(diào)制和貯藏過程中。Burton等［3-4］對白肋煙研究時發(fā)現(xiàn)，TSNAs的大量積累發(fā)生在煙葉變黃末期，在煙葉進入調(diào)制過程后，隨著煙葉水分的散失、細胞膜透性的增加、細胞內(nèi)物質(zhì)的外流，微生物迅速繁殖，酶活性增強，煙葉中的硝酸鹽被還原生成亞硝酸鹽，進一步與生物堿反應生成TSNAs［5-6］，這是白肋煙調(diào)制過程中TSNAs形成的主要原因。調(diào)制結束后的貯藏階段亦是TSNAs形成的重要時期，經(jīng)過貯藏階段的白肋煙煙葉，其TSNAs含量與調(diào)制結束時相比可增加50%以上［7-8］。眾多研究表明［9-10］，在煙葉貯藏過程中，高硝酸鹽含量、高溫條件與TSNAs的形成密切相關，其中，在高溫條件下，硝酸鹽產(chǎn)生了大量的氣態(tài)氮氧化物，進而與生物堿發(fā)生亞硝化反應生成TSNAs，硝酸鹽含量高的主脈更有利于TSNAs的形成。

煙梗是煙葉的有機組成部分，也是卷煙生產(chǎn)中不可或缺的原料之一，烤煙的含梗率為25% ～35%，由于其具有填充值高、焦油釋放量低的優(yōu)點，在降低卷煙焦油含量和原料成本方面具有獨特的作用［11］。煙葉葉片和主脈在化學成分上存在很大差異，白肋煙葉片中的生物堿和蛋白質(zhì)含量高于主脈，而鉀、氯含量則低于主脈［12］；烤煙葉片中的NH4-N、NO2-N、總氮和可溶性蛋白含量顯著高于主脈，而主脈中的NO3-N和TSNAs含量顯著高于葉片［13-14］。李亞飛等［15-17］比較不同類型煙葉的化學成分差異后得出，白肋煙煙葉總氮、硝酸鹽含量明顯較烤煙高，而糖類物質(zhì)低于烤煙，這種差異在苗期已存在，調(diào)制后的白肋煙煙葉硝酸鹽含量較烤煙高幾十甚至上百倍。不同調(diào)制方式的調(diào)制環(huán)境和時間，其微生物活性和氣態(tài)氮氧化物的產(chǎn)生都存在顯著差異，進而對TSNAs的形成產(chǎn)生了不同的影響。李宗平等［18］研究表明，晾制煙葉中的特有亞硝胺含量最高，其次是曬制的，烤制的最低。鄭昕等［19］對曬煙品種萬毛9號的試驗表明，晾制條件下的TSNAs含量高于曬制的。

目前，有關烤煙在烘烤過程中TSNAs的相關研究多集中在如何降低TSNAs含量方面，如宮長榮等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在烤煙調(diào)制初期和變黃過程中使用頻率為2450 MHz的微波處理能降低TSNAs的含量。潘建斌等［21］通過改變烘烤過程中變黃溫度和變黃時間以降低TSNAs含量。而有關烤煙在不同調(diào)制方式下TSNAs含量的差異以及葉片和主脈不同階段TSNAs含量變化方面的研究較少，烤煙主脈和葉片TSNAs的形成機理尚不清楚。為此，本試驗采用烤煙品種云煙87為材料，設置正常烘烤、晾制和先烤后晾3種調(diào)制方式，探討了烤煙在不同調(diào)制環(huán)境中不同階段的煙葉葉片和主脈TSNAs及其前體物含量的變化特點，以明確不同調(diào)制方式對烤煙TSNAs形成和積累的影響，初步探究了烤煙烘烤過程中TSNAs的形成機理，為今后降低烤煙TSNAs含量提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點

試驗時間為2019和2020年，試驗地點設在河南省南陽市方城縣清河鎮(zhèn)金葉園，供試材料為當?shù)刂髟钥緹熎贩N云煙87的上部6片葉。施肥方式為當?shù)亓晳T施肥，施氮量為45 kg/hm2，供試肥料包括煙草專用復合肥(N-P-K=10-10-20)、硝酸鉀、硫酸鉀、液態(tài)鉀肥、芝麻餅肥、沼渣有機肥。田間管理按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術規(guī)范進行。

1.2 試驗設計

對不同調(diào)制方式設置3個處理：正常烘烤、晾制、先烤后晾。正常烘烤：在當?shù)貙Ｓ每痉績?nèi)進行，其中，變黃階段的干、濕球溫度分別控制在35～42 ℃、33～37 ℃之間，時間48～72 h；干葉階段的干、濕球溫度分別控制在45～54 ℃、37～39 ℃之間，時間36～48 h；干筋階段的干、濕球溫度分別控制在55～68 ℃、40～43 ℃之間，時間24～36 h；烘烤時間合計120～144 h。晾制：在自然條件下的晾架內(nèi)進行，晾制時間保持在25～35 d之間，其中凋萎期的空氣相對濕度保持在70%～80%之間，持續(xù)3～4 d；變黃期的空氣相對濕度保持在70%～75%之間，持續(xù)10～15 d；干葉期的空氣相對濕度保持在60%～65%之間，持續(xù)6～7 d；干筋期的空氣相對濕度保持在60%以下，持續(xù)6～7 d。先烤后晾：首先進行正常烘烤，烤至干葉期后進行晾制，時間大約為11 d，具體工藝流程和技術操作分別按烤煙烘烤技術規(guī)程［22］和雪茄茄芯晾制技術規(guī)程［23］進行。各處理分別于調(diào)制前、變黃末、干葉后、干筋后取樣，殺青或烘干后粉碎，磨樣，過0.25 mm篩子，待測。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 硝酸鹽含量的測定煙葉和主脈的NO3-N含量采用濃H2SO4-水楊酸法測定［24］。

1.3.2 生物堿含量的測定準確稱取200 mg煙末置于15 mL試管中，加入內(nèi)標溶液100 μL、10% NaOH溶液1.5 mL、甲基叔丁基醚(MTBE)3 mL，旋緊旋蓋，充分振蕩5 min后，室溫放置過夜(24±2) h，取上層清液進行氣相色譜法(GC)分析。每個樣品應平行測定2次。原理：在堿性條件下，利用甲基叔丁基醚等有機溶劑提取煙草或煙草制品中的生物堿類物質(zhì)，通過氣相色譜—氫火焰離子化檢測器(GC-FID)定量分析4種生物堿的含量。

1.3.3 TSNAs含量的測定樣品均由上海煙草集團北京卷煙廠測定，測定方法：在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-MS/MS)法［SPE-LC：Spark Holland, Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500］。稱取1.0 g煙樣，將其放入50 mL錐形瓶中，加入40 μL 4種氘代TSNAs(內(nèi)標)溶液(5000 ng/mL)和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下用振蕩器(200 r/min)萃取60 min，萃取液過0.45 μm水相濾膜后，采用LC-MS/MS法測定煙葉的NNN、NNK、NAT和NAB含量，其含量之和為TSNAs總量。2020年樣品NAB的含量極低，均未被檢測到。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件制表繪圖，采用DPS 7.05軟件進行方差分析，顯著性檢驗用F檢驗法，多重比較采用LSD法。

2 結果與分析

2.1 不同調(diào)制方式對TSNAs形成和積累的影響

2.1.1 正常烘烤條件下TSNAs的形成和積累動態(tài)變化由圖1可知，2019年在正常烘烤條件下，葉片中各TSNAs及其總量隨著烘烤進程的推進而呈逐漸增加的趨勢，且各個時期間均存在顯著差異，在干筋階段TSNAs含量增加最多，增加量為78.13 ng/g；主脈中TSNAs含量低于葉片，在烘烤過程中TSNAs含量逐漸增加，變黃期、干葉期和干筋期分別增加了34.08、35.70和41.21 ng/g。

圖1 烤煙正常烘烤條件下TSNAs的形成和積累動態(tài)變化

2020年烤煙正常烘烤過程中葉片NNN、NAT、NNK、TSNAs總量不斷增加，且以干筋階段增加較多，為73.90 ng/g；主脈中各TSNAs的含量也隨著烘烤進程的推進而呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，但其含量整體低于葉片，TSNAs總量在干筋階段的增加量最大，為46.88 ng/g。

2.1.2 烤煙晾制條件下TSNAs的形成和積累動態(tài)變化由圖2可知，2019年在晾制條件下，各階段的葉片TSNAs含量均隨著晾制過程的推進而逐漸增加，且以變黃期增加較多，TSNAs總量增加了38.10 ng/g；干筋后的葉片TSNAs含量低于2019年正常烘烤干筋后的含量；晾制前鮮煙葉中主脈TSNAs含量低于葉片，但隨著晾制過程的推進，主脈TSNAs含量逐步增加，在變黃階段即表現(xiàn)出高于葉片的趨勢，變黃期TSNAs總量增加了186.11 ng/g，增加量是葉片的4.88倍，干筋后TSNAs總量是葉片的2.41倍。

圖2 烤煙晾制條件下TSNAs的形成和積累動態(tài)變化

2020年在晾制條件下，各階段的葉片TSNAs含量均隨著晾制過程的推進而持續(xù)增加，在煙葉變黃階段增加量較多，TSNAs總量增加了45.16 ng/g，干筋后葉片TSNAs總量相較于2020年正常烘烤干筋后的少了82.09 ng/g；主脈TSNAs含量自進入晾制條件后逐步增加，且在變黃期及變黃之后顯著高于葉片，大幅度增加主要發(fā)生在變黃階段，TSNAs總量的增加量是同時期葉片的3.83倍，而在變黃期之后增加量急劇下降。

2.1.3 烤煙先烤后晾條件下TSNAs的形成和積累動態(tài)變化由圖3可知，2019年葉片中各TSNAs含量及其總量總體上隨著調(diào)制過程的推進而逐漸增加，且在烘烤變黃階段的增加量較高，為56.44 ng/g，煙葉自干葉進入晾制條件后，葉片的NNN、NAT、TSNAs總量增加不顯著，干筋后葉片TSNAs總量相比于正常烘烤干筋后的少了82.33 ng/g。主脈中TSNAs含量略低于葉片，但主脈TSNAs含量隨著調(diào)制過程的推進也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，尤其以變黃階段的增加量最高，為47.08 ng/g，與葉片TSNAs總量在干筋期增加不顯著表現(xiàn)不一致的是，主脈在進入晾制條件后的干筋階段仍在增加，但其增加量比變黃階段的少。

圖3 烤煙先烤后晾條件下TSNAs的形成和積累動態(tài)變化

2020年葉片中各TSNAs含量及其總量在烘烤條件下隨著烘烤過程的推進而逐漸增加，大量增加的情況發(fā)生在變黃期，其中TSNAs總量增加了60.12 ng/g，而進入晾制條件后NNK和TSNAs總量增加不顯著，主脈中TSNAs含量的變化規(guī)律與葉片的表現(xiàn)基本一致，在變黃期TSNAs總量增加較多，為60.67 ng/g，各階段主脈TSNAs含量略低于葉片。先烤后晾調(diào)制結束后煙葉葉片和主脈的TSNAs總量均低于正常烘烤干筋后葉片和主脈的TSNAs總量。

2.2 調(diào)制方式對不同調(diào)制階段TSNAs積累比例的影響

2.2.1 不同調(diào)制方式下葉片TSNAs的積累比例由表1可知，在正常烘烤條件下，葉片TSNAs含量在變黃期、干葉期和干筋期3個階段的增加量逐漸升高，TSNAs總量在干筋期的增加量最高，而增加幅度則在變黃期最高。在晾制條件下，葉片中TSNAs總量的增加量及幅度均隨著晾制過程的推進而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，TSNAs總量在變黃期的增加量及幅度最高，干筋階段則最小。在先烤后晾條件下，葉片中TSNAs總量在變黃期的增加量及幅度最高，而在干葉期則呈現(xiàn)降低的趨勢，烘烤結束進入晾制階段后TSNAs總量幾乎不增加，NNN、NAB、NNK在干筋期甚至有下降的趨勢。

表1 不同調(diào)制方式下葉片TSNAs的積累比例

2.2.2 不同調(diào)制方式下主脈TSNAs的積累比例由表2可知，在正常烘烤條件下，主脈中TSNAs增加量在正常烘烤條件下3個階段均呈現(xiàn)升高的趨勢，TSNAs總量在干筋階段增加最多，而增加幅度則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在晾制條件下，主脈TSNAs增加量及幅度逐漸降低，在變黃期的增加量及幅度分別是正常烘烤的5.54、5.47倍，且遠高于同階段葉片的增加量及幅度。在先烤后晾條件下，主脈中TSNAs在變黃期增加量及幅度較高，在烘烤結束進入晾制階段的干筋期則較低。

表2 不同調(diào)制方式下主脈TSNAs的積累比例

2.3 烤煙葉片和煙梗煙草特有亞硝胺前體物的差異性分析

烤煙葉片和主脈在進入調(diào)制前的殺青樣中TSNAs的前體物（生物堿和硝酸鹽）含量如表3所示，2019年煙葉葉片中生物堿含量顯著高于主脈，生物堿總量是主脈的3.38倍；主脈硝酸鹽含量顯著高于葉片，是葉片的3.84倍。2020年煙葉葉片和主脈的生物堿和硝酸鹽含量差異與2019年表現(xiàn)一致，即葉片生物堿含量顯著高于主脈，總生物堿含量是主脈的3.51倍；主脈中硝酸鹽含量顯著高于葉片，是葉片的3.24倍。

表3 烤煙調(diào)制前葉片和煙梗中特有亞硝胺前體物含量的比較

3 討論

TSNAs是煙草生物堿與亞硝酸發(fā)生亞硝化反應生成并存在于煙葉和煙氣中的有害成分，在鮮煙葉中幾乎不存在，主要形成于調(diào)制和貯藏過程中。在白肋煙調(diào)制過程中，TSNAs的形成主要是由于常溫條件有利于微生物活動，促使硝酸鹽在硝酸鹽還原酶作用下還原成亞硝酸鹽，進而與生物堿發(fā)生反應而產(chǎn)生TSNAs，有研究認為［25］，明火調(diào)制過程中產(chǎn)生的氣態(tài)氮氧化物與烤煙TSNAs的形成密切相關。本研究表明，在正常烘烤條件下，烤煙前期TSNAs的增加量少，主要是由于烘烤過程短，煙葉失水快，高溫下大部分微生物活性較低［26］，不利于硝酸鹽在微生物作用下被硝酸還原酶還原生成亞硝酸，而生物堿對TSNAs形成的貢獻相對較大，由于葉片生物堿含量高于主脈，因而葉片的TSNAs含量高于主脈。葉片和主脈的TSNAs含量均在干筋期增加較多，這是由于硝酸鹽具有化學不穩(wěn)定性，葉片和主脈中的硝酸鹽在干筋期的高溫條件下產(chǎn)生了大量的氣態(tài)氮氧化物，進而促進了TSNAs的形成，由于主脈中硝酸鹽含量顯著高于葉片，導致干筋期主脈TSNAs含量的增加幅度更高。在晾制條件下，葉片和主脈TSNAs在變黃期增加量及幅度較高，這與溫度和變黃時間有關，相比于正常烘烤，晾制時的溫度低和變黃時間長，有利于微生物活動，促進了硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進一步與生物堿反應生成TSNAs，這與潘建斌等［21］的研究結果一致?？緹熢诹乐茥l件下，溫度低，失水慢，微生物活性較強，TSNAs含量明顯升高，加之主脈硝酸鹽含量顯著高于葉片，造成主脈的TSNAs在變黃期大量積累；干葉期和干筋期微生物活性逐漸減弱，煙葉水分逐漸散失，且在晾制條件下，溫度相對較低，不利于硝酸鹽產(chǎn)生氮氧化物，因此調(diào)制后期TSNAs生成較少?？緹熛瓤竞罅罈l件下，調(diào)制結束后的葉片和主脈TSNAs總量均低于正常烘烤，主要是由于進入晾制條件后的干筋階段，葉片和主脈TSNAs總量的增加量及幅度均顯著低于正常烘烤，前期正常烘烤溫度高，微生物活性弱，不利于TSNAs總量的生成，干葉后進入晾制條件煙葉水分大量減少，且溫度較低，不利于硝態(tài)氮產(chǎn)生氮氧化物，因而在變黃期和干筋期TSNAs的形成均較少。

TSNAs的形成始于調(diào)制階段，因此選用適當?shù)恼{(diào)制方式，控制調(diào)制過程中的反應條件對降低烤煙TSNAs含量是非常重要的。改變傳統(tǒng)的明火調(diào)制方式，采用熱交換式烤房，能減少氮氧化物與煙葉生物堿的反應，這是降低烤煙TSNAs含量的有效方式［27］。除了調(diào)制設備外，調(diào)制過程中的溫度、濕度、微生物等都會影響TSNAs的生成，烤煙烘烤過程中處于較高的溫度條件下，微生物活性弱，主要是高溫條件致使硝酸鹽產(chǎn)生的大量氣態(tài)氮氧化物與生物堿反應形成TSNAs，因此干筋期是烤煙TSNAs形成和積累的關鍵時期，通過控制烘烤后期環(huán)境、農(nóng)業(yè)和生物措施來降低煙葉和煙梗硝酸鹽含量是降低烤煙TSNAs含量的有效途徑之一。

4 結論

烤煙在正常烘烤時，葉片的TSNAs含量高于主脈，在干筋期的增加量較大，這可能與高溫低濕條件下硝態(tài)氮生成氣態(tài)氮氧化物有關；在晾制條件下，整體上主脈的TSNAs含量顯著高于葉片，變黃期TSNAs的形成和積累顯著高于烤制煙葉，干筋期則低于烤制煙葉；在先烤后晾條件下，葉片的TSNAs含量高于主脈，變黃期的TSNAs含量低于晾制煙葉，干筋期的TSNAs含量低于正常烘烤煙葉。因此，干筋期是降低烤煙TSNAs形成的關鍵時期。