超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽的含量

王娟 劉阿靜 王新潮 張曉美 王波

（蘭州海關(guān)技術(shù)中心 甘肅蘭州 730030）

1 前言

高氯酸鹽和氯酸鹽均具有極強(qiáng)的氧化性，在航空航天業(yè)的固體推進(jìn)劑、炸藥和煙火制造方面被廣泛作為氧化劑使用[1-2]。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)生產(chǎn)方面使用的高氯酸鹽和氯酸鹽越來越多，而高氯酸鹽的正四面體結(jié)構(gòu)使其具有高度的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的遷移性，加之其極易溶于水，因此極易造成土壤及地下水污染，隨著土壤和水被植物吸收，高氯酸鹽開始富集進(jìn)入人體[3]。

氯酸鹽是消毒過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，進(jìn)入人體后會引起血液學(xué)反應(yīng)，損害紅細(xì)胞以影響血氧的運(yùn)輸功能。高氯酸鹽的分子結(jié)構(gòu)與碘分子相似，因此可以阻止甲狀腺對碘的吸收，導(dǎo)致甲狀腺激素T3和T4的合成量減少[4]，影響甲狀腺功能[5-6]，干擾人體的新陳代謝。有研究報道，在水果、蔬菜、大米、茶葉、飲用水、飼料、畜禽肉及其副產(chǎn)品等農(nóng)產(chǎn)品中均有高氯酸鹽和氯酸鹽的檢出[7-13]，由此可見氯酸鹽、高氯酸鹽在農(nóng)產(chǎn)品中已廣泛存在，而這種現(xiàn)象的產(chǎn)生與土壤、灌溉水資源具有密切聯(lián)系。2020年5月25日，歐盟委員會發(fā)布（EU）2020/685號條例，修訂高氯酸鹽在部分食品中的最大殘留限量。而我國對于氯酸鹽、高氯酸鹽污染的研究尚處在起步階段，無土壤中氯酸鹽和高氯酸鹽檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，缺乏系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)。因此，建立環(huán)境樣品（如水體、土壤）中氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測方法刻不容緩。

目前，氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測方法主要有拉曼光譜法[14]、分光光度法[15]、離子色譜法[16-18]、離子色譜-質(zhì)譜法[19]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[20]等。其中，拉曼光譜法需使用金、銀等作為基底，檢測成本極高；分光光度法常需使用有毒試劑，安全隱患大，且操作復(fù)雜、重現(xiàn)性差；離子色譜法常會受到其他共存離子的干擾，易出現(xiàn)假陽性，靈敏度較低；離子色譜-質(zhì)譜法在樣品處理過程中常需添加酸、堿及鹽，而質(zhì)譜儀接口對酸、堿及金屬鹽的耐受性較差，需增加專業(yè)抑制器組件或手動去酸、堿及鹽，造成檢測成本和工作量的增加，易因人為操作不當(dāng)造成對儀器設(shè)備的損害。

本文采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測水體和土壤樣品中的高氯酸鹽和氯酸鹽，用內(nèi)標(biāo)法定量，并將所建立的方法用于100批環(huán)境樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測，以期為環(huán)境中高氯酸鹽和氯酸鹽的監(jiān)測及標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 6460C，配有電噴霧離子源ESI）；離心機(jī)（美國SIGMA，3K30）；渦旋儀（逗點(diǎn)生物，BC-1000）；分析天平（德國Sartorius，BSA822）。

甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲酸（德國默克，色譜純）；乙酸、甲酸銨、乙酸銨（國藥集團(tuán)，分析純）；超純水（屈臣氏）；高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院，1000μg/mL）；高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（HCLO4-O4）、氯酸鹽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（ClO3-18O13）（ANPEL，100μg/mL）；HLB固相萃取柱（3cc，60 mg）。

樣品來源：100批環(huán)境樣品，部分按照《HJ/T 166-2004》、《HJ 25.2-2014》和《HJ/T 91-2002》自行采樣，部分由隴南市祥宇油橄欖開發(fā)有限責(zé)任公司提供。其中，水體樣品50批，隨機(jī)在蘭州市轄區(qū)不同區(qū)域、不同河道自行采樣30批，隴南市祥宇油橄欖開發(fā)有限責(zé)任公司提供20批，采樣地點(diǎn)包含隴南市及其各鄉(xiāng)鎮(zhèn)，樣品涵蓋生活飲用水、農(nóng)田灌溉水；土壤樣品50批，自行采樣40批，采樣地點(diǎn)遍布大棚蔬菜種植土壤、旱地糧食作物種植土壤、河邊泥土，隴南市祥宇油橄欖開發(fā)有限責(zé)任公司提供10批不同橄欖果樹種植基地及附近土壤。

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Acclaim Trinity P1復(fù)合離子交換柱（50 mm×2.1 mm，3μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL；流速：0.3 mL/min；流動相A：20 mmol/L甲酸銨，B相：乙腈；梯度洗脫程序：0~0.5 min，A為65%；0.5~4 min，A從65%下降至40%，4~5 min，A從40%下降至10%；5~6 min，A為10%；6~7 min，A從10%上升至65%；7~10 min，A保持65%不變。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子ESI（-）；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：10 I/min；霧化氣壓力：45psi；毛細(xì)管電壓：3.5 KV；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流量：5 I/min；噴嘴電壓：1 000 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式采集數(shù)據(jù)，具體參數(shù)見表1。

表1 高氯酸鹽和氯酸鹽定性、定量離子對和質(zhì)譜分析參數(shù)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確吸取100μL高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 mg/L），用超純水定容至100 mL，配制成1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃保存。

氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確吸取100μL高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg/L），用超純水準(zhǔn)確定容至10 mL，配制成1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃保存。

高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)（HClO4-O4）、氯酸鹽內(nèi)標(biāo)（CLO3-18O13）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確吸取100μL高氯酸鹽、氯酸鹽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg/L），用超純水定容至10 mL，配制成1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃保存。

高氯酸鹽、氯酸鹽混標(biāo)工作曲線：分別配制高氯酸鹽濃度為：0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100μg/L，氯 酸 鹽 濃 度 為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中高氯酸鹽和氯酸鹽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度均為2μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 樣品的前處理

2.5.1 水體樣品

準(zhǔn)確移取980μL試樣，加入20μL高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)（HClO4-O4）、氯酸鹽內(nèi)標(biāo)（CLO3-18O13）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/L）；渦旋混勻，過0.22μm水系濾膜，待測。

2.5.2 土壤樣品

稱取土壤樣品（自然風(fēng)干，縮分，過0.25 mm篩）2.00 g于50 mL離心管中；加入50μL高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)（HClO4-O4）、氯酸鹽內(nèi)標(biāo)（CLO3-18O13）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.00 mg/L）；加入25 mL 0.2%乙酸水，高速渦旋5 min；加入5 mL二氯甲烷，渦旋1 min；10 000 r/min離心5 min；取上清5 mL過HLB固相萃取柱（預(yù)先用6 mL的超純水和6 mL甲醇活化）凈化，前2 mL流出液棄去；過0.22μm水系濾膜，待測。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤樣品前處理優(yōu)化

3.1.1 提取時間的優(yōu)化

本試驗考察1、2、5、10 min這4個不同的提取時間對提取效率的影響，從圖1可以看出，隨著提取時間的增加，高氯酸和氯酸鹽的回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；當(dāng)提取時間為5 min時，高氯酸鹽和氯酸鹽的添加回收率最高；當(dāng)提取時間從5 min增加至10 min時，回收率明顯降低。由此可知，提取時間為5 min時，目標(biāo)化合物已經(jīng)得到充分提取，本文最終選擇高速渦旋5 min作為土壤樣品的提取時間。

3.1.2 提取溶劑的優(yōu)化

本文分別考察0.2%乙酸水溶液、甲醇、1%甲酸乙腈溶液、乙腈和50%乙腈水溶液作為提取溶劑時，高氯酸和氯酸鹽回收率的變化。從圖2可以看出，乙酸水溶液和乙腈作提取溶劑時，二者的提取率在整體上明顯優(yōu)于甲醇；當(dāng)用乙腈和0.2%乙酸水溶液提取時，二者的回收率響應(yīng)值最高；用乙腈提取時二者的回收率分別為90%和91%，0.2%乙酸水提取時二者的回收率分別為88%和93%。由此可見，2種提取溶劑均能滿足試驗要求，從節(jié)約成本及試劑安全性方面考慮，本文最終選擇0.2%乙酸水溶液作為提取試劑。

3.1.3 土壤樣品中提取試劑加入次序的優(yōu)化

本文重點(diǎn)考察樣品中提取試劑添加次序的影響：一組土壤樣品中先加入5 mL二氯甲烷，再加入25 mL 0.2%的乙酸溶液；另一組土壤樣品中先加入25 mL 0.2%的乙酸溶液，再加入5 mL二氯甲烷，其它測試條件不變。由檢測結(jié)果可知，先加入提取試劑二氯甲烷時，土壤樣品中目標(biāo)物的添加回收率僅為30%，后加入二氯甲烷時，樣品中目標(biāo)物的回收率均高于80%。

分析原因可能為：二氯甲烷具有較強(qiáng)的滲透性，能夠快速滲透在土壤樣品中將目標(biāo)物包裹；二氯甲烷為非極性化合物，當(dāng)加入0.2%乙酸溶液時，二者由于極性的不同使得萃取能力瞬間下降，從而導(dǎo)致目標(biāo)物提取率減少；反之，當(dāng)先加入0.2%乙酸溶液時，目標(biāo)化合物迅速溶于水，而二氯甲烷不溶于水，目標(biāo)化合物能夠更好地在樣品中保留，而不被二氯甲烷包裹。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的優(yōu)化

本文分別考察了3款不同固定相的色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1mm，1.8μm）和Thermo Acclaim Trinity P1（50 mm×2.1mm，3μm）對目標(biāo)物的分離效果，從圖3可以看出，C18和T3色譜柱均對目標(biāo)化合物不保留，即使調(diào)節(jié)流動相組成和洗脫梯度，色譜圖也無法得到理想的改善，無法將目標(biāo)化合物與雜質(zhì)進(jìn)行有效分離；而Thermo Acclaim Trinity P1能夠?qū)崿F(xiàn)高氯酸鹽和氯酸鹽的有效分離，峰形規(guī)整，尖銳，分離度＞1.5，這可能是因為Thermo Acclaim Trinity P1色譜柱是一種混合模式色譜柱，采用獨(dú)特的多模式表面化學(xué)鍵合相，固定相采用納米雜化硅聚合物（帶電荷納米高分子微球的高純多孔球形顆粒），單填料具備反相、陽離子和陰離子交換功能，使得其可以保留離子和可離子化的分析物。因此，本文最終選取Thermo Acclaim Trinity P1色譜柱。

3.2.2 流動相的優(yōu)化

本文分別考察純水、0.1%甲酸水溶液、5 mmoL/L乙酸銨溶液和20 mmoL/L甲酸銨溶液作為水相流動相時，目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果顯示，20 mmoL/L甲酸銨溶液作為水相流動相時，分離效果最好，峰形尖銳，目標(biāo)物響應(yīng)值最高；純水為水相流動相時目標(biāo)化合物分離度低，峰展寬較寬，峰面積響應(yīng)值低，即純水不利于目標(biāo)化合物在Thermo Acclaim Trinity P1色譜柱上的洗脫。

采用ESI（-）掃描時，甲酸對其產(chǎn)生抑制作用，不利于氯酸鹽和高氯酸鹽的有效分離，進(jìn)而影響目標(biāo)物結(jié)果的準(zhǔn)確性。但在水相流動相中加入鹽之后，目標(biāo)化合物的離子化率開始有明顯提升，同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積響應(yīng)值增漲了2倍以上，可見20 mmoL/L甲酸銨譜圖峰形更好，峰面積響應(yīng)更高。因此，本文最終選用流動相為乙腈和20 mmoL/L甲酸銨溶液。

4 方法學(xué)考察

以內(nèi)標(biāo)法定量，采用安捷倫定量分析軟件進(jìn)行分析，以氯酸鹽和高氯酸鹽與其內(nèi)標(biāo)的比值相對響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以相對濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線。由表2可知，高氯酸鹽在0.05~100μg/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 7；氯酸鹽在0.20~100μg/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 2。高氯酸鹽、氯酸鹽的檢出限以3倍的信噪比（S/N=3）計算，分別為0.025μg/L、0.20μg/L；定量限以10倍的信噪比（S/N=10）計算，分別為0.05μg/L、1.0μg/L。

表2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表

在水體樣品中分別添加低、中、高（1、10、100μg/L）3種濃度的氯酸鹽、高氯酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察方法的回收率和日內(nèi)日間精密度，最終測得回收率在95%~105%之間，RSD＜4%，其中10μg/L添加6平行最終測得RSD＜3%；在土壤樣品分別添加低、中、高（1、10、100μg/L）3種濃度的氯酸鹽、高氯酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測得回收率在80%~108%之間，RSD＜5%，其中10μg/L添加6平行最終測得RSD＜5%。試驗結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性較好，樣品加標(biāo)回收率高，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。

5 實際樣品的測定

采用本文的優(yōu)化方法測定環(huán)境樣品中的氯酸鹽和高氯酸鹽的含量，結(jié)果見圖4和圖5。由結(jié)果可知，所有土壤樣品中均檢測出高氯酸鹽（＞0.025μg/kg），檢出率為100%；氯酸鹽檢出36批（＞0.2μg/kg），檢出率為72%；水體樣品中高氯酸鹽的檢出8批，檢出率為16%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的高氯酸鹽的限值（0.07 mg/L）[21]，但高于美國環(huán)保局規(guī)定的生活飲用水中高氯酸鹽的規(guī)定限值（1.0μg/L）[22]；氯酸鹽檢出28批，檢出率為56%，但所有檢出值均低于我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）中的規(guī)定限值（0.7 mg/L）[23]。由此可見，蘭州及隴南轄區(qū)的部分地區(qū)存在氯酸鹽和高氯酸鹽污染的情況，農(nóng)戶及規(guī)?；N植中藥材、蔬菜水果的場地應(yīng)對高氯酸和氯酸鹽予以監(jiān)測。

6 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境樣品（水體、土壤）中高氯酸鹽和氯酸鹽含量的方法，該方法用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，一定程度上消除了操作條件等因素變化所引起的誤差，定量準(zhǔn)確；水體樣品直接過膜進(jìn)樣，降低了前處理的成本；土壤樣品前處理使用固相萃取凈化，有效消除了基質(zhì)干擾。

該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，可用于常規(guī)水體、土壤等環(huán)境樣品中氯酸鹽、高氯酸鹽的檢測，能夠為我國生活飲用水等環(huán)境樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。