絮凝菌的篩選及乳制品廢水培養(yǎng)條件優(yōu)化

魏 煒,陳令薇,馬振林,崔 鵬

(沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 沈陽 110168)

微生物絮凝劑(Microbial flocculant,MBF)是由絮凝微生物(Flocculating Microorganism,FM)即微生物絮凝劑產(chǎn)生菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的具有絮凝性能的天然高分子化合物[1]。MBF與無機(jī)絮凝劑、有機(jī)絮凝劑相比具有安全、廉價(jià)、高效、無毒、易生物降解、無二次污染等優(yōu)點(diǎn),是新型綠色環(huán)保水處理絮凝劑,應(yīng)用前景廣闊[2]。但由于FM的培養(yǎng)成本較高,導(dǎo)致了MBF的生產(chǎn)成本較高,發(fā)展受到一定程度的限制,還未達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用階段,仍需不斷地深入研究。因此,可利用有機(jī)廢水作為培養(yǎng)基,降低生產(chǎn)成本,篩選高效FM。隨著人們對(duì)身體健康的重視,乳制品的需求量在逐漸增加,其廢水量也在快速增長(zhǎng)。因此,筆者以乳制品廢水作為廉價(jià)培養(yǎng)基篩選高效FM,并對(duì)其進(jìn)行紫外誘變后再次篩選優(yōu)勢(shì)菌,并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本的同時(shí)篩選出更穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)菌種,使得制備出的微生物絮凝劑活性更高更穩(wěn)定,以廢治廢、變廢為寶。

1 試 驗(yàn)

1.1 乳制品廢水

乳制品廢水主要來源于乳制品生產(chǎn)車間的容器、管道、設(shè)備的清洗水,可視為乳制品的稀釋液,屬于高濃度有機(jī)廢水,主要污染成分為乳脂肪、乳蛋白以及乳糖等,其COD質(zhì)量濃度通常在2 000～3 000 mg/L。

1.2 菌種來源

菌源取自沈陽建筑大學(xué)校園稻田土壤，沈陽市上夾河污水廠活性污泥。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[3]:蒸餾水1 000 mL、葡萄糖10 g、尿素0.5 g、酵母膏0.5 g、NaCl 0.1 g、KH2PO42 g、K2HPO45 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、pH為7.0,在121 ℃下滅菌30 min.添加15 g瓊脂即為固體分離培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基:乳品廢水(COD質(zhì)量濃度為2 875 mg/L)、尿素0.5 g、K2HPO45 g、KH2PO42 g、pH為7.0,在121 ℃下滅菌30 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的富集培養(yǎng)及分離

在無菌條件下,取采集到的樣品于無菌水中,充分振蕩后稀釋至適宜濃度的菌懸液,并采用平板涂布法在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行接種。在30 ℃下倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的單個(gè)菌落進(jìn)行劃線分離、純化培養(yǎng)。將其接種于保藏培養(yǎng)基上,在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株的初篩、復(fù)篩

在無菌條件下,用接種環(huán)從保藏培養(yǎng)基上挑取適量菌接種在裝有100 mL種子液的錐形瓶中,放置在30 ℃,150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h,獲得菌株的種子液。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量種子液,放置在30 ℃,150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱下培養(yǎng)48 h。吸取菌株的發(fā)酵液加入到裝有高嶺土懸濁液的錐形瓶中振蕩,靜置后進(jìn)行菌株初篩,選取能產(chǎn)生沉淀或者層狀或者片狀的聚集物的菌株。進(jìn)行復(fù)篩,通過測(cè)定絮凝率,選擇絮凝效果較好的菌株。

1.4.3 絮凝率的測(cè)定

吸取2 mL菌株的發(fā)酵液加入到100 mL質(zhì)量濃度為5 g/L的高嶺土懸濁液中,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2溶液5 mL作為助凝劑,振蕩20 min,靜置10 min.取上清液于分光光度計(jì)550 nm處測(cè)定其吸光度值。同時(shí),以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照空白,在550 nm處測(cè)定吸光度值,并計(jì)算其絮凝率:

E=(A0-A1)/A0×100%.

(1)

式中:E為絮凝率,%;A0為空白對(duì)照組上清液的吸光度;A1為加入發(fā)酵液絮凝之后上清液的吸光度。

1.4.4 紫外誘變

生長(zhǎng)曲線測(cè)定[4]:采用比濁法測(cè)定產(chǎn)絮菌的生長(zhǎng)曲線。在30 ℃下,將篩選得到的優(yōu)勢(shì)菌活化培養(yǎng),按照體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng),前24 h每2 h取一次樣,后每隔6 h取一次樣。以未接種的培養(yǎng)基(采用相同的方法進(jìn)行滅菌和培養(yǎng))作為對(duì)照組,使用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值(OD600)。以O(shè)D600來表示產(chǎn)絮菌的生長(zhǎng)曲線,確定菌株的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。

將篩選得到的絮凝率較好的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用無菌水將稀釋到1×10-6,取5 mL菌懸液于培養(yǎng)皿內(nèi),置于距紫外燈下方30 cm處,分別照射0 s、20 s、40 s、60s、80 s、100 s、120 s、140 s,避光條件下4 ℃冷藏2 h后,取0.1 mL菌液涂布于固體培養(yǎng)基上,做3組平行樣,于30 ℃下,避光培養(yǎng)2～3 d,通過平板計(jì)數(shù),計(jì)算不同紫外誘變時(shí)間對(duì)原始菌株的致死率[5]:

Z=(B0-B1)/B0×100%.

(2)

式中:Z為致死率,%;B0為對(duì)照組的菌落數(shù),個(gè);B1為紫外線處理后的菌落數(shù),個(gè)。

對(duì)致死率為70%～80%的菌株發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定絮凝率,選取一株絮凝性能最佳的菌株作為目標(biāo)試驗(yàn)對(duì)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從土壤、活性污泥中共篩出24株菌,初篩后得到11株有明顯絮凝效果的菌株,經(jīng)過復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)從活性污泥中篩選得到的編號(hào)為C2菌株的絮凝效果最好,絮凝率可達(dá)76.23%。因此,試驗(yàn)研究以C2為目標(biāo)對(duì)象。

2.2 生長(zhǎng)曲線

圖1為C2菌株的生長(zhǎng)曲線。由圖1可以看出,OD600值在0～6 h基本不變,此時(shí)菌株C2處于遲緩期;在6～24 hOD600值迅速增加,菌株C2進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;在24～48 hOD600值保持穩(wěn)定,此時(shí)菌株C2到達(dá)穩(wěn)定期;48 h后OD600值逐漸下降,菌株C2開始進(jìn)入衰亡期。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株C2進(jìn)行誘變可以增加其正向突變的概率。經(jīng)試驗(yàn),選定培養(yǎng)18 h后的菌株進(jìn)行紫外誘變。

圖1 C2菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain C2

2.3 紫外誘變篩選優(yōu)良菌

適合的致死率有利于優(yōu)良產(chǎn)絮菌的挑選,通常菌株紫外誘變的致死率在70%～80%時(shí),可達(dá)到最佳的誘變效果[4]。圖2為C2菌株紫外誘變致死率。由圖可知,C2的致死率隨著照射時(shí)間的增加逐漸上升,照射時(shí)間少于100 s,菌株C2致死率低于70%;照射時(shí)間多于100 s,菌株C2致死率高于80%,均不在最佳誘變范圍內(nèi)。在100 s時(shí)菌株C2的致死率為77.24%,為最佳誘變時(shí)間。將菌株C2在紫外燈下照射100 s后培養(yǎng),并測(cè)定絮凝率,篩選出一株絮凝性能較好的菌株C2-5,絮凝率可達(dá)80.42%。

圖2 C2菌株紫外誘變致死率Fig.2 UV mutagenic lethality of strain C2

2.4 產(chǎn)絮菌C2-5的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 外加不同量葡萄糖

通常大部分微生物對(duì)單糖的利用率更高,且單糖的成本較低。在微生物的發(fā)酵培養(yǎng)中,單糖中的葡萄糖是經(jīng)常使用的外加碳源[6]。為了降低成本以及研究外加碳源對(duì)C2-5絮凝性能的影響,選定葡萄糖為外加碳源進(jìn)行試驗(yàn)。按照2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的質(zhì)量濃度向乳制品廢水中加入葡萄糖,其余培養(yǎng)條件不變,對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并檢測(cè)其絮凝性能。外加不同量葡萄糖對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響如圖3所示。

圖3 葡萄糖對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.3 Effect of glucose on the flocculation rate of strain C2-5

由圖3可知,菌株C2-5的絮凝率隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的提高小幅度的增加而后逐漸降低。投加質(zhì)量濃度為4 g/L的葡萄糖時(shí),絮凝率高達(dá)到81.54%,但增幅僅為1.12%,為降低經(jīng)濟(jì)成本,利用產(chǎn)絮菌C2-5制備MBF的過程中無需外加碳源。

2.4.2 外加不同量尿素

尿素是氮源中最有利于微生物生長(zhǎng)繁殖以及MBF產(chǎn)生的物質(zhì)。為了提高絮凝率,選定尿素為外加氮源進(jìn)行試驗(yàn)。按照0.1 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、0.9 g/L的質(zhì)量濃度加入尿素,其余培養(yǎng)條件不變,對(duì)C2-5發(fā)酵培養(yǎng)并檢測(cè)其絮凝性能。外加不同量尿素對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響如圖4所示。

圖4 尿素對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.4 Effect of urea on flocculation rate of strain C2-5

由圖4可知,隨著尿素投加量的增加,菌株C2-5絮凝性能先提高后逐漸降低,說明均適量的氮源有利于產(chǎn)絮菌C2-5的生長(zhǎng)以及MBF的合成。尿素質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí),C2-5的絮凝率最佳,其值為84.58%。

2.4.3 外加不同量K2HPO4和KH2PO4

適量的磷酸鹽有利于MBF的產(chǎn)生[7-8]。為了提升C2-5的絮凝性能,筆者以K2HPO4和KH2PO4為外加磷源進(jìn)行試驗(yàn)。按照質(zhì)量比為m(K2HPO4)∶m(KH2PO4)=2.5∶>1的比例添加磷源,按照3.5 g/L、7 g/L、10.5 g/L、14 g/L、17.5 g/L的質(zhì)量濃度向乳制品廢水中投加K2HPO4+KH2PO4,其余培養(yǎng)條件不變,對(duì)C2-5發(fā)酵培養(yǎng)并檢測(cè)其絮凝性能。外加不同量K2HPO4+KH2PO4對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響如圖5所示。由圖5可知,產(chǎn)絮菌C2-5絮凝性能隨著K2HPO4+KH2PO4投加量的增加先上升后下降,當(dāng)K2HPO4+KH2PO4質(zhì)量濃度為7 g/L時(shí),絮凝率達(dá)到85.13%,效果最佳。

圖5 K2HPO4+KH2PO4對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.5 Effect of K2HPO4+KH2PO4 on flocculation rate of strain C2-5

2.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)pH值

試驗(yàn)采用濃度為1 mol/L的HCl和NaOH對(duì)乳制品廢水的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9,其余培養(yǎng)條件不變,對(duì)C2-5發(fā)酵培養(yǎng)并檢測(cè)其絮凝性能。不同pH值對(duì)菌株C2-5發(fā)酵培養(yǎng)后的絮凝效果的影響如圖6所示。

圖6 pH值對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.6 Effect of pH value on flocculation rate of strain C2-5

由圖6可知,菌株C2-5的絮凝性能隨發(fā)酵培養(yǎng)pH值的增加,呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。pH值為7.0時(shí),菌株C2-5的絮凝率最高,達(dá)到85.73%。pH值過低或過高的培養(yǎng)環(huán)境不利于C2-5對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,影響其生長(zhǎng)和MBF的產(chǎn)生,導(dǎo)致絮凝效果不佳。故培養(yǎng)基pH值為7.0時(shí),菌株C2-5產(chǎn)MBF的條件最佳。

2.4.5 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間

對(duì)菌株C2-5分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h,其余培養(yǎng)條件不變,其絮凝效果如圖7所示。

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.7 Effect of fermentation time on flocculation rate of strain C2-5

由圖7可知,菌株C2-5隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的增加,其絮凝性能也在提高,這可能是菌株C2-5充分吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)。菌株C2-5在36～48 h時(shí)間段內(nèi)絮凝性能趨于穩(wěn)定,在48 h時(shí)絮凝率達(dá)到85.47%,可能是C2-5菌體達(dá)到一定質(zhì)量濃度,MBF產(chǎn)量逐漸穩(wěn)定。48 h后,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,菌株C2-5開始衰亡,MBF產(chǎn)量開始減少,其絮凝性能開始逐漸降低[9]?？梢?合適的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間利于菌體生長(zhǎng),C2-5的最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

2.4.6 發(fā)酵培養(yǎng)溫度

試驗(yàn)分別在溫度為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下,且保持其余培養(yǎng)條件不變,對(duì)菌株C2-5進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。不同溫度對(duì)C2-5絮凝能力的影響如圖8所示。

圖8 發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on flocculation rate of strain C2-5

由圖8可知,在20～30 ℃溫度內(nèi),絮凝率在不斷提高,當(dāng)培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)菌株C2-5的絮凝能力最強(qiáng),絮凝率達(dá)到84.83%。說明了在一定范圍內(nèi)提升溫度有利于C2-5的生長(zhǎng)及其代謝物的產(chǎn)生,并且在最適溫度下酶的活性可以達(dá)到最大。當(dāng)溫度高于時(shí)30 ℃,影響了C2-5產(chǎn)MBF,絮凝能力持續(xù)下降[10]。因此,30 ℃為菌株C2-5產(chǎn)絮的最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.4.7 發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速

在轉(zhuǎn)速分別為110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min條件下,且其余培養(yǎng)條件不變時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)C2-5絮凝能力的影響如圖9所示。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.9 Effect of fermentation speed on flocculation rate of strain C2-5

由圖9可知，當(dāng)發(fā)酵轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí),菌株C2-5的絮凝率最佳達(dá)85.72%。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速影響了培養(yǎng)過程的通氣量以及溶解氧含量,發(fā)酵轉(zhuǎn)速低于150 r/min時(shí),會(huì)導(dǎo)致溶解氧含量較低,不利于菌株C2-5的生長(zhǎng);發(fā)酵轉(zhuǎn)速過高于150 r/min時(shí),培養(yǎng)基晃動(dòng)劇烈,影響菌株C2-5吸取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。這兩種情況均會(huì)導(dǎo)致MBF產(chǎn)生量減少,以至于絮凝效果不佳[11]。因而,150 r/min為菌株C2-5產(chǎn)絮的最佳發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

2.4.8 發(fā)酵培養(yǎng)接種量

試驗(yàn)按照2%、4%、6%、8%、10%的接種量投加種子液,其余培養(yǎng)條件不變,對(duì)菌株C2-5進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。不同接種量對(duì)菌株C2-5絮凝性能的影響如圖10所示。從圖10可知,合適的接種量有利于微生物的生長(zhǎng),并且能提高絮凝率[12-13]。接種量在2%～6%時(shí),菌株C2-5絮凝能力不斷增大,在6%時(shí),絮凝率達(dá)到86.26%。接種量低于6%時(shí),菌株C2-5在培養(yǎng)周期內(nèi)不能達(dá)到適宜的菌體濃度,不利于MBF的積累;接種量高于6%時(shí),菌株C2-5絮凝能力逐漸減弱,這可能是菌株C2-5初始濃度過高,吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較快,影響了MBF的生成。因此,菌株C2-5產(chǎn)絮的最佳發(fā)酵培養(yǎng)接種量為6%。

圖10 接種量對(duì)菌株C2-5絮凝率的影響Fig.10 Effect of inoculation concentration on flocculation rate of strain C2-5

3 結(jié) 論

(1)從校園稻田土壤和污水廠活性污泥中篩選出24株微生物絮凝劑產(chǎn)生菌,其中11株有明顯絮凝效果。菌株C2的絮凝能力最強(qiáng),絮凝率為76.23%。

(2)選擇培養(yǎng)18 h的菌株C2進(jìn)行紫外誘變,在紫外燈下照射100 s時(shí),致死率達(dá)77.24%,為最佳誘變條件。并在該條件下篩選出一株高效產(chǎn)絮菌C2-5,絮凝率可達(dá)80.42%。

(3)通過單因素試驗(yàn)可得到誘變優(yōu)勢(shì)菌C2-5的最佳培養(yǎng)條件:外加質(zhì)量濃度為0.5 g/L的尿素,質(zhì)量濃度為5 g/L的K2HPO4,質(zhì)量濃度為2 g/L的KH2PO4,pH值為7,發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48 h,發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30 ℃,發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min,接種量為6%。