雙重吸附結(jié)合HPLC-MS/MS法測(cè)定生物基質(zhì)中內(nèi)源性組胺及組氨酸

黃浩然，沈佳佳，胡康睿，李昌鍵，謝 林，王廣基，梁 艷

（中國藥科大學(xué)江蘇省藥物代謝動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009）

組胺是一種活性生物胺，其在外周組織中主要由肥大細(xì)胞和附近結(jié)締組織中的嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生，參與過敏和炎癥反應(yīng)。而在大腦中組胺主要來源于組胺能神經(jīng)元，可與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，介導(dǎo)多種生理功能［1］。組氨酸是組胺在體內(nèi)的主要來源，在組氨酸脫羧酶（HDC）的作用下氧化脫羧生成組胺。

在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，組胺作為一種神經(jīng)遞質(zhì)受到日益關(guān)注。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)組胺參與多種神經(jīng)生理功能、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展［2-5］。Cacabelos 等［5］提出組胺的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，且是神經(jīng)變性和神經(jīng)元過早死亡的加重因素。也有一些研究表明，組胺對(duì)腦缺血損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。Adachi 等［6］發(fā)現(xiàn)，在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型中，缺血后給藥組胺前體組氨酸可通過刺激中樞組胺H2受體而防止腦梗死的發(fā)生。此外，在腦缺血造模后2 個(gè)月中，組氨酸能在神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分、認(rèn)知能力評(píng)估和梗死區(qū)域面積方面體現(xiàn)出長期的腦保護(hù)作用［7］。為進(jìn)一步探究組胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，需要一種快速簡便的方法同時(shí)測(cè)定腦組織以及血漿中組胺及其前體組氨酸的含量變化。

目前，組胺的檢測(cè)方法有酶免疫分析法［8］、放射免疫分析法［9］、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法［10］、電化學(xué)檢測(cè)［11］、熒光分析法［12］等?；诳乖贵w特異性結(jié)合的酶免疫分析法、放射免疫分析法，需要制備特異性的抗體，且不能同時(shí)對(duì)組氨酸進(jìn)行檢測(cè)；氣相色譜法基質(zhì)效應(yīng)復(fù)雜，吸附導(dǎo)致峰拖尾和記憶效應(yīng)，通常需要進(jìn)行衍生化，操作復(fù)雜；電化學(xué)檢測(cè)法受內(nèi)源性物質(zhì)干擾較大，靈敏度降低；熒光分析法需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，且干擾因素多；而紫外檢測(cè)器則靈敏度低。因此，本研究中，采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，首次用氨基柱對(duì)大鼠血漿以及腦組織中組胺及其前體組氨酸的含量進(jìn)行測(cè)定。并且，為了降低測(cè)定過程中的基質(zhì)干擾，首次對(duì)生物基質(zhì)進(jìn)行雙重吸附，吸附后的基質(zhì)能夠用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制，解決了內(nèi)源性物質(zhì)只能用人工血漿或者純水作為空白基質(zhì)，所得結(jié)果與真實(shí)情況存在一定差異的問題，為其他內(nèi)源性物質(zhì)提供了共性的檢測(cè)技術(shù)。

1 材 料

1. 1 儀 器

LCMS-8050高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、CBM-20A 系統(tǒng)控制器、LC-30AD 雙泵、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-30A 柱溫箱、電噴霧離子化接口的四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器、LabSolutions LCMS Ver. 5. 6 色譜工作站、AUM120D 電子天平（日本Shimadzu 公司）；Milli-Q Gradient A10 超純水器（美國Millipore 公司）；SorvallBiofuge Stratos 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1. 2 試 劑

組氨酸（histidine，HIS）、組胺（histamine，HA）（合肥博美生物科技有限公司）；活性炭（上海麥克林生化科技有限公司）；2，5-二羥基苯甲酸（2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、方解石（CaCO3）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）（美國Sigma-Aldrich公司）；甲酸銨（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

1. 3 動(dòng) 物

SD大鼠，雄性，體重（210±10）g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供，合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2. 1 色譜條件

色譜柱為ODS-SPXBridge?Amide 柱（100 mm×4. 6 mm，3. 5 μm）；流動(dòng)A 為0. 1% 甲酸-1 mmol/L甲酸銨水，流動(dòng)相B為乙腈；流速為0. 4 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣室溫度為4 ℃；線性梯度程序（A∶B）：0 min（90∶10），0. 02 min（65∶35），3. 5 min（65∶35），4. 0 min（50∶50），4. 2 min（10∶90），4. 4 min（10∶90），4. 6 min（90∶10），6. 5 min（90∶10）。

2. 2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源）；組胺和組氨酸的檢測(cè)均采用正離子、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式：組氨酸監(jiān)測(cè)離子質(zhì)荷比為156. 0→110. 1，碰撞電壓為-21. 0 eV，Q1偏差為-15. 0 V，Q3偏差為-21. 0 V；組胺監(jiān)測(cè)離子質(zhì)荷比為112. 1→95. 1，碰撞電壓為-25. 0 eV，Q1偏差為-16. 0 V，Q3偏差為-17. 0 V；內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)離子質(zhì)荷比為153. 1→108. 2，碰撞電壓為26. 0 eV，Q1 偏差為23. 0 V，Q3 偏差為19. 0 V。脫溶劑裝置溫度為250 ℃；加熱塊（block）溫度為400 ℃；霧化氣流速為3 L/min；干燥氣流速為10 L/min。

2. 3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：精密稱取組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品5. 00 mg，于10 mL 量瓶中，以甲醇溶解定容，配制成相當(dāng)于0. 5 mg/mL 的組氨酸及組胺儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中保存。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：精密稱取DHB 標(biāo)準(zhǔn)品5. 00 mg，置10 mL 量瓶中，以甲醇溶解定容，配制成相當(dāng)于0. 5 mg/mL 儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中保存。

內(nèi)標(biāo)溶液：取內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成相當(dāng)于50 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2. 4 空白生物基質(zhì)的配制

取大鼠血漿1 mL，加入活性炭30 mg 和方解石30 mg，2 000 r/min 振蕩2 h，18 000 r/min 離心10 min，取上清液振蕩5 min 后，18 000 r/min 離心10 min。取上清液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。腦組織勻漿同法。

2. 5 樣品前處理

血漿樣本的處理：取大鼠血漿50 μL，加入50 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液5 μL 及冰乙腈150 μL，振蕩5 min，靜置10 min，18 000 r/min 離心10 min 兩次，取上清液5 μL進(jìn)樣并進(jìn)行定量分析。

腦組織樣本的處理：取大鼠腦組織0. 030 g，加入超純水150 μL，在冰水浴中勻漿。取勻漿50 μL，加入50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液5 μL及冰乙腈150 μL，振蕩5 min，靜置10 min，18 000 r/min 離心10 min兩次，取上清液5 μL進(jìn)樣并進(jìn)行定量分析。

3 方法驗(yàn)證

3. 1 特異性

在本研究方法下組胺出峰時(shí)間為2. 8 min，組氨酸出峰時(shí)間約為3. 0 min，內(nèi)標(biāo)DHB 出峰時(shí)間約為3. 4 min。本研究考察了血漿和腦勻漿兩種基質(zhì)吸附后的空白以及不同濃度點(diǎn)樣品色譜圖，結(jié)果表明方法特異性好，待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)不受其他物質(zhì)干擾，結(jié)果見圖1。

3. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

配制組氨酸濃度為200 μg/mL 及組胺濃度為10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋為系列對(duì)照品工作液。分別吸取上述系列對(duì)照品工作液5 μL于1. 5 mL潔凈的Eppendorf管中，加入吸附后的大鼠空白血漿45 μL，混勻后即可得到為組氨酸質(zhì)量濃度分別為20 000，10 000，2 000，1 000，200，100，20 ng/mL，組胺質(zhì)量濃度分別為1 000，500，100，50，10，5，1 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本。

配制組氨酸濃度為200 μg/mL 及組胺濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋為系列對(duì)照品工作液。分別吸取上述系列對(duì)照品工作液5 μL于1. 5 mL潔凈的Eppendorf管中，加入吸附后的大鼠空白腦勻漿45 μL，混勻后即可得到為組氨酸濃度分別為20 000，10 000，2 000，1 000，200，100，20 ng/mL，組胺質(zhì)量濃度分別為100，50，10，5，1，0. 5，0. 1 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)腦組織樣本。

將得到的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本及系列標(biāo)準(zhǔn)腦組織樣本，分別按照“2. 5”項(xiàng)進(jìn)行處理，用標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積比（R）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度c作線性回歸（權(quán)重系數(shù)W = 1/c）。結(jié)果表明，血漿中組氨酸在20 ~20 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好（r= 0. 999 0），定量下限為20 ng/mL，組胺在1 ~ 1 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好（r= 0. 999 0），定量下限為1 ng/mL；腦勻漿中組氨酸在20 ~ 20 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好（r= 0. 999 4），定量下限為20 ng/mL，組胺在0. 1 ~100 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好（r= 0. 999 2），定量下限為0. 1 ng/mL。

3. 3 準(zhǔn)確度和精密度

分別按“2. 5”項(xiàng)下方法配制含50 ng/mL組氨酸和5 ng/mL 組胺的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本1、含500 ng/mL 組氨酸和50 ng/mL 組胺的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本2、含1 000 ng/mL組氨酸和5 000 ng/mL組胺的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本3。為考察批內(nèi)和批間差異，3 個(gè)濃度均平行制備6 份，并連續(xù)測(cè)定3 個(gè)分析批以計(jì)算各血漿樣品中組氨酸及組胺濃度。血漿的批內(nèi)及3 日內(nèi)批間差在85% ~ 115% 之間。腦組織的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)參照血漿。腦組織的批內(nèi)及3 日內(nèi)批間差在85% ~ 115%之間。結(jié)果見表1。

Figure 1 Representative MRM chromatograms of a blank plasma sample after absorption (A); a blank plasma sample after absorption spiked with histidine (HIS) and histamine (HA) (5. 0 ng/mL) (B); a blank plasma sample after absorption spiked with HIS and HA (50. 0 ng/mL) (C); a blank brain matrix sample after absorption (D); a blank brain matrix sample after absorption spiked with HIS and HA (5. 0 ng/mL) (E) and a blank brain matrix sample after absorption spiked with HIS and HA (50. 0 ng/mL) (F)

Table 1 Precision and accuracy of HIS and HA in plasma and brain matrix (n = 6)

3. 4 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

取吸附后大鼠空白血漿45 μL，并加入3 個(gè)不同濃度的組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μL，3 個(gè)濃度均平行制備6 份，進(jìn)樣后得峰面積A；另取吸附后大鼠空白血漿45 μL，根據(jù)“2. 5”項(xiàng)用冰乙腈預(yù)先處理，向其中加入3 個(gè)濃度的組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μL，3 個(gè)濃度均平行制備6 份，進(jìn)樣后得峰面積B；使用超純水45 μL 代替空白血漿，根據(jù)“2. 5”項(xiàng)用冰乙腈預(yù)先處理，向其中加入3 個(gè)濃度的組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μL，3 個(gè)濃度均平行制備6 份，進(jìn)樣得到峰面積C。提取回收率=A/B × 100%，基質(zhì)效應(yīng)= B/C× 100%。血漿經(jīng)該方法處理后基質(zhì)效應(yīng)不明顯，回收率在可接受范圍內(nèi)（＞75%）。腦組織的基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程參照血漿。腦組織經(jīng)該方法處理后基質(zhì)效應(yīng)不明顯，回收率在可接受范圍內(nèi)（＞75%）。結(jié)果見表2。

Table 2 Matrix effect and recovery rate of HIS and HA in plasma and brain matrix (n = 6)

3. 5 穩(wěn)定性

血漿樣本室溫放置穩(wěn)定性考察：分別取空白血漿45 μL，加入不同濃度組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，混勻后在室溫條件下放置12 h，根據(jù)“2. 5”項(xiàng)進(jìn)行操作，檢測(cè)大鼠血漿中組氨酸及組胺濃度。

血漿樣本自動(dòng)進(jìn)樣器中穩(wěn)定性考察：組氨酸及組胺血漿樣本處理后，放置在自動(dòng)進(jìn)樣器中（4 ℃）達(dá)24 h后檢測(cè)組氨酸及組胺濃度。

血漿樣本反復(fù)凍融穩(wěn)定性考察：分別取空白血漿45 μL，加入不同濃度組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，混勻后反復(fù)凍融3 次，根據(jù)“2. 5”項(xiàng)進(jìn)行操作，檢測(cè)組氨酸及組胺濃度。

血漿樣本長期冷凍穩(wěn)定性考察：分別取空白血漿樣本45 μL，加入不同濃度組氨酸及組胺標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，混勻后置于-70 ℃冰箱冷凍14 d，根據(jù)“2. 5”項(xiàng)進(jìn)行操作，檢測(cè)組氨酸及組胺濃度。

腦樣本穩(wěn)定性考察同血漿樣品。

結(jié)果如表3 所示，組氨酸及組胺在血漿和腦組織勻漿液中室溫放置12 h，超低溫冷凍（-60 ~-80 ℃）~解凍（37 ℃）3 次循環(huán)，超低溫（-60 ~-80 ℃）凍存14 d，樣品處理后進(jìn)樣盤放置24 h 均穩(wěn)定（相對(duì)偏差RE小于± 15%）。

Table 3 Stability of HIS and HA in plasma and brain matrix (n = 6)

3. 6 方法應(yīng)用

本研究通過腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）建立大鼠缺血性腦卒中模型，驗(yàn)證所建立方法在檢測(cè)組胺及組氨酸變化方面的可行性，并初步闡明與腦損傷相關(guān)的靶點(diǎn)。分布選取MCAO 術(shù)后24 h 大鼠及假手術(shù)大鼠各6 只，取血漿和大腦，對(duì)腦組織進(jìn)行分區(qū)，取皮質(zhì)、海馬和紋狀體3 個(gè)區(qū)域，按照“2. 5”項(xiàng)進(jìn)行處理，取上清液5 μL 進(jìn)樣分析。如圖2 所示，與假手術(shù)組相比，MCAO 模型大鼠血漿、皮質(zhì)、海馬和紋狀體中組胺濃度均明顯升高，而組氨酸水平在血漿、皮質(zhì)、紋狀體中顯著升高。

Figure 2 Concentrations of HIS and HA in plasma, cortex, hippocampus and striatum in sham-operated and middle cerebral artery occlusion(MCAO) model rats（±s, n = 6）

4 討 論

4. 1 空白生物基質(zhì)的制備

組胺和組氨酸都是維持人體健康的重要生物活性分子。由于其具有內(nèi)源性的特點(diǎn)，所以缺乏真實(shí)的空白基質(zhì)來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一些報(bào)道中，將含5% 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水溶液作為模擬空白血漿基質(zhì)［13］。然而，配方基質(zhì)與真實(shí)基質(zhì)還是具有一定差異，真實(shí)基質(zhì)中存在的各種鹽、蛋白質(zhì)、脂類和微量元素，可能導(dǎo)致定量結(jié)果存在較大偏差。因此，考慮對(duì)空白組織中組胺及組氨酸進(jìn)行吸附。

活性炭具有較高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，并能與多種化合物形成表面官能團(tuán)，是最常見、應(yīng)用最廣泛的吸附劑之一［14］。方解石是一種碳酸鈣礦物，有報(bào)道稱氨基酸與礦物質(zhì)表面存在相互作用，可以通過靜電引力、疏水作用、共價(jià)鍵和氫鍵等方式相互吸收［15］。故以峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，考察了分別添加活性炭、方解石以及活性炭和方解石對(duì)基質(zhì)中組胺和組氨酸吸附的效果，結(jié)果表明同時(shí)添加活性炭30 mg 和方解石30 mg 吸附效果最好。吸附后的生物基質(zhì)能夠用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及真實(shí)樣品分析。

4. 2 色譜柱的選擇

氨基柱以氨丙基鍵合硅膠為填料，可用于正相色譜，也可用于反相色譜分析，在高有機(jī)相比例下可作為親水相互作用色譜柱進(jìn)行分析，應(yīng)用廣泛。其與ODS 色譜柱相比更適用于極性大的小分子物質(zhì)，并廣泛應(yīng)用于糖類的分析。本研究首次選用ODS-SPXBridge?氨基色譜柱對(duì)組胺和組氨酸進(jìn)行分析，待測(cè)物峰型良好，靈敏度高。

4. 3 方法應(yīng)用

組胺無法通過血-腦脊液屏障，腦內(nèi)組氨酸脫羧是組胺的唯一來源。在探究組胺在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用時(shí)，研究人員通常經(jīng)口給予動(dòng)物組氨酸，以增加腦內(nèi)組胺含量。然而，組氨酸本身為必需氨基酸，在體內(nèi)含量很高，額外補(bǔ)充組氨酸能否提高腦內(nèi)組氨酸水平，進(jìn)而增加組胺生成，有待考察。本研究首次建立一種能夠同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)組胺及其前體組氨酸含量的方法，方法的應(yīng)用將有助于進(jìn)一步探究組胺以及組氨酸在中樞性疾病中的作用。

在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，缺血性腦卒中是導(dǎo)致死亡的主要原因，也是導(dǎo)致長期殘疾的主要原因，其癥狀主要涉及運(yùn)動(dòng)功能障礙和記憶衰退。大腦皮質(zhì)上分布著數(shù)百億個(gè)神經(jīng)元，是調(diào)節(jié)軀體運(yùn)動(dòng)的最高級(jí)中樞；紋狀體是控制運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵區(qū)域，紋狀體功能障礙會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)障礙［16］；而海馬體是人體的記憶系統(tǒng)。因此，本研究重點(diǎn)測(cè)定了這3 個(gè)腦區(qū)及血漿中組胺及組氨酸水平。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，MCAO 模型大鼠血漿、皮質(zhì)、海馬和紋狀體中組胺濃度均明顯升高，而組氨酸水平在血漿、皮質(zhì)、紋狀體中顯著升高。組胺在腦中作為一種神經(jīng)遞質(zhì)可以調(diào)控4 種組胺受體，其上調(diào)的具體病理意義將有待進(jìn)一步研究。此外，腦內(nèi)組氨酸含量是血漿組氨酸含量的3倍左右，而腦組胺僅不到血漿中組胺水平的十分之一。因此，推測(cè)急性缺血性腦卒中導(dǎo)致血-腦脊液屏障受損，血漿中組胺大量進(jìn)入腦內(nèi)可能為腦組胺水平暫時(shí)升高的原因之一。

5 總 結(jié)

運(yùn)用氨基柱和生物基質(zhì)吸附的方式，建立一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，能夠同時(shí)定量大鼠血漿和腦組織勻漿兩種生物基質(zhì)中組胺及其前體組氨酸。該方法前處理方式簡單，無需衍生化，符合生物樣本分析要求，已用于實(shí)際樣本分析。