梨黑斑病拮抗菌的篩選研究

侯曉杰 于占晶 梁魁景

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 071000）

梨黑斑病在我國普遍發(fā)生，其中以雪花梨和酥梨發(fā)病最為嚴(yán)重。該病主要是由真菌性鏈格孢菌(Alternaria alternate(Fr.)Keissl)感染所引起[1]。梨樹的開花期和幼果期都是梨黑斑病的潛在感染期，尤其是在貯藏期間最易感病，不易控制和預(yù)防[2]。這對我國梨產(chǎn)業(yè)和出口商造成了嚴(yán)重的威脅[3]。

目前，我國生產(chǎn)上防治梨黑斑病主要是使用化學(xué)防治方法和物理防治方法。化學(xué)防治易造成生態(tài)失衡，提高某些病蟲害對藥劑的抵抗力，降低防治效果，危害人畜健康，給生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[4，5]。物理防治環(huán)境安全性高，但是效率低，不易徹底清除病菌，防治效果十分有限，因此迫切需要找到一種防治梨黑斑病的新技術(shù)。

生物防治[6]是近年來備受推崇的一種預(yù)防病蟲害的新型防治方法，其特點(diǎn)是不會對環(huán)境造成污染，安全高效，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，同時不會使病蟲害產(chǎn)生抗藥性，促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。植物內(nèi)生菌是一種能在植物體內(nèi)生存的微生物，可以與植物互利互生[7]。目前，我國已經(jīng)有關(guān)于植物內(nèi)生菌對梨黑斑病菌的抑制作用的研究，如吳慧昊[7]等在花椒提取物對蘋果梨采后黑斑病的抑制的研究中發(fā)現(xiàn)，花椒提取物對梨黑斑病菌有直接的抑制作用。高小寬[8]等在三七提取物對儲藏期梨黑斑病的防治研究中發(fā)現(xiàn)，三七提取物可以明顯抑制梨黑斑病在果園的擴(kuò)大，降低了梨黑斑病菌對果實(shí)的侵染。龍飛[9]、梁魁景[10]等研究了姜提取物對儲藏期梨黑斑病病菌孢子和菌絲的抑制作用，發(fā)現(xiàn)姜提取物對梨黑斑病菌也有較好的防治效果。我國地大物博，生物資源豐富，最適合研究植物源農(nóng)藥[11]，開發(fā)植物源農(nóng)藥市場前景十分可觀，現(xiàn)已成當(dāng)下研究的熱點(diǎn)[12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。細(xì)菌(P2、ZJ01、J4、J5、J6、T4和T7)、真菌(梨黑斑病菌)均由衡水學(xué)院園林植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 梨黑斑病菌的活化。于滅菌超凈工作臺上，挑取4℃低溫下試管內(nèi)保存的梨黑斑病菌接種至事先制備的PDA平板上，置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，觀察病原菌的生長情況并備用。

1.2.2 細(xì)菌的活化培養(yǎng)。采用平板劃線法。將-28℃冰箱甘油中保存的7種細(xì)菌(J4、J5、J6、T4、T7、P2、ZJ01)采用“之”字劃線法接種在NA平板上，倒置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d備用。

1.2.3 梨黑斑病菌菌絲生長抑制試驗(yàn)。采用對峙培養(yǎng)法。于超凈工作臺上，用0.6 cm打孔器打取梨黑斑病菌邊緣制作菌餅，將其倒置接種至PDA平板中央；在距菌餅中心3 cm處，左右分別畫線接種測試拮抗菌株，每處理設(shè)3個重復(fù)，同時設(shè)置空白對照。28℃恒溫下培養(yǎng)4～5 d，觀察菌落生長情況。用十字交叉法測量病菌菌落生長直徑。

1.2.4 梨黑斑病菌孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)。孢子懸浮液的制備：梨黑斑病菌置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)10 d左右，使其產(chǎn)生大量孢子。超凈工作臺上，利用接種環(huán)刮取平板表面孢子到無菌水三角瓶中，用4層濾紙過濾，密封，充分震蕩三角瓶使孢子懸液混勻。在顯微鏡下觀察孢子個數(shù)，使其稀釋成每視野50個左右的孢子的懸浮液，備用。采用抑菌圈法測定孢子萌發(fā)抑制情況。取100μl病菌孢子懸浮液置于PDA平板上，用玻璃刮環(huán)將其涂抹均勻，超凈工作上晾干備用，用10mm打孔器在細(xì)菌培養(yǎng)平板上打孔，再用接種鏟將其倒扣接種到PDA平板中央。放置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后用十字交叉法測定細(xì)菌對孢子萌發(fā)的抑制情況。孢子萌發(fā)抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析。應(yīng)用Excel軟件來進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，采用SPSS 16.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析不同細(xì)菌菌株對梨黑斑病菌抑制效果的差異性，顯著性水平為5%(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲生長速率的影響。如圖1所示，48 h后連續(xù)5 d測量病原菌菌落直徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7種細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲均有一定的抑制作用。根據(jù)圖1判斷，從第3 d開始，7種細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲生長均有抑制作用，且隨著時間的推移，抑制作用越來越明顯。對7種菌株進(jìn)行分析可知，P2抑制效果最好，其次為T7、T4，J4、J6和ZJ01抑制效果較差。對同一菌株分析不同時刻的數(shù)據(jù)可知，即使在抑菌效果較好的細(xì)菌平板上，病原菌菌落直徑仍表現(xiàn)出增長的發(fā)展趨勢，拮抗細(xì)菌并未完全抑制病菌的生長，所以推斷，拮抗細(xì)菌的使用時間以提早為好。

圖1 7種細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲生長速率的影響

2.2 7種細(xì)菌對梨黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。試驗(yàn)中抑菌圈直徑越小，抑菌率越高，說明細(xì)菌對其的抑制效果越好，各細(xì)菌的抑菌效果見表1。由表1中7種細(xì)菌在同一濃度下對梨黑斑病菌絲生長的抑制研究可知，T7菌株對梨黑斑病病菌孢子萌發(fā)的抑制效果明顯，梨黑斑病菌菌落的平均直徑為39 mm，抑菌率為48.92%；其次是P2與J5，抑制率分別為46.23%和45.03%，二者無顯著差異；ZJ01、T4和J6抑菌效果無明顯差異，抑菌效果中等，抑菌率分別為44.86%、44.83%和44.06%三者差異不顯著；抑制效果最差的是J4，平均抑制率僅為38.26%。

表1 7種細(xì)菌對梨黑斑病菌的抑制作用

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)采用J4、J5、J6、T4、T7、P2、ZJ01等7種細(xì)菌進(jìn)行梨黑斑病拮抗菌篩選研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示，T7對梨黑斑病菌落生長抑制效果最好，抑制率高達(dá)48.92%，且與其他細(xì)菌的拮抗效果有顯著性差異。本次試驗(yàn)僅僅選用了7種細(xì)菌作為研究材料，但我國資源豐富，希望此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為以后梨黑斑病防治提供一定的理論基礎(chǔ)。本次試驗(yàn)研究的細(xì)菌對梨黑斑病菌都有一定的抑制效果，其中T7是從蘋果樹根際土壤中分離到的細(xì)菌，大多數(shù)根際微生物產(chǎn)生的多種抗菌類和酶類，抗菌效果均較好，對植物和人沒有危害。此次試驗(yàn)為進(jìn)一步研究生物制劑防治梨黑斑病菌奠定了一定基礎(chǔ)。