玉米質(zhì)膜內(nèi)在蛋白ZmPIP2;6響應(yīng)滲透、鹽和干旱脅迫的功能鑒定

周練，熊雨涵，洪祥德，周京，劉朝顯，王久光，王國(guó)強(qiáng)，蔡一林

玉米質(zhì)膜內(nèi)在蛋白ZmPIP2;6響應(yīng)滲透、鹽和干旱脅迫的功能鑒定

周練，熊雨涵，洪祥德，周京，劉朝顯，王久光，王國(guó)強(qiáng)，蔡一林

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院玉米研究所，重慶 400715）

【目的】質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）廣泛存在于植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)上，在植物體內(nèi)水分運(yùn)輸和水分平衡的過(guò)程中至關(guān)重要。對(duì)ZmPIP2;6在植物水分脅迫耐性中的功能進(jìn)行探究，為玉米培育抗旱耐鹽新品種提供優(yōu)秀基因資源?！痉椒ā糠治霾⒈葘?duì)ZmPIP2;6與其他物種中報(bào)道參與水分脅迫的PIPs的氨基酸序列，構(gòu)建ZmPIP2;6-GFP載體并通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，對(duì)ZmPIP2;6進(jìn)行亞細(xì)胞定位。采集玉米的不同組織樣品，包括根、莖、葉、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳；對(duì)玉米進(jìn)行PEG或NaCl處理，在處理的不同時(shí)間點(diǎn)采集玉米的根和葉樣品。提取總RNA并通過(guò)qRT-PCR調(diào)查在玉米不同組織以及在水分脅迫下的表達(dá)模式。構(gòu)建超表達(dá)載體，發(fā)展并鑒定超表達(dá)擬南芥材料，觀察轉(zhuǎn)基因植株對(duì)滲透、鹽及干旱脅迫的耐性生理表型，并測(cè)量其根長(zhǎng)、葉片水分散失率等性狀。檢測(cè)在干旱或鹽脅迫條件下，擬南芥脅迫信號(hào)通路上的相關(guān)基因在超表達(dá)植株中的表達(dá)?！窘Y(jié)果】氨基酸序列分析比對(duì)結(jié)果顯示ZmPIP2;6具有PIP蛋白的典型結(jié)構(gòu)與并且其他物種的PIP蛋白具有很高的同源性。轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體試驗(yàn)結(jié)果顯示ZmPIP2;6蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜。qRT-PCR結(jié)果顯示在玉米未成熟雄穗中表達(dá)量最高，并且在玉米受到滲透和鹽脅迫后根和葉中的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)。在MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行滲透脅迫處理和鹽脅迫處理以及進(jìn)一步的土培試驗(yàn)中進(jìn)行干旱脅迫處理，超表達(dá)擬南芥植株相對(duì)野生型都顯示出更強(qiáng)的脅迫耐性。在干旱或鹽脅迫條件下，擬南芥脅迫信號(hào)通路上的相關(guān)基因在超表達(dá)植株中的表達(dá)受到不同程度的影響?！窘Y(jié)論】玉米內(nèi)在質(zhì)膜蛋白基因在滲透或鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，在擬南芥中超表達(dá)會(huì)增強(qiáng)植株對(duì)滲透、鹽和干旱脅迫的耐性，并且在鹽或干旱脅迫條件下會(huì)影響擬南芥中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)?？赡軈⑴c植物水分脅迫響應(yīng)過(guò)程。

玉米；質(zhì)膜內(nèi)在蛋白；滲透脅迫；干旱脅迫；鹽脅迫

0 引言

【研究意義】近幾十年來(lái)，盡管世界玉米產(chǎn)量達(dá)到穩(wěn)定增長(zhǎng)，但是由于全球氣候變暖導(dǎo)致地球上極端天氣的加劇及水分的不平衡，干旱和鹽脅迫影響玉米產(chǎn)量的威脅也在逐漸增加[1-2]。因此，在有限的土地和水資源條件下，提高作物水分脅迫耐性和培育與推廣應(yīng)用抗逆作物新品種是解決這一問(wèn)題的重要途徑。廣泛存在于植物細(xì)胞膜系統(tǒng)中的水通道蛋白是水分跨細(xì)胞運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，其中質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）在植物細(xì)胞質(zhì)膜上起著重要功能，主導(dǎo)植物根部和葉片組織的水分運(yùn)輸，在維持植物體內(nèi)水勢(shì)平衡的過(guò)程中至關(guān)重要[3-7]。受到滲透、鹽或干旱脅迫等非生物脅迫時(shí)植株體內(nèi)水分轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控非常重要，因此，研究ZmPIPs在植物水分脅迫應(yīng)答過(guò)程中的功能更是關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】廣泛存在于植物細(xì)胞膜系統(tǒng)中的水通道蛋白作為主要內(nèi)在蛋白（major intrinsic protein，MIP）家族成員，是水分跨細(xì)胞運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，在植物水分運(yùn)輸和水分平衡中起著非常重要的作用[3-7]。MIP是一類具有高度保守結(jié)構(gòu)的疏水蛋白，包括6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成A、B、C、D、E共5個(gè)環(huán)，其N端與C端都位于胞內(nèi)。其中B、E 2個(gè)環(huán)上具有高度保守的NPA（天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）基序，這是水通道蛋白與底物結(jié)合所必須的結(jié)構(gòu)[8]。在高等植物中，水通道蛋白主要分為5個(gè)亞家族：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs）、液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、NOD26相似內(nèi)在蛋白（nodulin26-like intrinsic proteins，NIPs）、小分子堿性內(nèi)在蛋白（small basic intrinsic proteins，SIPs）和未鑒定的膜內(nèi)在蛋白（X intrinsic proteins，XIPs）[9]。其中，PIPs在植物細(xì)胞質(zhì)膜上起著重要功能，植物根部和葉片的水分運(yùn)輸主要由PIPs完成[6,10]。根據(jù)序列相似度，PIPs可以分為PIP1和PIP2 2個(gè)亞類，其中PIP2的C端序列長(zhǎng)于PIP1。有報(bào)道指出PIP1與PIP2蛋白能夠互作并影響其水通道活性[11-17]，如玉米中ZmPIP1;2能與多個(gè)ZmPIP2s蛋白互作并顯著提高ZmPIP2s的水通道活性[11]。植物基因組中含有大量的水通道蛋白基因，例如玉米有31個(gè)水通道蛋白基因[8]、擬南芥有35個(gè)[18]、水稻有33個(gè)[19]和大豆有66個(gè)[20]等。植物水通道蛋白的高度多樣性暗示著其在植物生理生化進(jìn)程中具有多種功能。除了水分運(yùn)輸以外，水通道蛋白還參與植物多種生理進(jìn)程例如固氮[21]、光合作用[22-24]、營(yíng)養(yǎng)吸收[25-27]以及各種環(huán)境脅迫[28]。生物脅迫例如非生物脅迫例如滲透、干旱、鹽和冷脅迫都會(huì)影響植物水分平衡和水通道蛋白基因的表達(dá)[29]。例如不同濃度的鹽處理玉米不同時(shí)間后，ZmPIPs呈不同水平的表達(dá)調(diào)節(jié)[30]；PEG處理玉米，的轉(zhuǎn)錄水平在水分脅迫及復(fù)水時(shí)期在玉米根的不同區(qū)段中顯示出差異性調(diào)節(jié)[31]。研究表明，在植物中超表達(dá)某些內(nèi)源或外源水通道蛋白基因，能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)各種非生物脅迫的耐性[24,32-36]。例如在擬南芥中超表達(dá)能增強(qiáng)植物對(duì)鹽和滲透脅迫的耐性[36]；在大豆中超表達(dá)能提高大豆的耐鹽能力，增加光合效率，并通過(guò)增加籽粒大小提高產(chǎn)量[24]；在香蕉中超表達(dá)，能夠提高香蕉對(duì)干旱、鹽和冷脅迫等多種非生物脅迫的耐性[35]等。通過(guò)上述研究報(bào)道，說(shuō)明發(fā)掘水通道蛋白基因應(yīng)用于抗逆轉(zhuǎn)基因作物育種具有可行性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米已被鑒定，但是關(guān)于其功能，特別是參與非生物脅迫耐性的功能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。前期用PEG或NaCl處理玉米后，發(fā)現(xiàn)根和葉中的和表達(dá)會(huì)出現(xiàn)不同程度變化，其中已經(jīng)報(bào)道在增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫的耐性過(guò)程中起關(guān)鍵作用[37]，因此，研究是否也在參與植物響應(yīng)水分脅迫過(guò)程中具有重要功能，對(duì)于下一步探索玉米水分平衡過(guò)程中ZmPIPs蛋白間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)分析ZmPIP2;6的蛋白序列并確定其在玉米原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位，調(diào)查在玉米的不同組織中以及在滲透和鹽脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)展超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥材料并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)不同非生物脅迫的耐性進(jìn)行鑒定，增進(jìn)對(duì)參與植物對(duì)水分脅迫應(yīng)答過(guò)程的了解，也可以為玉米培育抗旱耐鹽新品種提供優(yōu)秀的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料、生長(zhǎng)條件及脅迫處理

使用的玉米（L.）材料是B73，根、莖、葉、未成熟雄穗（3—4 cm）、未成熟雌穗（3—4 cm）、胚和胚乳分別取自授粉后18 d。植物溫室培養(yǎng)條件是12 h光照/12 h黑暗，光照強(qiáng)度為1 000 μmol·m-2·s-1，白天/夜晚的溫度分別是30℃/22℃，生長(zhǎng)室濕度控制在約30%。玉米在土壤里播種，發(fā)芽5 d后，將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至營(yíng)養(yǎng)液里水培。改良后1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[38]成分如下：6.0 mmol·L-1KNO3、4.0 mmol·L-1Ca(NO3)2、1.0 mmol·L-1KH2PO4、0.05 mmol·L-1KCl、1.0 mmol·L-1MgSO4、0.02 mmol·L-1Fe-EDTA(Na)、25 μmol·L-1H3BO3、0.2 μmol·L-1MnSO4、0.2 μmol·L-1ZnSO4、0.05 μmol·L-1(NH4)2MoO4和0.05 μmol·L-1CuSO4。進(jìn)行脅迫處理時(shí)，向營(yíng)養(yǎng)液中添加10%的PEG6000進(jìn)行滲透處理或100 mmol·L-1的NaCl進(jìn)行鹽處理。

擬南芥（）材料使用的是-0型。擬南芥種子通過(guò)表面消毒播種在MS培養(yǎng)基平板上，4℃春化3 d。擬南芥生長(zhǎng)箱的培養(yǎng)條件控制在16 h光照/8 h黑暗，白天/夜晚的溫度分別是24℃/21℃，生長(zhǎng)室濕度控制在約30%。

MS培養(yǎng)基平板試驗(yàn)：擬南芥種子通過(guò)表面消毒播種在MS培養(yǎng)基平板上，4℃春化3 d，正常培養(yǎng)5 d的幼苗移至含有150 mmol·L-1甘露醇或100 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基中，正常光照下培養(yǎng)7 d。

土壤培養(yǎng)試驗(yàn)：擬南芥種子通過(guò)表面消毒播種在MS培養(yǎng)基平板上，4℃春化3 d，正常培養(yǎng)5 d的幼苗移至營(yíng)養(yǎng)土的小盆中于生長(zhǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)至2周大，不澆水14 d作干旱處理，對(duì)照正常3 d澆一次水。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試驗(yàn)：正常條件下土壤中生長(zhǎng)2周的擬南芥，脫水作干旱處理2 h后取樣，用含有100 mmol·L-1NaCl的溶液澆灌擬南芥作鹽處理6 h后取樣。

1.2 基因注釋及氨基酸比對(duì)分析

通過(guò)NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和MaizeGDB（https://maizegdb.org）等數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站，搜索下載相關(guān)PIP基因信息，包含目的基因的全長(zhǎng)基因組序列，全長(zhǎng)cDNA序列和氨基酸序列。目的基因的基因序列號(hào)為：AF326495/GRMZM2G047368。將所有進(jìn)行比對(duì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成FASTA格式合并導(dǎo)出，通過(guò)MegAlign軟件進(jìn)行Clustal V多序列比對(duì)分析，比對(duì)參數(shù)用默認(rèn)值，生成比對(duì)報(bào)告文件。

1.3 亞細(xì)胞定位

以玉米葉片cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增的全長(zhǎng)CDS序列（除去終止密碼子）并測(cè)序驗(yàn)證，連接到西南大學(xué)玉米研究所改造載體pCAMBIA1302，構(gòu)建ZmPIP2;6-GFP融合表達(dá)載體。將ZmPIP2;6-GFP融合表達(dá)載體和質(zhì)膜定位標(biāo)記載體PM107（AtPIP2A-mCherry融合表達(dá)載體）[39]分別通過(guò)PEG介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。玉米葉肉原生質(zhì)體的分離提取以及PEG介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化是參照前人報(bào)道的方法上進(jìn)行改進(jìn)[40]。每個(gè)載體分別準(zhǔn)備10 μg質(zhì)粒DNA制備成0.2 mL的原生質(zhì)體懸浮液，黑暗條件下23℃培養(yǎng)12—16 h，在激光共聚焦顯微鏡（LSM800，Carl Zeiss）下觀察熒光。所用引物序列見(jiàn)電子附表1。

1.4 轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因材料的培育

以玉米葉片cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)酶切位點(diǎn)HⅠ和Ⅰ連接到西南大學(xué)玉米研究所改造的含有花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子的雙元轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3300。將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA101中，通過(guò)浸花序法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。T0、T1和T2代轉(zhuǎn)基因種子通過(guò)含有草丁膦（Glufosinate，5 mg·L-1，Sigma）的MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并通過(guò)PCR和qRT-PCR進(jìn)行鑒定。

1.5 RNA的提取及qRT-PCR

玉米或擬南芥樣品快速采集放置在液氮里并于-80℃保存。使用RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN）試劑盒提取總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Scientific）試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過(guò)SYBR Green（TOYOBO, OSAKA）和定量?jī)xCFX96 TouchTMCycler（Bio-Rad）進(jìn)行qRT-PCR分析。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃10 s；58℃10 s；72℃10 s。每個(gè)樣品2個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。設(shè)計(jì)定量引物時(shí)，避開(kāi)ZmPIPs蛋白序列中的保守基序序列。分別利用玉米內(nèi)參基因、擬南芥內(nèi)參基因（正常條件下）和（水分脅迫條件下，在不同植株中的表達(dá)水平較一致）在各個(gè)cDNA樣品中的表達(dá)量，樣品間同一基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)公式計(jì)算：2-ΔΔct。相應(yīng)引物序列見(jiàn)電子附表1。

1.6 水分散失率測(cè)定

正常土培條件下生長(zhǎng)2周的野生型和超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥，摘下整個(gè)擬南芥植株的地上部分，放在穩(wěn)定環(huán)境中實(shí)驗(yàn)臺(tái)的濾紙上，5 h內(nèi)每小時(shí)稱取鮮重。水分散失率通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的樣品鮮重進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 ZmPIP2;6的氨基酸序列分析

玉米MIP家族含有個(gè)31水通道蛋白基因，其中包括13個(gè)。進(jìn)一步又分為2個(gè)亞類：6個(gè)和7個(gè)。目的蛋白ZmPIP2;6的蛋白結(jié)構(gòu)保守，具有PIP蛋白的典型結(jié)構(gòu)，包括保守基序HINPAVTFG（黑色方框）和2個(gè)NPA基序（灰色陰影）（圖1）。將ZmPIP2;6與其他物種已知參與水分脅迫響應(yīng)的PIP蛋白（TaAQP8、TaAQP7、OSPIP1;1、NaAQP1、MusaPIP1;2、HvPIP2;5、HvPIP1;1和GmPIP1;6）氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，ZmPIP2;6與其他植物物種的PIP蛋白具有很高的同源性（圖1）。

2.2 ZmPIP2;6的亞細(xì)胞定位

通過(guò)將ZmPIP2;6融合GFP蛋白（ZmPIP2;6-GFP）和質(zhì)膜定位標(biāo)記蛋白（PM107）在玉米原生質(zhì)體中共表達(dá)，分析目的蛋白定位（圖2）。結(jié)果顯示，ZmPIP2;6的綠色熒光能與PM107的紅色熒光完全重合，ZmPIP2;6定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。

2.3 ZmPIP2;6的表達(dá)分析

為了檢測(cè)在玉米不同組織中的表達(dá)情況，分別采集玉米的不同組織（根、莖、葉、未成熟雌穗、未成熟雄穗、胚和胚乳）。提取總RNA并進(jìn)行qRT-PCR分析，可知，在這幾個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，在雄穗中表達(dá)量最高，其次在根中表達(dá)量較高，而在胚乳中的表達(dá)量相對(duì)較低（圖3-A）。

在人工氣候室條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)玉米幼苗，向營(yíng)養(yǎng)液中添加10%的PEG6000進(jìn)行滲透處理或100 mmol·L-1的NaCl進(jìn)行鹽處理，取樣進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，滲透脅迫處理下，玉米根中的表達(dá)在0.5、1和2 h顯著上調(diào)，并在4 h后表達(dá)呈下降趨勢(shì)；玉米葉中的表達(dá)在0.5和1 h時(shí)受到顯著抑制，但在2 h顯著上調(diào)，之后呈下降趨勢(shì)（圖3-B）。鹽處理下，玉米根和葉中的表達(dá)分別在處理早期（根6 h、葉6 h和12 h）受到抑制，表達(dá)下調(diào)；在處理后期（根12 h和1 d、葉1 d）顯著上調(diào)，之后再呈下降趨勢(shì)（圖3-C）。推測(cè)在玉米受到滲透和鹽脅迫后根和葉中表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明可能參與玉米水分脅迫響應(yīng)過(guò)程。

2.4 ZmPIP2;6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得及鑒定

為了進(jìn)一步研究在水分脅迫中的作用，把的CDS序列連接到含有CaMV 35S啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體中（圖4-A）。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花序法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。對(duì)T1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行分子鑒定，利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)化載體上篩選標(biāo)記基因進(jìn)行擴(kuò)增。有4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均能擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明其均為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系（圖4-B）。對(duì)T2的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)在擬南芥中的超表達(dá)效果（圖4-C），結(jié)果顯示，T2轉(zhuǎn)基因株系中，超表達(dá)（Overexpression，-OE）株系OE1—OE4中都能檢測(cè)到的表達(dá)并且不同株系的表達(dá)有差異。選擇了超表達(dá)株系OE1、OE2和OE3用作后期試驗(yàn)。

圖1 PIPs氨基酸序列比對(duì)

ZmPIP2;6-GFP載體與mCherry標(biāo)記的質(zhì)膜標(biāo)記（mCherry-PM；CD3-1007）共定位。標(biāo)尺為20 μm

A：ZmPIP2;6在根、莖、成熟葉、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳中的相對(duì)表達(dá)情況；B：ZmPIP2;6在含有10% PEG營(yíng)養(yǎng)液處理后的三葉期玉米幼苗中的表達(dá)；C：ZmPIP2;6在含有100 mmol·L-1 NaCl的營(yíng)養(yǎng)液處理后的三葉期玉米幼苗中的表達(dá)

2.5 ZmPIP2;6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性鑒定

將超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥（- OE）和野生型（WT）植株播種到正常MS培養(yǎng)基上，在正常條件下生長(zhǎng)5 d后轉(zhuǎn)移到含有100 mmol·L-1NaCl和150 mmol·L-1甘露醇的培養(yǎng)基上分別進(jìn)行鹽脅迫或滲透脅迫處理7 d（圖5）。結(jié)果顯示，正常條件下，-OE和WT植株的生長(zhǎng)沒(méi)有差異；在鹽脅迫或滲透脅迫處理下，-OE和WT植株地上部分和根的生長(zhǎng)都受到明顯地抑制，其中地上部分受抑制程度沒(méi)有差異，但是-OE植株主根長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于WT。相應(yīng)的擬南芥主根長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果與照片一致，說(shuō)明超表達(dá)增強(qiáng)擬南芥植株對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的耐性。

進(jìn)一步的土培干旱試驗(yàn)中，-OE和WT植株在正常條件下生長(zhǎng)2周，2種材料生長(zhǎng)情況沒(méi)有差異（圖6-A）。進(jìn)行4周的干旱處理后，-OE和WT植株均出現(xiàn)萎焉情況，但-OE植株的萎焉程度沒(méi)有WT植株嚴(yán)重。再進(jìn)行3 d的復(fù)水處理后，-OE植株幾乎完全恢復(fù)生長(zhǎng)，存活下來(lái)；但WT植株不能恢復(fù)生長(zhǎng)，完全死亡（圖6-A）。對(duì)2種材料的地上部分進(jìn)行水分散失率測(cè)定發(fā)現(xiàn)，WT植株每小時(shí)的水分散失率都顯著高于-OE植株，在測(cè)定5 h后，與起始鮮重相比，WT失去68%的水分，而-OE植株平均失去約57%水分（圖6-B）。結(jié)果說(shuō)明，擬南芥中超表達(dá)可能通過(guò)降低水分散失率從而提高植物對(duì)干旱脅迫的耐性。

A：ZmPIP2;6超表達(dá)載體的T-DNA序列示意圖；B：ZmPIP2;6超表達(dá)T1代轉(zhuǎn)基因株系的PCR檢測(cè)；1—5：獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系，MK：DNA Marker，PC：質(zhì)粒正對(duì)照，NC：野生型負(fù)對(duì)照；C：3個(gè)獨(dú)立的ZmPIP2;6超表達(dá)T2代轉(zhuǎn)基因株系的qRT-PCR分析

*P＜0.01。下同The same as below

A：野生型和ZmPIP2;6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在正常對(duì)照和干旱條件下生長(zhǎng)14 d以及復(fù)水3 d后的表型。B：WT和ZmPIP2;6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系葉片水分散失率的檢測(cè)

2.6 脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析

為了檢測(cè)是否影響擬南芥脅迫響應(yīng)通路，對(duì)、和等分別參與擬南芥特定脅迫信號(hào)通路的基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。正常條件下土壤中生長(zhǎng)2周的擬南芥，分別在正常條件下脫水2 h作干旱處理，用含有100 mmol·L-1NaCl的溶液澆灌作鹽處理6 h后取樣。分別取葉和根樣并提取RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)擬南芥脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)（圖7）。結(jié)果顯示，在正常條件下，和的表達(dá)在WT和-OE植株中并沒(méi)有差異；在干旱和鹽處理?xiàng)l件下，和的表達(dá)在WT和-OE植株中都受到誘導(dǎo)，但在- E植株中的表達(dá)顯著低于WT。在正常和干旱處理?xiàng)l件下，的表達(dá)在WT和-OE植株中并沒(méi)有差異；在鹽處理?xiàng)l件下，的表達(dá)在WT中都顯著上調(diào)，在-OE植株中的表達(dá)顯著低于WT。在正常條件下，-OE植株中的表達(dá)顯著高于WT；在干旱條件下，的表達(dá)在WT和-OE植株中并沒(méi)有差異；在鹽處理?xiàng)l件下，的表達(dá)在WT和-OE植株中都受到誘導(dǎo)，并且在-OE植株中的表達(dá)顯著高于WT。這些結(jié)果說(shuō)明，在干旱或鹽脅迫條件下，在擬南芥中超表達(dá)會(huì)影響植物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，可能在植物水分脅迫響應(yīng)通路中起著重要的調(diào)控作用。

3 討論

玉米基因組中已經(jīng)證實(shí)含有31個(gè)AQP基因[8]，其中包括13個(gè)PIP基因，本研究中，ZmPIP2;6與其他植物物種中參與水分脅迫的PIP蛋白具有很高的同源性（圖1）。氨基酸序列顯示ZmPIP2;6具有典型的PIP蛋白結(jié)構(gòu)，包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，保守的HINPAVTFG氨基酸序列和2個(gè)NPA基序（圖1）。通過(guò)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體顯示，ZmPIP2;6蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜（圖2）。在玉米各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在雄穗中表達(dá)量最高（圖3-A），推測(cè)雄穗中的高表達(dá)量可能與玉米生育期對(duì)水分的大量需求有關(guān)，這個(gè)結(jié)果也與前人的研究結(jié)果一致[37,41]。滲透或鹽脅迫引起的水分脅迫會(huì)對(duì)AQP基因表達(dá)產(chǎn)生復(fù)雜的影響[29]。本研究中玉米植株對(duì)PEG引起的滲透脅迫響應(yīng)非常迅速，根中的表達(dá)在0.5 h受到顯著誘導(dǎo)，葉中的表達(dá)則是先下調(diào)，再在2 h顯著上調(diào)（圖3-B）。王衛(wèi)鋒等[31]報(bào)道在PEG處理及復(fù)水時(shí)期玉米根的不同區(qū)段中的的轉(zhuǎn)錄水平顯示出差異性調(diào)節(jié)，其中表達(dá)在脅迫時(shí)顯著下調(diào)，復(fù)水后4個(gè)的表達(dá)都受到誘導(dǎo)，其差異可能是由于玉米根不同區(qū)段的結(jié)構(gòu)和功能差異所引起的。在鹽脅迫條件下AQP基因的表達(dá)可分為2個(gè)階段。鹽脅迫響應(yīng)初期，植物通常會(huì)抑制PIP基因的表達(dá)，從而避免當(dāng)土壤水勢(shì)降低時(shí)水分從根部向外界環(huán)境中流失[42-43]。一段時(shí)間以后，植物會(huì)誘導(dǎo)PIP基因的表達(dá)從而恢復(fù)根部導(dǎo)水率[44-45]。本研究中在鹽處理的2個(gè)階段，鹽脅迫初期（根6 h，葉6和12 h）在玉米根和葉中的表達(dá)下降，鹽脅迫后期（根12 h和1 d，葉1 、3和5 d）在玉米根和葉中的表達(dá)升高（圖3-C）。Zhu等[30]報(bào)道鹽或ABA處理玉米后，根中部分在短期內(nèi)有短暫的表達(dá)上調(diào)。滲透或鹽脅迫條件下，的表達(dá)受到不同程度的誘導(dǎo)，推測(cè)可能參與玉米對(duì)滲透和鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

圖7 擬南芥脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析

近幾年的研究已經(jīng)證實(shí)了植物中某些PIP基因在植物對(duì)干旱或鹽等非生物脅迫的耐性中的重要作用[24,32-35,46]。超表達(dá)特定的PIP基因可能會(huì)對(duì)干旱或鹽脅迫耐性起正面作用或負(fù)面作用[47]，一些報(bào)道稱，超表達(dá)某些PIP基因能增強(qiáng)植物對(duì)于干旱或鹽脅迫的耐性。例如，在酵母和擬南芥中超表達(dá)都顯示其在滲透和鹽脅迫耐性上的重要作用[36]等。而另一些研究則顯示，超表達(dá)一些PIP基因使植物對(duì)于干旱或鹽脅迫更加敏感[48-49]。例如，在水稻中超表達(dá)大麥?zhǔn)罐D(zhuǎn)基因水稻對(duì)鹽脅迫的耐性降低[49]；煙草中超表達(dá)擬南芥也降低了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱脅迫的耐性[48]。PIP蛋白在植物中具有高度的多樣性及序列同源性，但是在不同植物中PIP基因在脅迫拮抗中表現(xiàn)出不同表達(dá)模式，可能說(shuō)明PIP在不同植物中的功能多樣化。本研究中，通過(guò)構(gòu)建的超表達(dá)載體并發(fā)展超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥材料（圖4）。MS培養(yǎng)基中滲透或鹽脅迫處理下的-OE植株根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于WT，說(shuō)明其根的生長(zhǎng)受到的抑制相對(duì)WT更少（圖5），-OE對(duì)滲透和鹽脅迫的耐性增強(qiáng)。進(jìn)一步土培試驗(yàn)中-OE同樣顯示出相對(duì)WT更強(qiáng)的干旱脅迫耐性（圖6）。這些結(jié)果都說(shuō)明，擬南芥中超表達(dá)會(huì)對(duì)滲透、鹽或干旱脅迫耐性起正面作用，既能提高植株在較溫和的缺水脅迫條件下（7 d的100 mmol·L-1NaCl和150 mmol·L-1甘露醇處理）的耐性，也能增強(qiáng)植株在長(zhǎng)期嚴(yán)重缺水條件下（2周的干旱處理）的耐性，并且在后者條件下顯示出更強(qiáng)的耐性表型。推測(cè)在植物受到長(zhǎng)期干旱脅迫過(guò)程中起著重要的水分平衡功能。本研究中使用的3個(gè)獨(dú)立的擬南芥轉(zhuǎn)基因超表達(dá)株系，其中，OE2株系的表達(dá)量顯著高于另外2個(gè)株系但耐性表型卻相似。推測(cè)超表達(dá)擬南芥耐性的增強(qiáng)不僅需要ZmPIP2;6蛋白在植物水分調(diào)控過(guò)程中行駛重要功能，可能還需要ZmPIP2;6蛋白與其他PIP蛋白或其他調(diào)控形式的協(xié)同作用。

和是ABA誘導(dǎo)表達(dá)基因[50]，在干旱和鹽處理?xiàng)l件下，和的表達(dá)在WT和-OE中都受到誘導(dǎo)，但在-OE中的表達(dá)顯著低于WT（圖7）。SOS1是植物細(xì)胞質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體[51]，SOS3在鹽脅迫中具有鈣離子感應(yīng)體的功能，鹽脅迫能引起瞬時(shí)的鈣離子濃度增加，并能被SOS3感應(yīng)[52]。SOS3能夠通過(guò)與SOS2互作形成SOS2/SOS3激酶復(fù)合體磷酸化并激活SOS1[53-54]。NHX1是將Na離子轉(zhuǎn)運(yùn)到植物液泡中的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體[55]，其活性也受SOS通路調(diào)控[56]。前期報(bào)道稱在擬南芥中超表達(dá)、或都能增加植物的耐鹽性[55,57-58]。本研究中在正常條件下，-OE中的表達(dá)顯著高于WT；在鹽處理?xiàng)l件下，的表達(dá)在WT和-OE中都受到誘導(dǎo)，并且在-OE中的表達(dá)顯著高于WT；和的表達(dá)在WT和-OE中沒(méi)有顯著差異（結(jié)果未顯示）。鹽處理使得的表達(dá)在WT中顯著上調(diào)，但在-OE中的表達(dá)卻沒(méi)有受到誘導(dǎo)（圖7）。在其他一些研究中也曾報(bào)道，在植物中超表達(dá)特定的水通道蛋白基因后，在水分脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植物的脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)發(fā)生不同程度變化[24,59]。本研究結(jié)果顯示，在干旱或鹽脅迫條件下，擬南芥中超表達(dá)可能會(huì)影響植物脅迫響應(yīng)基因的調(diào)控。

4 結(jié)論

玉米內(nèi)在質(zhì)膜蛋白基因的表達(dá)在滲透或鹽脅迫下受到誘導(dǎo)，在擬南芥中超表達(dá)會(huì)增強(qiáng)植株對(duì)滲透脅迫、干旱脅迫和鹽脅迫的耐性，并且在干旱或鹽脅迫條件下會(huì)影響擬南芥中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。推測(cè)可能參與植物對(duì)水分脅迫的應(yīng)答過(guò)程。

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Functional Characterization of a Maize Plasma Membrane Intrinsic Protein ZmPIP2;6 Responses to Osmotic, Salt and Drought Stress

ZHOU Lian, XIONG Yuhan, HONG Xiangde, ZHOU Jing, LIU Chaoxian, WANG Jiuguang, WANG Guoqiang, CAI Yilin

(Maize Research Institute, College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】Plasma membrane Intrinsic Proteins (PIPs) exist widely in the membrane system of plant cells, which are essential to water transport and water balance in plant. The aim of this study is to explore the function of ZmPIP2;6 in plant water stress tolerance, and provide potential gene resources for new varieties of stress tolerance maize breeding. 【Method】Amino acid sequences of ZmPIP2;6 was analyzed and compared with other PIPs that involved in water stress tolerance. To verify the subcellular localization of ZmPIP2;6,ZmPIP2;6-GFP infusion vector was constructed and assessed using maize protoplasts isolated from leaves of maize seedlings. Tissues fromroot, stem, mature leaf, immature tassel, immature ear, endosperm and embryo of maize were isolated. Samples from root and leaf of maize were collected at different time after PEG or NaCl treatment. Total RNA were extracted, and expression pattern ofwas investigated by qRT-PCR. Transgenicplants that overexpressedwere generated and identified. The phenotype ofoverexpression transgenicthat tolerated to osmotic, salt or drought stress were monitored and primary root length and leaf water loss rate were measured. A number of stress responsive genes inoverexpressionwere detected under drought or salt condition.【Result】Analysis and comparison of the amino acid sequences showed that ZmPIP2;6shared the same conserved structural domains andhad a high degree of sequence similarity with other PIPs. The subcellular localization was assessed using maize protoplasts indicated ZmPIP2;6 was located on the plasma membrane. qRT-PCR result showed thatwas highly expressed in tassel. Treatment with PEG or NaCl resulted in induced expression ofshowed enhanced osmotic and salt stress tolerance in MS media plate and improved drought stress tolerance in soil condition compared to wild type. Expressions of related genes in the stress signaling pathway were changed inoverexpressionunder drought or salt condition. 【Conclusion】 Expression ofwas up-regulated under osmotic or salt stress condition. Overexpression ofenhanced osmotic, salt and drought stress tolerance. A number of stress responsive genes inoverexpressionwere affected under salt or drought stress condition. These results indicated that ZmPIP2;6 might be involved in plant water stress responsive pathway.

maize (L.); plasma membrane intrinsic proteins; osmotic stress; drought stress; salt stress

2019-07-03；

2019-08-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31601312）

周練，E-mail：zhoulianjojo@swu.edu.cn。熊雨涵，E-mail：xiongyh11@163.com。周練和熊雨涵為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者蔡一林，E-mail：caiyilin@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）