稀土配合物分子印跡熒光探針的制備及檢測孔雀石綠的殘留

邵可滿，傅桂瑜，陳素艷，洪誠毅，林鄭忠，黃志勇

集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021

引 言

孔雀石綠(MG)是一種有效的水產(chǎn)養(yǎng)殖殺菌劑和寄生性殺菌劑[1]，作為治療真菌和原蟲感染的藥物，能起到驅(qū)蟲殺菌，延長魚類的存活時間的作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到廣泛應(yīng)用[2]。研究發(fā)現(xiàn)MG具有高殘留、高毒性，會產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等“三致效應(yīng)”[3]。但由于MG價格低廉且殺菌效果好，仍然有不少商家違法添加使用，近年來發(fā)生了多起MG殘留的食品安全事件，因此MG的日常檢測是非常有必要的。

目前常用于MG檢測的方法主要有高效液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[6]、以及表面增強拉曼光譜法(SERS)[7]。雖然這幾種檢測方法靈敏度高、選擇性好，但樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、儀器昂貴等缺點限制了這些方法的使用。因此尋找一種快速高效的MG檢測方法仍有十分重要的意義。

分子印跡聚合物(MIPs)是一種多孔隙材料，有特定的識別位點，對特定的目標(biāo)分子具有較強的識別功能[8]。由于其制備簡單，具有良好的化學(xué)性能、機械性能，在食品分析，化學(xué)傳感器和固相萃取等方面廣受人們的關(guān)注[9]。沉淀聚合法屬于非勻相溶液聚合，聚合物不溶于溶劑中，聚合物自發(fā)地從溶劑中沉淀出來，得到的聚合物微球粒徑小，形態(tài)均勻，不需要經(jīng)過研磨、過篩等特殊處理，可避免印跡位點的丟失，操作簡便。

以硅烷偶聯(lián)劑(KH570)改性的二氧化硅為核，Eu(MAA)3Phen為熒光物質(zhì)，隱形孔雀石綠(LMG)為模板，丙烯酰胺(AM)為功能單體，雙甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，2,2’-二偶氮異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，乙腈為溶劑，采用沉淀聚合法制備了MIP熒光微球。這也是國內(nèi)外首次用稀土配合物為熒光源制備MIP的研究報道。采用FTIR、熒光壽命等對熒光探針進(jìn)行了表征；考察了MIP和NIP的熒光性能、吸附性能、選擇特異性；考察了MIP與MG濃度的線性關(guān)系；將制備的MIP用于水產(chǎn)品中MG的加標(biāo)回收測定實驗中。結(jié)果表明，制備的熒光探針具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，能實現(xiàn)對MG的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑

甲基丙烯酸(MAA)、鄰菲羅啉(Phen)、氯霉素(CAP)、四環(huán)素(TC)、隱性結(jié)晶紫(LCV)、結(jié)晶紫(CV)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺噻唑(ST)、金氯素(CTC)、萘啶酸(NA)、隱色孔雀石綠(LMG)、乙二醇二甲基丙烯酸均購于(上海阿拉丁生化科技有限公司)；氧化銪、磺胺胍(SG)、磺胺嘧啶(SD)均購于(上海麥克林生化科技有限公司)；孔雀石綠、偶氮二異丁腈購于(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。丙烯酰胺購于(西隴化工有限公司)。試劑均為分析純。

1.2 儀器

瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國Horiba公司,FLS-980)；紫外-可見分光光度計(美國PerkinElmer公司,Lambda265)熒光分光光度計(美國PerkinElmer公司,LS55)；紅外光譜儀(美國ThermoFisherScientific,NicoletiS10)；磁力攪拌器(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司MS-H-Pro)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會社,JEM-2100)；垂直旋轉(zhuǎn)混合儀(杭州米歐儀器有限公司,VM-80)。

1.3 稀土熒光配合物Eu(MAA)3Phen的制備

稀土熒光配合物的制備參考文獻(xiàn)[10]的做法并加以改進(jìn):往0.35 g Eu2O3中加入20 mL濃鹽酸，加熱至出現(xiàn)晶膜，加入20 mL無水乙醇溶解，得到EuCl3無水乙醇溶液。在三口燒瓶中加入510 μL MAA、0.36 g Phen、20 mL無水乙醇，并用25%～28%氨水調(diào)節(jié)pH值約為7。攪拌下將EuCl3無水乙醇逐滴加入，升溫至60 ℃持續(xù)攪拌反應(yīng)4 h，靜置、抽濾后用乙醇洗滌沉淀數(shù)次，于50 ℃真空干燥8 h，得到白色固體粉末Eu(MAA)3Phen。

1.4 MIP@SiO2@Eu(MAA)3Phen的制備

往100 mL圓底燒瓶中加入5 mL乙腈，0.125 mmol LMG和0.75 mmol AM，超聲分散均勻后放置在4 ℃冰箱中預(yù)聚合2 h。隨后往上述溶液中加入15 mg稀土配合物，KH570處理過的SiO2微球60 mg，AIBN 50 mg和1.25 mmol交聯(lián)劑EGDMA，超聲30 s混合均勻后通入N220 min以除去溶液中的氧氣，隨后加入50 mg AIBN。在60 ℃水浴下磁力攪拌(1 000 r·min-1)反應(yīng)30 min，后將轉(zhuǎn)速調(diào)至800 r·min-1反應(yīng)5.5 h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾得到粗聚合物，將其置于乙醇∶乙腈=7∶3 (V∶V)混合液中索氏抽提，直至紫外分光光度計下無LMG檢出，得到聚合物MIP，將MIP干燥后備用。不加入模板的分子印跡聚合物(NIP)的合成過程除不加LMG外，其余步驟與MIP的制備一致。

1.5 熒光測試

往離心管中加入濃度為0.02 mg·L-1的配合物溶液2 000 μL，分別用含有MG的乙腈溶液和純乙腈定容到2 050 μL。控制狹縫為10 nm，在激發(fā)波長為270 nm下測定發(fā)射波長618 nm處的熒光強度，計算猝滅效率F0/F，F(xiàn)0為未添加MG時溶液的熒光強度，F(xiàn)為添加了MG后溶液的熒光強度。

1.6 加標(biāo)回收實驗

將5 g剁碎的魚肉加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸羥胺1.5 mL和0.05 mmol·L-1的乙酸銨溶液3.5 mL，勻漿5 min后，取1 g勻漿液，加入MG乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2 mL乙腈超聲提取5 min，于1 000 r·min-1離心5 min，收集提取液，重復(fù)2次，合并兩次提取液，將提取液用N2吹干，吹干后，用6 mL乙腈復(fù)溶，加入MIP，混勻于室溫下靜置20 min后，在270 nm激發(fā)波長下測定溶液的熒光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM

利用TEM表征了MIP，NIP和SiO2的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。由圖1可知:MIP，NIP和SiO2均呈球狀結(jié)構(gòu)，從圖1(c)中可以看出SiO2粒徑較小，以SiO2為核，采用沉淀聚合法合成MG的分子印跡聚合物，由圖1(a)和(b)可以看出，MIP和NIP的粒徑明顯比SiO2的粒徑大，可以說明稀土配合物Eu(MAA)3Phen已負(fù)載在SiO2的表面。

圖1 MIP(a),NIP(b)和SiO2(c)的透射電鏡圖Fig.1 TEM images of MIP(a),NIP(b)and SiO2(c)

2.2 紅外光譜分析

圖2 MIP和NIP的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of MIP and NIP

2.3 熒光壽命

熒光壽命的測量在FL980-STM穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀上進(jìn)行。測量加入10 μmol·L-1MG前后MIP的熒光壽命圖譜，按照式(1)進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。

(1)

式(1)中，A為背景，R(t)是對應(yīng)時間的MIP的熒光強度；τ1和τ2分別為MIP輻射和非輻射壽命。B1和B2是對應(yīng)的統(tǒng)計權(quán)重。平均熒光壽命(τav)根據(jù)式(2)計算。

(2)

式(2)中，τi是測量的壽命，Bi是統(tǒng)計權(quán)重的數(shù)值。

熒光壽命試驗結(jié)果如圖3所示，MIP的熒光壽命為1 094.11 μs，而加入MG后熒光壽命為587.49 μs。熒光壽命減少說明MG對MIP的猝滅屬于熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET[13]。這是因為MIP的熒光峰與MG的吸收峰重疊，且兩者以均相形式存在，熒光給體和受體的距離很短，因此可以發(fā)生顯著的FRET效應(yīng)。

圖3 加入MG前后MIP的熒光壽命圖譜Fig.3 Fluorescence lifetime mapping of MIPs before and after the addition of MG

2.4 選擇性

按照1.5的實驗方法，考察在2.5 μmol·L-1的SG，SD，SDM，CAP，TC，LCV，CV，CTC和NA乙腈溶液和MG乙腈溶液對MIP和NIP的熒光猝滅程度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同藥物對MIP和NIP的猝滅效率 (濃度為2.5 μmol·L-1)Fig.4 Quenching efficiency of MIP and NIP by different drugs (at a concentration of 2.5 μmol·L-1)

雖然這幾種物質(zhì)也能對熒光探針的熒光造成猝滅，但猝滅程度均低于MG，這是由于這些物質(zhì)的吸收波長與熒光探針的吸收峰的位置(618 nm)有不同程度的重疊，也能發(fā)生不同程度的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，特別是CV的重疊程度較大。由于NIP不存在印跡位點，CV和MG的猝滅程度相差不大，MG及其類似物的熒光均會下降；而在MIP中，CV的猝滅程度則小于MG，這是由于在MIP中存在能夠與MG特異性結(jié)合的印跡位點。

2.5 熒光響應(yīng)時間

在MIP和NIP中分別加入2.5 μmol·L-1MG-乙腈溶液，考察其在不同反應(yīng)時間下的熒光強度，同時以不加MG作為對照。由圖5可以看出，在不加入MG時，MIP和NIP的熒光強度保持相對穩(wěn)定，加2.5 μmol·L-1MG后，MIP和NIP的熒光強度在短時間內(nèi)迅速降低，并且在20 min后趨于穩(wěn)定。因此，實驗中選擇加入樣品20 min后再測量熒光值。

圖5 MIP和NIP的動力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curves of MIPs and Nips

2.6 MG標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別測定加入MG濃度為0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1，3，5，7，9，10，15和20 μmol·L-1時MIP的熒光強度，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯?，MIP在與MG發(fā)生熒光猝滅之后，熒光探針的發(fā)射峰波長位置沒有發(fā)生變化，說明熒光探針與MG之間是非輻射能量轉(zhuǎn)移[14]。MG與熒光探針之間的熒光猝滅符合Stern-Volmer方程[15]，F(xiàn)0/F=1+KSV[c]。其中，F(xiàn)0表示無MG時聚合物的熒光強度；F表示加入MG后聚合物的熒光強度；KSV為猝滅效率；c為MG的濃度。

圖6 MIP對MG熒光猝滅程度(插圖為MIP加入MG前后在365 nm紫外燈下的熒光圖

在優(yōu)化條件下，向聚合物乙腈溶液中加入不同濃度的MG乙腈溶液，20 min后分別測定加入MG前后的探針熒光強度，熒光光譜如圖6所示。以猝滅效率(F0/F)和MG濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)0/F與MG濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖7)，在低濃度下線性方程為F0/F=1.008c+0.344(0.1～1 μmol·L-1,R2=0.991)；在高濃度下線性方程為F0/F=0.587c+0.570 (1～20 μmol·L-1，R2=0.999)。檢出限為0.037 μmol·L-1(3σ/S，n=9)，因此實驗中所制備的聚合物MIP可用于實際樣品中MG的快速檢測。

圖7 F0/F與MG濃度線性關(guān)系Fig.7 Linear relationship between F0/F and MG concentration

2.7 加標(biāo)回收實驗

將MIP用于魚肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，實驗中MG加標(biāo)濃度為1，5和10 μmol·L-1，回收率結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，本方法對魚肉中MG的加標(biāo)回收率在95.61%～102.51%之間，相對偏差低于5.21%。

表1 不同方法檢測魚肉樣品中MG的回收率Table 1 Recovery of malachite green from fish meat samples detected by different methods

為了驗證方法的準(zhǔn)確性，利用國標(biāo)方法[16]對魚肉樣品進(jìn)行加標(biāo)檢測，回收率結(jié)果如表1所示。可以看出兩種檢測法的檢測結(jié)果相當(dāng)，國標(biāo)方法的加標(biāo)回收率在89.35%～113.51%之間，相對偏差低于6.17%。本方法的加標(biāo)回收率說明了本方法檢測魚樣中MG殘留具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

采用沉淀聚合法，以稀土熒光配合物為熒光光源，制備了一種孔雀石綠分子印跡聚合物，該聚合物熒光發(fā)射峰在618 nm，與MG的最大吸收波長匹配，兩者之間可以發(fā)生FRET效應(yīng)，因此配合物的熒光能被MG猝滅。聚合物對MG的線性范圍為0～20 μmol·L-1，線性方程為F0/F=1.008c+0.344 (0.1～1 μmol·L-1,R2=0.991)；F0/F=0.587c+0.570(1～20 μmol·L-1，R2=0.999)，檢出限為0.037 μmol·L-1。將其作為熒光探針應(yīng)用于魚肉中MG的檢測，加標(biāo)回收率在95.61%～102.51%范圍內(nèi)，本文創(chuàng)新性地以LMG為替代模板用于MG的檢測、首次以稀土配合物為熒光制備MG-MIP，使熒光探針對MG的檢測靈敏度進(jìn)一步提高。