生活飲用水中總大腸菌群多管發(fā)酵法與紙片法檢測(cè)方法比較

王鋒 劉婷

（濟(jì)南鐵路疾病預(yù)防控制中心 山東濟(jì)南 250001）

1 前言

“總大腸菌群”按照GB/T5750.12-2006國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的術(shù)語和定義是指一群在37℃培養(yǎng)24 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。生活飲用水中總大腸菌群主要來自人和溫血?jiǎng)游锛S便，還可能來自植物和土壤，總大腸菌群是評(píng)價(jià)飲用水衛(wèi)生質(zhì)量重要微生物指標(biāo)之一，可以指示腸道傳染病傳播的可能性[1]，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。目前我國(guó)現(xiàn)行的生活飲用水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T5750.12-2006檢測(cè)方法是：多管發(fā)酵法、濾膜法與酶底物法。大部分疾控中心所使用的方法都是多管發(fā)酵法。2015年國(guó)家環(huán)境保護(hù)部發(fā)布中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)（HJ755-2015）將紙片法做為水質(zhì)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。現(xiàn)將多管發(fā)酵法與紙片法測(cè)定水中大腸菌群方法比較如下：

2 試劑與儀器

2.1 試劑

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，革蘭氏染色液（多管發(fā)酵法所用培養(yǎng)基等均來自廣東環(huán)凱）；總大腸菌群測(cè)試紙片（廣東達(dá)元綠洲）；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（ATCC25922）陰溝腸桿菌（ATCC13047）、弗氏檸檬酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC43864）金黃色葡萄球菌ATCC25923枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）（所有標(biāo)準(zhǔn)菌株均來自廣東環(huán)凱）。

2.2 儀器設(shè)備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱（上海一恒），生物安全柜（力新儀器），顯微鏡（日本奧林巴斯）。

3 實(shí)驗(yàn)方法原理

3.1 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法測(cè)定水中總大腸菌群，將水樣接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，36±1℃培養(yǎng)24±2 h，進(jìn)行初發(fā)酵，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣則可報(bào)告為總大腸菌群陰性。如有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的發(fā)酵管則將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，于36±1℃培養(yǎng)18~24 h，挑選深紫黑色、具有金屬光澤或紫黑色、不帶或略帶金屬光澤及淡紫紅色、中心較深的特征菌落作革蘭氏染色，鏡檢。經(jīng)染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時(shí)接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2 h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。根據(jù)證實(shí)為總大腸菌群陽性的管數(shù)，再通過查MPN表，就可得出相應(yīng)的總大腸菌群的濃度值[2]。

3.2 紙片法

將一定量的水樣以無菌操作的方式接種到水質(zhì)大腸菌群紙片上，37℃（測(cè)定總大腸菌群）或44.5℃（測(cè)定耐熱大腸菌群或糞大腸菌群）培養(yǎng)24 h，利用總大腸菌群在生長(zhǎng)繁殖時(shí)，產(chǎn)酸使pH值降低，使紙片中的指示劑溴甲酚紫指標(biāo)劑由紫色變黃色，同時(shí)，產(chǎn)氣過程相應(yīng)的脫氫酶在適宜的pH范圍內(nèi)，催化底物脫氫還原紙片中的TTC形成紅色的不溶性的三苯甲臜（TTF），使藍(lán)色的紙片背景下形成黃色并顯示出紅色斑點(diǎn)（或紅暈）。通過上述指示劑的顏色變化就可對(duì)是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作出判斷，從而確定是否有總大腸菌群存在。再通過查相應(yīng)MPN表，就可得出相應(yīng)的總大腸菌群的濃度值[3]。

3.3 特異性試驗(yàn)

一般認(rèn)為總大腸菌群包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等[4]。用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（ATCC25922）陰溝腸桿菌（ATCC 13047）、弗氏檸檬酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC43864）作為陽性對(duì)照菌株；金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）作為陰性對(duì)照菌株，各菌株選擇1~2個(gè)合適稀釋度分別用紙片法與多管發(fā)酵法測(cè)定，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

3.4 樣品檢測(cè)

為保證2種方法對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果的精確性和方便統(tǒng)計(jì)，水樣必需要有一定的陽性檢出率，同時(shí)樣本的MPN值應(yīng)盡量控制在100 MPN/100 ml以下，以10~30 MPN/100 ml為宜[5]。用2種方法的平行測(cè)定。

3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel軟件和SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)果與分析

4.1 適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，多管發(fā)酵法與紙片法對(duì)總大腸菌群的陽性菌株結(jié)果均為陽性，陰性對(duì)照菌株結(jié)果均為陰性。說明紙片法測(cè)定水中總大腸菌群具有很好的適用性，與多管發(fā)酵法在適用性上一致，詳見表1。

表1 多管發(fā)酵法與紙片法對(duì)的適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果

4.2 多管發(fā)酵法與紙片法檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)64份樣本進(jìn)行總大腸菌群檢測(cè)結(jié)果見圖1。多管發(fā)酵法檢出總大腸菌群55份，檢出率為85.9%（55/64）；紙片法檢出總大腸菌群53份，檢出率為82.8%（53/64），2種方法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.237，P=0.6264）（見表2）。2種方法檢測(cè)報(bào)告結(jié)果，均檢出總大腸菌群51份，檢出符合率為92.7%（51/55），均未檢出7份，未檢出符合率為77.8%（7/9）；差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)χ2=0.167，P=0.688），見表2。

表2 多管發(fā)酵法與紙片法總大腸菌群檢出率情況

表3 多管發(fā)酵法與紙片法檢測(cè)總大腸菌群結(jié)果比較（配對(duì)χ2檢驗(yàn)）

4.3 微生物檢測(cè)

數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，按其統(tǒng)計(jì)學(xué)分析要求，其檢測(cè)結(jié)果全部經(jīng)對(duì)數(shù)（以10為底）轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析[3]。多管發(fā)酵法與紙片法兩種方法的配對(duì)變量統(tǒng)計(jì)描述見表4，配對(duì)間的相關(guān)性分析見表5，通過表5可以看出，2種方法的相關(guān)系數(shù)R=0.825，P=0.00；R值趨近于1，說明2組數(shù)據(jù)具有相關(guān)性，且說明2組數(shù)據(jù)的相關(guān)性趨于一致。由表6線性回歸可見，檢測(cè)結(jié)果Sig=0.156，回歸系數(shù)t檢驗(yàn)t=1.434，說明2種方法檢測(cè)水中總大腸菌群沒有顯著差異。

表4 紙片法與多管發(fā)酵法統(tǒng)計(jì)描述

表6 多管發(fā)酵法與紙片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性回歸

5 討論

通過以上試驗(yàn)結(jié)果表明，紙片法與多管發(fā)酵法相比較，在適用性上兩者無差異，均可檢測(cè)水中總大腸菌群。通過2種方法對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果分析其檢測(cè)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異也無顯著性；2種方法檢測(cè)數(shù)據(jù)線性相關(guān)，且相關(guān)性趨于一致，通過回歸分析兩種方法沒有顯著性差異，具有等效性?，F(xiàn)行的《生活飲用水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》（GB/5750.12-2006）中主要方法為多管發(fā)酵法與濾膜法及酶底物法，還沒有紙片法。多管發(fā)酵法準(zhǔn)備工作繁瑣，要配制多種培養(yǎng)基，所需設(shè)備也較多，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要72 h才能出結(jié)果；而紙片法所需培養(yǎng)基少，基本不需要準(zhǔn)備工作，24 h就可以出結(jié)果。紙片法具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、省力的特點(diǎn)，對(duì)于大批量水樣品及應(yīng)急突發(fā)事件中的總大腸菌群的檢測(cè)，能夠更快捷、更準(zhǔn)確的報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，所以可以將紙片法可以做為生活飲用水的一種檢測(cè)方法寫進(jìn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。