NAIF1對(duì)胃癌細(xì)胞中IFIT家族蛋白的影響

張巧，黃常志，祝建疆，李燕，趙玫，李可心，李東東，戚紅，黃聲凱

0 引言

胃癌是我國常見的消化道腫瘤之一，是全球第五常見癌癥，也是引起全球癌癥死亡的重要原因之一。2018年全球統(tǒng)計(jì)顯示，胃癌新發(fā)病例103萬人，癌癥死亡率中，胃癌位居第二[1]。盡管數(shù)十年來胃癌亞洲年齡標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)病率已經(jīng)出現(xiàn)降低的趨勢，但是隨著人口老齡化的加劇，胃癌的發(fā)病率和死亡率正逐年增高[2-5]。在我國，胃癌已經(jīng)成為第三常見癌癥[6]。核誘導(dǎo)凋亡因子（nuclear apoptosis-inducing factor 1,NAIF1）作為凋亡因子首次在宮頸癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[7]，隨后其被報(bào)道在包括胃癌[8-10]、肺癌[11]、前列腺癌[12]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[13]以及骨肉瘤[14]等多種人類癌癥中起到抑瘤作用。其中，NAIF1在胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)，NAIF1通過MAPK信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[9]，通過caspase-9信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡[8]。不僅如此，NAIF1還可以通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的生長[10]。探索胃癌細(xì)胞中NAIF1在基因及蛋白水平所引起的變化，為胃癌的治療提供研究基礎(chǔ)具有重要意義。本研究通過對(duì)過表達(dá)NAIF1的胃癌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測，尋找NAIF1的相關(guān)因子并探討其相互作用，以期為胃癌的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞系MKN45培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，上述材料均購自美國Gibco公司。置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及處理

將生長狀態(tài)良好的MKN45細(xì)胞以1×106個(gè)每毫升濃度接種于6孔板，置常規(guī)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長約60%時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后加入強(qiáng)力霉素（Dox）至終濃度為6 μg/μl，加藥處理0、6、12、24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行觀察，其中加藥后0 h細(xì)胞記為空白對(duì)照組。

1.3 感受態(tài)菌株

DH5:Genotype:supE44Δ lacU169 (Φ80 lacZΔM15) hsdR17 recAl endA1 gyrA96 thi-1 relA1和Turbo Competent E.coli:F'proA+B+lacIqΔlacZM15/fhuA2 Δ (lac-proAB) glnV galK16 galE15 R (zgb-210 ::Tn10) TetS endA1 thi-1 Δ (hsdS-mcrB)5均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 質(zhì)粒

Tet-on系統(tǒng)質(zhì)粒pLVX-Tight-Flag-NAIF1-puro帶有Flag標(biāo)簽，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

qRT-PCR技術(shù)用于IFIT1/2/3/5基因表達(dá)量的檢測，PCR引物由Thermo北京分公司合成，其中IFIT1上游引物為：5'-GCGCTGGGTATGCGATC TC-3'，下游引物為：5'-CAGCCTGCCTTAGGG GAAG-3'；IFIT2上游引物為：5'-GACACGGTT AAAGTGTGGAGG-3'，下游引物為：5'-TCCAG ACGGTAGCTTGCTATT-3'；IFIT3上游引物為：5'-AATGGAGATCTGCTGCAAGCAGC-3'，下游引物為：5'-TGGCCCATTTCCTCACTACCATC-3'；IFIT5上游引物為：5'-ACAAGTTGGAGTGTCCT GAGA-3'。以GAPDH為內(nèi)參照，其上游引物為：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，下游引物為：5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。

1.6 表達(dá)譜芯片選取

表達(dá)譜芯片采用Agilent公司的Human Gene Expression v3.0（8*60K），該款芯片包含約26 083條Entrez Gene RNAs（unique）及30 606條lncRNAs（unique）。mRNA探針設(shè)計(jì)參照數(shù)據(jù)庫為：RefSeq Build 66、Ensemble Release 76、Unigene Build 236、GenBank（Aug 2014）。ncRNA探針設(shè)計(jì)主要來源數(shù)據(jù)庫為：LNCipedia Version 2.1、Broad Institute Human lincRNA catalog（Nov 2011）、Broad Institute TUCP transcripts catalog（Nov 2011）。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)

適量細(xì)胞裂解液提取轉(zhuǎn)染相應(yīng)時(shí)間的細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測定總蛋白濃度，以GAPDH蛋白為內(nèi)參調(diào)平蛋白總量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉30 min，洗膜，加入相應(yīng)一抗，其中GAPDH抗體、IFIT1抗體和Flag抗體購自Cell Signaling Technology公司，IFIT2、IFIT3和IFIT5抗體則均為Abcam公司產(chǎn)品，孵育過夜，加入相對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶表達(dá)的二抗，顯色后處理。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用SNK檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLVX-Tight-Flag-NAIF1-puro后NAIFI的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，MKN45細(xì)胞系轉(zhuǎn)染NAIF1后，0、6、12和24 h的NAIF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.007、386.8±8.338、456.3±7.130和718.0±9.705。與0 h相比，轉(zhuǎn)染6、12、24 h后NAIFI mRNA水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.0001）。轉(zhuǎn)染6、12、24 h后NAIF1 mRNA水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見圖1。提示在MKN45細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NAIF1后能夠在mRNA水平提高外源性NAIF1的水平。

2.2 基因表達(dá)譜差異數(shù)據(jù)生物學(xué)分析結(jié)果

MKN45細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染NAIF1后，分別從GO方向的生物過程、細(xì)胞組成、分子功能及KEGG信號(hào)通路方向?qū)Σ町惢蜻M(jìn)行注釋，其中免疫相關(guān)生物過程差異基因有較多富集，見圖2。

2.3 MKN45細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染NAIF1的24 h內(nèi)基因表達(dá)譜分析

結(jié)果表明，與0 h對(duì)比，過表達(dá)NAIF1的MKN45細(xì)胞系中IFIT1、IFIT2、IFIT3的表達(dá)量在24 h時(shí)明顯增大（斜率k分別為0.20、0.15、0.11），與NAIF1表達(dá)量呈正相關(guān)；IFIT5的表達(dá)量隨時(shí)間的增加無明顯變化，見圖3。結(jié)果提示MKN45細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NAIF1能夠促進(jìn)IFIT家族部分蛋白在mRNA水平的表達(dá)。

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證IFIT家族蛋白mRNA水平的表達(dá)

為了驗(yàn)證上述基因表達(dá)譜的結(jié)果，以相同方法收集0、6、12、24 h細(xì)胞，通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證IFIT家族蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與芯片雜交結(jié)果相一致，IFIT1、IFIT2、IFIT3的基因mRNA水平24 h時(shí)有增加的趨勢，且與12 h相比，24 h時(shí)，IFIT1、IFIT2、IFIT3 mRNA水平有明顯增加（P<0.0001），IFIT5家族mRNA水平表達(dá)則無明顯變化，且與12 h相比，24 h的IFIT5表達(dá)水平反而降低，見圖4。

2.5 Western blot檢測IFIT家族蛋白水平的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，用Western blot 檢測其蛋白水平表達(dá)與否及其差異。胃癌細(xì)胞系MKN45中，以轉(zhuǎn)染Flag-NAIF1的0 h為對(duì)照，以GAPDH蛋白為內(nèi)參照，6、12和24 h后NAIF1蛋白表達(dá)水平增加，證明轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)成功。繼而觀察IFIT家族蛋白的變化，其中與轉(zhuǎn)染0 h比較，轉(zhuǎn)染6、12和24 h后IFIT1，IFIT2以及IFIT3蛋白表達(dá)量增加，而IFIT5蛋白表達(dá)量無變化，見圖5。

3 討論

腫瘤的形成是在大量蛋白因子及信號(hào)通路的參與下引起細(xì)胞增殖與凋亡過程失衡的結(jié)果[15]，在其形成過程中，許多基因起到了重要的調(diào)節(jié)作用，其中包括信號(hào)通路[16]、細(xì)胞周期與凋亡[17]及細(xì)胞增殖與凋亡基因[18]等。因此，探討癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找基于分子水平上的治療靶點(diǎn)，促進(jìn)癌癥治療領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用，可為后續(xù)癌癥基礎(chǔ)機(jī)制研究和疾病治療提供可能的指導(dǎo)方向。

本研究通過在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)外源性NAIF1蛋白并做基因表達(dá)譜芯片檢測，篩選與之作用的蛋白因子，進(jìn)一步通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證其對(duì)細(xì)胞生長相關(guān)的蛋白分子的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)NAIF1蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)蛋白（IFIT）家族的部分蛋白的表達(dá)，提示NAIF1可能與IFIT家族蛋白有相互關(guān)聯(lián)，根據(jù)上述結(jié)果推測NAIF1或許通過與IFIT蛋白相互作用起到調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞發(fā)展的作用，此部分研究有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

IFIT家族蛋白與癌癥發(fā)展有重要的聯(lián)系，NAIF1作為凋亡誘導(dǎo)因子，本研究結(jié)果表明，過表達(dá)NAIF1促進(jìn)IFIT1、IFIT2及IFIT3內(nèi)源性分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，基于此結(jié)果，推測NAIF1通過促進(jìn)IFIT家族蛋白的表達(dá)抑制癌癥細(xì)胞發(fā)展。有研究表明，IFIT2的表達(dá)降低能夠提高癌癥轉(zhuǎn)移率[19]，高表達(dá)IFIT2蛋白與患者存活率呈正相關(guān)[20]，在細(xì)胞水平的研究結(jié)果表明IFIT1和IFIT3具有促進(jìn)腫瘤侵襲的作用[21]，另外，IFIT家族不同蛋白之間是否有協(xié)同或者競爭的關(guān)聯(lián)未見研究報(bào)道。因此，NAIF1在胃癌中細(xì)胞水平的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。此方向的研究可為NAIF1的分子靶向治療提供一定的理論依據(jù)，有望成為胃癌患者治療的一個(gè)新指標(biāo)。