番茄斑駁花葉病毒在我國茄科作物上的發(fā)生及生物學(xué)特性

李月月，周文鵬，路思倩，陳德榮，戴劍鴻，郭喬優(yōu)，劉勇，李凡，譚冠林,4

番茄斑駁花葉病毒在我國茄科作物上的發(fā)生及生物學(xué)特性

李月月1,5，周文鵬1，路思倩1，陳德榮1，戴劍鴻2，郭喬優(yōu)2，劉勇3，李凡1，譚冠林1,4

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2元謀縣植保植檢站，云南元謀 651300；3湖南省植物保護(hù)研究所，長沙 410125；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)中心，昆明 650201；5洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽 471934）

【目的】鑒定煙草花葉病毒屬（）新種番茄斑駁花葉病毒（，ToMMV）當(dāng)前在我國茄科作物上的發(fā)生危害情況、主要分布地區(qū)和自然寄主，明確其主要寄主范圍、傳播途徑和致病性等生物學(xué)特性?！痉椒ā坷肦T-PCR方法對2013—2017年采自我國云南、貴州、四川、海南、湖南、河南、陜西、山東、湖北、浙江、遼寧、西藏和內(nèi)蒙古13個?。ㄗ灾螀^(qū)），表現(xiàn)為花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死等疑似病毒病癥狀的茄科作物辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯和煙草等樣品進(jìn)行ToMMV的檢測。分別將ToMMV進(jìn)行摩擦接種和注射接種，對感染ToMMV的珊西煙獲得的種子及由種子萌發(fā)的幼苗進(jìn)行ToMMV檢測，對由健康種子萌發(fā)且在含有ToMMV毒源土壤中生長的6—8葉齡辣椒和番茄幼苗進(jìn)行ToMMV檢測，以此開展ToMMV傳播方式的測試。在茄科、葫蘆科、豆科和十字花科等6科30種植株上開展ToMMV的寄主范圍鑒定和不同辣椒、番茄材料對ToMMV的抗性鑒定?！窘Y(jié)果】我國13個?。▍^(qū)）共采集茄科作物疑似病毒病樣品1 622份，ToMMV的平均檢出率為2.59%，目前ToMMV已在我國云南、湖南、海南、遼寧、陜西、西藏和內(nèi)蒙古7個?。▍^(qū)）發(fā)生。其中云南、湖南、海南、陜西和西藏的辣椒上有ToMMV的發(fā)生，而云南、海南、遼寧及內(nèi)蒙古的番茄上有ToMMV的發(fā)生，平均檢出率分別為2.51%和3.46%，尚未在茄子、馬鈴薯和煙草樣品中檢測到ToMMV的侵染。ToMMV可通過摩擦、注射、種子帶毒及土壤帶毒進(jìn)行傳播，且種子帶毒率越高，對種苗生長的影響越大；寄主范圍測試發(fā)現(xiàn)，ToMMV可侵染幾乎所有供試的茄科和十字花科植物，及部分豆科和葫蘆科植物。篩選出對ToMMV免疫的辣椒材料1份、高抗的辣椒材料2份以及對ToMMV高抗的番茄材料2份?！窘Y(jié)論】ToMMV目前已在我國辣椒、番茄上發(fā)生，人工條件下ToMMV的寄主范圍較廣，致病力強(qiáng)，在我國有逐漸擴(kuò)散和流行的趨勢，很可能會成為未來蔬菜作物尤其是茄科作物上危害嚴(yán)重的主要病毒之一。

番茄斑駁花葉病毒；茄科作物；發(fā)生分布；傳播方式；致病性

0 引言

【研究意義】番茄斑駁花葉病毒（，ToMMV）為近幾年發(fā)現(xiàn)的煙草花葉病毒屬（）的一種新成員，該病毒的致病力比同屬的煙草花葉病毒（，TMV）和番茄花葉病毒（，ToMV）均強(qiáng)，且自該病毒首次被發(fā)現(xiàn)以來，已在越來越多的國家被發(fā)現(xiàn)。盡快了解和掌握ToMMV目前在我國的發(fā)生情況、分布地區(qū)和自然寄主，以及病毒的寄主范圍和傳播方式等生物學(xué)特性對ToMMV的預(yù)測防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ToMMV是2013年首次在墨西哥番茄（）上發(fā)現(xiàn)的一個新種[1]，同年筆者實(shí)驗(yàn)室在我國西藏自治區(qū)拉薩市和云南省元謀縣的辣椒（）上也發(fā)現(xiàn)了該病毒，并于2014年進(jìn)行了報道[2]。2015—2019年美國的弗羅里達(dá)和紐約[3-4]、以色列[5]、西班牙[6]、巴西[7]、中國[8-9]等相繼報道了番茄上ToMMV的侵染。2018年我國山東、河南、遼寧和河北的茄子（）上也報道了ToMMV的侵染[10]。GenBank中已公布的來自伊朗的病毒分離物HQ593616、JX112024、JX112025、JX121570、JX121574、JX121575、JX121576，來自巴西的病毒分離物AF411922、AM411425、AM411430[11]以及中國病毒分離物JX025564在ToMMV被鑒定成為一個新種之前，均被認(rèn)為是ToMV，而根據(jù)核苷酸序列的同源性比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些病毒分離物外殼蛋白（coat protein，CP）基因的核苷酸序列與ToMMV的同源性在97.7%—99.2%，所以這些ToMV分離物應(yīng)該也是ToMMV，其中2003年在巴西發(fā)現(xiàn)的番茄分離物（AF41192）可能是第一個被發(fā)現(xiàn)的ToMMV分離物。這些病毒分離物有的來自番茄（AF411922、JX025564、JX112024、JX112025、JX121575和JX121576），有的來自辣椒（AM411425、AM411430和JX121574），有的來自菜豆（）（JX121570），還有的來自墻生藜（）（HQ593616）。由此推斷，ToMMV很可能早就在國內(nèi)外很多地區(qū)發(fā)生，而且可能是侵染茄科作物的主要病毒之一，除了茄科作物外，ToMMV還可以侵染豆科和藜科作物，只是由于被誤認(rèn)為是與ToMMV全基因組序列同源性達(dá)84.3%的ToMV而被忽略[8,12]。將ToMMV人工接種至辣椒、番茄、煙草等茄科作物上，感病植株表現(xiàn)嚴(yán)重花葉、泡斑、畸形、壞死，生長期縮短，比同一環(huán)境下接種TMV的植物表現(xiàn)癥狀更為嚴(yán)重[12]。Sui等[13]通過人工接種，將ToMMV和ToMV分別接種至7科27種植物上，發(fā)現(xiàn)ToMMV可以侵染茄科大部分植物，比ToMV的寄主范圍更廣，侵染性更強(qiáng)，ToMMV可以系統(tǒng)性侵染珊西煙（var. xanthi nc）和曼陀羅（），但ToMV在珊西煙和曼陀羅上無明顯癥狀，且有些對ToMV有抗性的番茄品種卻可以被ToMMV系統(tǒng)性侵染；Ambrós等[6]將ToMMV西班牙分離物人工接種到番茄、辣椒、本氏煙（）、昆諾藜（）和擬南芥（）等植物上，發(fā)現(xiàn)ToMMV對這些接種植物均可侵染，除擬南芥外，其余幾種植物發(fā)病癥狀均比較明顯?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然ToMMV及其引起的病毒病目前在中國尚未出現(xiàn)大發(fā)生及流行，但是一旦具備合適的氣候、感病品種等有利于病害發(fā)生的條件，ToMMV很有可能會在茄科作物上大面積發(fā)生，而一旦暴發(fā)，對茄科作物造成的損失將非常嚴(yán)重。近年來番茄褪綠病毒（，ToCV）在我國多地暴發(fā)流行并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的案例[14-18]，顯示對新發(fā)病害前期基礎(chǔ)研究不夠充分帶來的嚴(yán)重后果，因此，亟需加強(qiáng)對ToMMV的研究以防范其在我國的流行危害。【擬解決的關(guān)鍵問題】全面普查我國13個?。ㄗ灾螀^(qū)）尤其是云南省主要茄科作物上ToMMV的發(fā)生與分布，測試ToMMV的寄主范圍和傳播方式，開展不同辣椒和番茄材料對ToMMV的抗性鑒定，并分析ToMMV在國內(nèi)的發(fā)生趨勢，為該病毒的預(yù)防及綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣本來源 ToMMV檢測的樣品為2013年4月至2017年10月，在我國云南、貴州、四川、湖南、海南、河南、陜西、山東、湖北、浙江、遼寧、西藏和內(nèi)蒙古13個省（自治區(qū)）采集/收集的表現(xiàn)為花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死等疑似病毒病癥狀的茄科作物樣品1 622份，其中辣椒樣品958份、番茄樣品520份、茄子樣品19份、馬鈴薯（）樣品50份、煙草樣品75份。ToMMV初始毒源為感染ToMMV單一病毒的辣椒樣品，后期寄主范圍測定毒源為再次接種至珊西煙進(jìn)行擴(kuò)繁的珊西煙樣品。所有采集的樣品均于-80℃或-20℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ToMMV傳播方式測定材料 摩擦和注射鑒定材料為健康的黃花煙（）和珊西煙；種傳鑒定材料為自然條件下感染ToMMV的辣椒種子、ToMMV接種并感病的珊西煙種子；土傳鑒定材料為健康的辣椒和番茄種子、滅菌無毒土壤，培育過感染了ToMMV的辣椒和番茄植株且檢測到ToMMV的土壤。

1.1.3 ToMMV寄主范圍測定供試植物 茄科的辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯、普通煙（N. tobacum）、本氏煙、黃花煙、珊西煙、三生煙（N. tabacum var. samsun）、心葉煙（N. glutinosa）、矮牽牛（Petunia hybrida）、酸漿（Physalis alkekengi）、假酸漿（Nicandra physaloides）、曼陀羅；十字花科的大白菜（Brassica pekinensis）、青菜（B. chinensis）、青花菜（B. oleacea var. italica）、花椰菜（B. oleracea var. botrytis）、油菜（B. campestris）、蘿卜（Raphanus sativus）；葫蘆科的西葫蘆（Cucurbita pepo）、黃瓜（Cucumis sativus）、南瓜（Cucurbita moschata）、絲瓜（Luffa cylindrica）、苦瓜（Momordica charantia）；豆科的菜豆、豇豆（Vigna unguiculata）、豌豆（Pisum sativum）；旋花科的蕹菜（Ipomoea aquatica），藜科的昆諾藜，共6科30種植物。

1.1.4 辣椒和番茄抗性鑒定供試材料 接種測試的辣椒材料有10份，分別為當(dāng)前云南市場所售和實(shí)驗(yàn)室收集保存，其中韓國原種朝天椒、8819線椒、金滿田II號、丘北辣、日本朝天椒、日本高抗天鷹椒、新隴2號和甜椒王這8個品種為云南市場所售，野生小辣椒和小米辣為筆者實(shí)驗(yàn)室在云南當(dāng)?shù)厮占?。接種測試的番茄材料共10份，為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所張戰(zhàn)泓研究員提供，分別為T596小櫻桃、鉆紅1號、T3108、TM40456、T3068粉果、T808、TM3167、寶石F1、T367和T364。

1.1.5 試劑 反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、PCR擴(kuò)增試劑盒TaKaRaTM以及克隆連接載體pMD19-T simple Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒Universal DNA Purification Kit購自天根生化科技（北京）有限公司。DH5菌株為筆者實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總核酸提取、RT-PCR擴(kuò)增 利用CTAB法，從疑似病毒病樣本中提取病株總核酸[19]。其中土壤樣本總核酸的提取也采用CTAB法，但不宜采用高通量組織研磨儀，應(yīng)在滅菌的研缽中加入液氮進(jìn)行研磨，將研磨后的土壤粉末加入1.5 mL滅菌離心管1/3處，加入1.2 mL CTAB緩沖液（含0.2%-巰基乙醇）；混勻后離心管放入65℃水浴中保溫45—60 min，保溫過程中不時顛倒離心管充分混勻；水浴完成后，4℃，13 000 r/min離心10 min，取650 μL上清液至一新的1.5 mL滅菌離心管中，按1﹕1比例加入氯仿/異戊醇（24﹕1），渦旋振蕩混勻30 s；之后再次4℃，13 000 r/min離心10 min，取500 μL上清液至一新的1.5 mL滅菌離心管中，加入350 μL異丙醇，反復(fù)顛倒數(shù)次，室溫放置10 min后4℃，13 000 r/min離心15 min，小心地用微量移液器吸除上清丟棄；最后向沉淀中加入75%乙醇1 mL，4℃，13 000 r/min離心10 min，小心地用微量移液器吸除上清丟棄，室溫下自然干燥10—30 min，至沉淀完全干燥；干燥后根據(jù)沉淀的量加入適量（70—100 μL）ddH2O至核酸沉淀，置于冰上30 min后離心振蕩使沉淀充分溶解，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

以提取的樣品總核酸為模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA，檢測引物為ToMMV特異性檢測引物ToMMVdF（CTGGAGAAGACTGGGTCTAG）/ToMMVdR（TTCGGTAAGTTCAATGGGACCT）。反轉(zhuǎn)錄（10 μL體系）方法：將含2 μL核酸模板、1 μL下游引物ToMMVdR、3 μL ddH2O的混合樣混勻后，70℃下反應(yīng)10 min，迅速拿出，置冰上冷卻3 min，依次加入含2 μL 5×M-MLV Buffer、0.5 μL dNTP Mixture（10 mmol·L-1each）、0.5 μL RTase M-MLV（RNase H-）和1 μL ddH2O的混合液，42℃反應(yīng)1 h，70℃下15 min終止反應(yīng)。PCR（10 μL）反應(yīng)體系：上述合成的cDNA模板1 μL、6.7 μL ddH2O，1 μL 10×PCR Buffer（Mg2+plus）、0.8 μL dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）、上游引物ToMMVdF和下游引物ToMMVdR各0.2 μL，0.1 μL TaKaRa。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min；4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.2 克隆和測序 參照DNA純化回收試劑盒說明書割膠純化目標(biāo)PCR產(chǎn)物，回收目的片段與載體pMD19-T simple連接，轉(zhuǎn)化DH5，菌落PCR篩選陽性克隆。陽性克隆測序由華大基因科技有限公司完成，測序結(jié)果提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比對分析。

1.2.3 生物學(xué)接種 當(dāng)供試植物幼苗在4—5片真葉期時用常規(guī)摩擦接種方法和注射接種方法分別進(jìn)行接種。注射接種方法：用PBS緩沖液（NaCl 136 mmol·L-1，KCl 2.7 mmol·L-1，Na2HPO4·12H2O 8 mmol·L-1，KH2PO41.5 mmol·L-1，pH 7.2）浸泡ToMMV染病葉片1 h后充分研磨，6 000 r/min稍離心后取上清，接種前先用1 mL注射器針頭在接種植株葉片扎孔數(shù)個，注射器吸取上清后從葉片背面輕輕注射，注射時按住注射孔另一端以免溢出。

1.2.4 ToMMV種傳和土傳測試 種傳測試方法：對感染ToMMV的珊西煙獲得的種子進(jìn)行ToMMV檢測，并對土壤進(jìn)行高溫高壓滅菌和ToMMV檢測以確保土壤不帶毒，將檢測后確定攜帶ToMMV的珊西煙種子150粒播種到不含ToMMV的滅菌土壤上，播種30 d后，對珊西煙幼苗進(jìn)行ToMMV檢測。土傳測試方法：對辣椒、番茄種子及培育過感染ToMMV的辣椒和番茄植株的土壤（可能含ToMMV病殘體）分別進(jìn)行ToMMV檢測，在確定辣椒和番茄種子不攜帶ToMMV而土壤中含有ToMMV后，將健康的辣椒和番茄種子播種到含有ToMMV的土壤中，待辣椒和番茄幼苗長至6—8葉期，對其進(jìn)行ToMMV檢測。

1.2.5 辣椒和番茄種質(zhì)資源對ToMMV的抗/感性鑒定 ToMMV為的新成員，目前尚無對其病級劃分標(biāo)準(zhǔn)和抗性鑒定等相關(guān)技術(shù)規(guī)程，因此本文中辣椒和番茄對ToMMV抗性鑒定的病級劃分標(biāo)準(zhǔn)和抗性鑒定技術(shù)規(guī)程均分別參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2060.3—2011辣椒抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第3部分的辣椒抗煙草花葉病毒病鑒定技術(shù)規(guī)程和NY/T 1858.6—2010番茄主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第6部分的番茄抗番茄花葉病毒病鑒定技術(shù)規(guī)程。病情指數(shù)DI=100×∑（病級值×該病情級別的植株數(shù)）/（最高病級值×調(diào)查總植株數(shù)）。根據(jù)抗病程度分為免疫（I）、高抗（HR）、抗?。≧）、中抗（MR）、感?。⊿）、高感（HS）6大類，辣椒抗性鑒定結(jié)果對應(yīng)的病情指數(shù)（DI）分別為DI=0、0＜DI＜10、10≤DI＜20、20≤DI＜40、40≤DI＜60、60≤DI＜100；番茄抗性鑒定結(jié)果對應(yīng)的病情指數(shù)分別為DI=0、0＜DI＜10、10≤DI＜30、30≤DI＜50、50≤DI＜70、70≤DI＜100。依據(jù)鑒定材料3次重復(fù)的DI平均值確定其抗性水平。

2 結(jié)果

2.1 ToMMV在我國的發(fā)生情況及分布

在我國13個?。▍^(qū)）尤以云南省為主采集的1 622份茄科疑似病毒病樣品中，ToMMV的平均檢出率為2.59%，共在7個?。▍^(qū)）有發(fā)生，分別為云南、湖南、海南、遼寧、陜西、西藏和內(nèi)蒙古。在辣椒樣品中共檢測到感染ToMMV的樣品24份，在番茄樣品中共檢測到感染ToMMV的樣品18份，在茄子、馬鈴薯和煙草樣品中均尚未檢測到ToMMV的侵染。根據(jù)所收集樣品的病毒檢測結(jié)果，目前ToMMV主要在我國的辣椒和番茄上發(fā)生。

2.1.1 ToMMV在辣椒上的發(fā)生情況 共在全國13個?。▍^(qū)）采集辣椒疑似病毒病樣品958份，ToMMV在所有辣椒樣品中的平均檢出率為2.51%，發(fā)生地區(qū)為云南、湖南、西藏、陜西以及海南（表1），其中在云南省楚雄州的元謀縣、紅河州蒙自市、玉溪市澄江縣和峨山縣等多個地區(qū)有發(fā)生。在云南采集的樣品數(shù)較多，而其他地區(qū)由于樣品采集地區(qū)范圍窄、數(shù)量少，ToMMV的檢出率反而較高。受ToMMV侵染的辣椒主要表現(xiàn)癥狀為斑駁、花葉、壞死和皺縮，不同地區(qū)或不同品種辣椒上表現(xiàn)癥狀有一定的差異。

2.1.2 ToMMV在番茄上的發(fā)生情況 共在全國8個省（區(qū)）采集番茄樣品520份，ToMMV在所有番茄樣品中的平均檢出率為3.46%，發(fā)生地區(qū)為云南、遼寧、內(nèi)蒙古及海南（表2）。受ToMMV侵染的番茄主要表現(xiàn)癥狀為斑駁、黃化、壞死、畸形、泡斑等，同樣，不同地區(qū)或不同品種番茄的表現(xiàn)癥狀也有一定的差異。

2.2 ToMMV的傳播方式

2.2.1 ToMMV可通過摩擦和注射方式進(jìn)行傳播 通過PBS緩沖液摩擦或注射接種方式，將ToMMV分別接種到健康的黃花煙和珊西煙上，接種30 d后，供試的黃花煙表現(xiàn)出泡斑、皺縮、系統(tǒng)性壞死斑等癥狀（圖1-A、1-C），珊西煙表現(xiàn)出花葉、泡斑、皺縮、畸形、線形葉的癥狀（圖1-B、1-D），且在接種植株上均檢測到ToMMV，說明ToMMV可以通過摩擦和注射接種的方式進(jìn)行傳播。

表1 我國13個省（區(qū)）辣椒樣品ToMMV檢測結(jié)果

表2 我國8個?。▍^(qū)）番茄樣品ToMMV檢測結(jié)果

A：摩擦接種黃花煙N. rustica infected by mechanical inoculation；B：摩擦接種珊西煙N. tabacum var. Xanthi ncinfected by mechanical inoculation；C：注射接種黃花煙N. rustica infected by injection；D：注射接種珊西煙N. tabacum var. Xanthi ncinfected by injection

2.2.2 ToMMV可通過珊西煙種子進(jìn)行傳播 收集田間感染了ToMMV的辣椒種子和溫室條件下ToMMV接種發(fā)病的珊西煙種子，將這些種子提取核酸進(jìn)行ToMMV檢測，在種子上均能檢測到ToMMV（圖2）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證攜帶ToMMV的珊西煙種子是否可以將病毒傳遞到種苗，將感染ToMMV的珊西煙種子在無毒土壤中進(jìn)行育苗，并對種苗系統(tǒng)葉進(jìn)行ToMMV檢測。共檢測種苗122株，檢出帶毒種苗48株，平均檢出率為39.34%。其中同一生育時期長勢較好、長勢一般、長勢較差的種苗中，ToMMV的檢出率分別為23.26%、42.86%和56.67%。說明攜帶ToMMV的珊西煙種子可以將ToMMV垂直傳播到煙苗，且傳毒效率較高。另外，出苗時種子攜帶ToMMV的比率越高，對種苗的生長影響越大。

2.2.3 ToMMV可通過土壤進(jìn)行傳播 分別隨機(jī)挑選8個品種的辣椒、番茄種子進(jìn)行ToMMV檢測，結(jié)果顯示這些辣椒和番茄種子均未攜帶ToMMV，為健康的種子（圖3-A）。同時對培育過感染ToMMV植株的土壤進(jìn)行ToMMV檢測，確認(rèn)土壤中含有ToMMV（圖3-B）。用含ToMMV的土壤對健康無毒的辣椒和番茄種子進(jìn)行育苗，并對苗期的辣椒和番茄進(jìn)行ToMMV的檢測，在辣椒和番茄的種苗上均檢測到ToMMV，檢出率分別為80%和78.79%，說明ToMMV可以通過土壤進(jìn)行傳播，且傳毒效率非常高。

M：DL 2000 Marker；1、2：感病珊西煙種子seeds of N. tabacum var. Xanthi nc infected with ToMMV；CK：ToMMV陽性對照ToMMV positive control；N：陰性對照（健康煙種子）negative control (healthy tobacco seeds)

A：健康辣椒、番茄種子中ToMMV的檢測ToMMV detection of the healthy pepper and tomato seeds，M：DL 2000 Marker；1—8：健康辣椒種子healthy pepper seeds；9—16：健康番茄種子healthy tomato seeds；CK：ToMMV陽性對照ToMMV positive control。B：土壤中ToMMV的檢測ToMMV detection in the soil，M：DL 2000 Marker；1—3：帶毒土壤soil pre-grew ToMMV-infected plants；N：無毒滅菌土壤sterilized soil；CK：ToMMV陽性對照ToMMV positive control

2.3 ToMMV的寄主范圍

通過摩擦和注射接種，將ToMMV分別接種到茄科作物辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯、普通煙、本氏煙、黃花煙、珊西煙、三生煙、心葉煙、矮牽牛、酸漿、假酸漿、曼陀羅；十字花科作物大白菜、青菜、青花菜、花椰菜、油菜、蘿卜；葫蘆科作物西葫蘆、黃瓜、南瓜、絲瓜、苦瓜；豆科作物菜豆、豇豆、豌豆；旋花科蕹菜及藜科的昆諾藜6個科30種植物上。接種20 d后，用ToMMV檢測引物進(jìn)行RT-PCR檢測，在茄科的辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯、普通煙、本氏煙、黃花煙、珊西煙、三生煙、心葉煙、矮牽牛、酸漿、假酸漿，十字花科的大白菜、青菜、青花菜、花椰菜、油菜、蘿卜，葫蘆科的西葫蘆、黃瓜和南瓜，以及豆科的菜豆這4個科23種供試植株中檢測到ToMMV（表3）。感染ToMMV的茄科植株發(fā)病癥狀均比較明顯，主要為斑駁、花葉和泡斑，嚴(yán)重的伴隨有畸形、壞死（圖4-A—C）；感染ToMMV的菜豆葉片有斑駁、壞死癥狀，豆角上有壞死癥狀（圖4-D），將豆莢和豆粒進(jìn)行ToMMV特異性檢測，均可以檢測到ToMMV；而感染ToMMV的十字花科和葫蘆科植株的癥狀不明顯，主要為褪綠或輕斑駁（圖4-E、4-F）。

A：辣椒上花葉、黃化、壞死、皺縮癥狀Mosaic, yellowing, necrosis and shrinking symptoms on Capsicum annuum；B：番茄上花葉、泡斑、畸形、線形葉癥狀Mosaic, blistering, distortion and leaf narrowing symptoms on Solanum lycopersicum；C：馬鈴薯上黃化、壞死癥狀Yellowing and necrosis symptoms on Solanum tuberosum；D：四季豆上斑駁、壞死癥狀Mottle and necrosis symptoms on Phaseolus vulgaris；E：油菜上褪綠、輕斑駁癥狀Chlorosis and mild mottle symptoms on Brassica campestris；F：西葫蘆上斑駁癥狀Mottle symptom on Cucurbita pepo

2.4 不同辣椒、番茄材料對ToMMV的抗/感性鑒定

將ToMMV毒源樣品分別以摩擦和注射兩種方式接種到供試的辣椒和番茄植株上，21 d后對接種植株進(jìn)行癥狀觀察，記錄每株接種植株的發(fā)病情況，并采樣進(jìn)行ToMMV檢測。每份材料重復(fù)3次。

2.4.1 辣椒材料對ToMMV的抗/感性 10份辣椒材料 共接種193株，接種的辣椒中感病的植株多生長緩慢但發(fā)病癥狀較輕，多數(shù)表現(xiàn)為輕斑駁，少數(shù)有嚴(yán)重花葉、畸形和壞死。病情級別多為3級和5級，少部分為7級。鑒定的這10份辣椒材料中，大多為抗性品種，其中野生小辣椒為對ToMMV免疫的品種，小米辣和韓國原種朝天椒為高抗品種，8819線椒、金滿田Ⅱ號和丘北辣為抗病品種，日本朝天椒和日本高抗天鷹椒為中抗品種，新隴2號為感病品種，甜椒王為高感品種（表4）。

2.4.2 番茄材料對ToMMV的抗/感性 10份番茄材料中共接種428株，接種的番茄品種中感病植株多數(shù)癥狀為斑駁，一部分為花葉，一部分為蕨葉或線形葉，少數(shù)為黃化、壞死。病情級別多為3級和5級，一部分為7級，極少數(shù)為9級。高抗的番茄品種有少數(shù)植株可以被ToMMV侵染，但無明顯癥狀，高感的番茄品種表現(xiàn)癥狀多為花葉、泡斑、畸形、線形葉和壞死。供試番茄種質(zhì)資源中尚無對ToMMV免疫的品種，10份材料均可以感染ToMMV，其中T596小櫻桃和鉆紅1號僅有個別接種植株感病，且無癥狀表現(xiàn)，為高抗品種，T3108、TM40456和T3068粉果為抗病品種，T808、TM3167、寶石F1為中抗品種，T367為感病品種，T364為高感品種。僅從發(fā)病率來看，接種ToMMV的10份番茄材料發(fā)病率均較高，說明番茄易被ToMMV感染（表4）。

表3 供試植株接種ToMMV后的癥狀表現(xiàn)及ToMMV的RT-PCR檢測結(jié)果

“+”：檢測到ToMMV ToMMV was detected；“-”：未檢測到ToMMV ToMMV was not detected

表4 辣椒、番茄材料對ToMMV的抗/感性表現(xiàn)

3 討論

本研究對我國13個?。▍^(qū)）的茄科作物進(jìn)行了ToMMV特異性檢測，并結(jié)合目前我國對ToMMV的相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，自2014年首次報道了ToMMV在我國辣椒上的侵染[2]，短短幾年，我國辣椒、番茄和茄子上均已發(fā)現(xiàn)了ToMMV的侵染，在云南、湖南、海南、遼寧、陜西、西藏、內(nèi)蒙古、山東、河南、河北10個省（區(qū)）均已有ToMMV的發(fā)生[8-10,12]。2013年僅在云南和西藏的辣椒上檢測到ToMMV[2]，2015—2016年又在湖南和云南的辣椒上檢測到ToMMV[12]，2017年在云南、海南、內(nèi)蒙古以及遼寧的番茄上檢測到ToMMV[9]，同年相繼在云南、陜西、海南的辣椒上檢測到ToMMV，其中先后在云南元謀縣、蒙自縣、澄江縣和峨山縣等多個地區(qū)檢測到ToMMV。2018年國內(nèi)其他課題組也相繼報道了ToMMV在海南、山東、河南和河北的發(fā)生[8,10]，尤其是在海南番茄上發(fā)生比較嚴(yán)重。在國際上，自2013年首次在墨西哥番茄上報道了ToMMV的侵染后，相繼在我國的辣椒上[2]，美國的弗羅里達(dá)和紐約等地區(qū)[3-4]，以色列北部[5]，西班牙巴倫西亞[6]，巴西圣保羅[7]，我國番茄[8-9]、茄子上[10]報道了ToMMV的侵染。這些結(jié)果表明，ToMMV正在經(jīng)歷由點(diǎn)到面的發(fā)展、擴(kuò)散，正在由最初的番茄向其他植物擴(kuò)散，有發(fā)生流行的趨勢，很有可能像ToCV一樣，形成大面積暴發(fā)。ToCV自2013年在北京和山東發(fā)生以來[20-21]，短短幾年已從北京和山東擴(kuò)散到河北、天津、陜西、甘肅、廣東、山西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、云南等地[14-18,20-25]，其中ToCV于2016年才在陜西、廣東和云南被發(fā)現(xiàn)，但是已經(jīng)在這些省份的局部地區(qū)造成番茄絕產(chǎn)等嚴(yán)重?fù)p失[15,17-18]。因此，應(yīng)采取相關(guān)措施，提早防范ToMMV在我國的發(fā)生流行。

本研究對ToMMV的寄主范圍鑒定結(jié)果表明，ToMMV可侵染茄科、十字花科、豆科和葫蘆科作物，幾乎供試的茄科和十字花科植株均可以被ToMMV侵染，而部分豆科和葫蘆科的作物可以被侵染。ToMMV在茄科作物上的表現(xiàn)癥狀較其他科作物嚴(yán)重，由此可見，ToMMV很可能會成為侵染茄科作物的潛在重要病毒之一。除茄科作物外，人工接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ToMMV能被接種在十字花科、豆科和葫蘆科等植物上，但在云南省檢測了十字花科、豆科、葫蘆科等非茄科作物樣品940份，均未發(fā)現(xiàn)ToMMV的感染（相關(guān)數(shù)據(jù)未展示），推測可能與采集樣品的數(shù)量和地域有限有關(guān)，不排除ToMMV目前在我國除番茄、辣椒和茄子外的其他植物上的發(fā)生，ToMMV對這些植物依然存在潛在的威脅。屬中與該病毒親緣關(guān)系較近的ToMV寄主范圍很廣，能夠侵染茄科、十字花科、豆科、禾本科、藜科等多種植物[26]，因此推測比ToMV侵染性更強(qiáng)的ToMMV的寄主范圍應(yīng)該也很廣[13]，下一步還需要更廣泛的測試供試寄主，為探尋ToMMV的初侵染源、侵染循環(huán)以及抗病育種等提供依據(jù)。

病毒中已被證實(shí)可種傳的病毒有TMV、ToMV、辣椒輕斑駁病毒（，PMMoV）、煙草輕綠花葉病毒（，TMGMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（，CGMMV）等[27-29]，其中CGMMV是我國禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物[30]，足以說明種傳病毒在作物上的危害程度之大。本研究證實(shí)了ToMMV也可進(jìn)行種傳，且出苗時帶毒率越高，對種苗的生長影響越大，再次證實(shí)了播種種子帶毒率的高低直接影響該病害在田間的流行和危害的程度。本研究還發(fā)現(xiàn)健康的種子在混有ToMMV病殘體的土壤中育出的苗也會帶毒，證實(shí)了混有病殘體的土壤也可以成為ToMMV的初侵染源。既可種傳又能土傳的病毒病是最難防治的病害之一，在實(shí)踐生產(chǎn)中，育苗前除了應(yīng)對種子進(jìn)行抽樣檢測是否帶毒，也應(yīng)提取土樣檢測是否帶毒。選擇無病良種、加強(qiáng)對種子的消毒處理均能有效地降低種子傳毒的概率，并應(yīng)做好土壤的消毒工作和育苗期預(yù)防工作，以防止ToMMV的發(fā)生傳播和蔓延。

病毒病的發(fā)生給作物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且一旦發(fā)生難以防控，最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施是培育抗病品種。在病毒病的抗病育種研究方面，國內(nèi)外已經(jīng)有一些通過常規(guī)雜交和轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗病材料或品種的研究報道[31-32]。在病毒病的防控中，抗源材料的篩選十分重要，而優(yōu)良品種的抗性鑒定對抗性基因的篩選及抗病品種的培育都具有重要的意義[33-35]。鑒于ToMMV較強(qiáng)的致病性，應(yīng)全面開展茄科常見作物辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯、煙草等種質(zhì)資源抗ToMMV的篩選和鑒定，為抗ToMMV育種提供具有更高抗性水平的抗源材料，并加強(qiáng)ToMMV抗病基因的篩選鑒定等研究，通過相關(guān)技術(shù)達(dá)到有效防治番茄斑駁花葉病毒病的目的。

4 結(jié)論

目前屬新種ToMMV在我國多個地區(qū)的辣椒和番茄上有發(fā)生，且傳播方式多樣、寄主范圍廣、致病性強(qiáng)。可通過摩擦、注射、帶毒種子和帶毒土壤進(jìn)行傳播；在常見的茄科、十字花科、豆科和葫蘆科作物上均可侵染，尤其是在茄科作物上的致病力較強(qiáng)。結(jié)果暗示ToMMV很可能會成為我國蔬菜作物尤其是茄科作物上危害嚴(yán)重的主要病毒之一，且正在經(jīng)歷由點(diǎn)到面的發(fā)展、擴(kuò)散過程，有發(fā)生流行和不斷向其他?。▍^(qū)）和作物擴(kuò)散的趨勢，應(yīng)在ToMMV流行發(fā)生之前做好相關(guān)防控和抗病品種、抗病基因篩選鑒定等方面的工作。

致謝：湖南省植物保護(hù)研究所張松柏博士、西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院相棟先生和王翠玲女士、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所車海彥博士、西北農(nóng)林科技大學(xué)郝興安博士和劉歡博士、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)竺曉平教授、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)李正男博士、長江大學(xué)章松柏博士等在樣品收集中給予了大力支持和幫助；湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所張戰(zhàn)泓研究員提供了番茄種質(zhì)資源。在此一并表示感謝！

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Occurrence and Biological Characteristics ofon Solanaceae Crops in China

LI YueYue1,5, ZHOU WenPeng1, LU SiQian1, CHEN DeRong1, DAI JianHong2, GUO QiaoYou2, LIU Yong3, LI Fan1, TAN GuanLin1,4

(1College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;2Plant Protection and Plant Inspection Station of Yuanmou, Yuanmou 651300, Yunnan;3Plant Protection Institute of Hunan, Changsha 410125;4Center for Modern Educational Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;5College of Life Science, Luoyang Normal University, Luoyang 471934, Henan)

【Objective】The objective of this study is to determine the occurrence, main distribution area, natural host and biological characteristics including host range, transmission way and pathogenicity of(ToMMV) in solanaceae crops of China, which is a newly identified species in the genus.【Method】Using RT-PCR method, the suspected virus-infected pepper, tomato, eggplant, potato, tobacco of solanaceae crops showing mosaic, shrinking, malformation, yellowing, necrosis symptoms collected from 13 provinces/autonomous regions (Yunnan, Guizhou, Sichuan, Hainan, Hunan, Henan, Shaanxi, Shandong, Hubei, Zhejiang, Liaoning, Tibet and Inner Mongolia) of China in 2013-2017 were detected. Transmission ways were tested by mechanical inoculation and injection, by ToMMV detection in the seeds obtained from ToMMV-infecting tobacco and the seedlings germinated from the seeds, as well as in the 6-8 leaves seedlings of pepper and tomato germinated from the healthy seeds grew in the ToMMV-contaminated soils. Host range test of ToMMV on 30 plants in 6 families such as solanaceae, cucurbitaceae, leguminosae, cruciferae and disease resistance evaluation of different pepper and tomato varieties against ToMMV were carried out.【Result】A total of 1 622 suspected virus-diseased samples of solanaceae crops were collected from 13 provinces/autonomous regions, and the average detection rate of ToMMV was 2.59%, which occurred in 7 provinces/autonomous regions including Yunnan, Hunan, Hainan, Liaoning, Shaanxi, Tibet and Inner Mongolia. ToMMV infection in pepper was detected in Yunnan, Hunan, Hainan, Shaanxi andTibet, while the infection of ToMMV in tomato was detected in Yunnan, Hainan, Liaoning and Inner Mongolia, with the average detection rates of 2.51% and 3.46%, respectively. No ToMMV was detected in eggplant, potato and tobacco. ToMMV could be transmitted by mechanical inoculation, injection, virus-contaminated seeds and virus-contaminatedsoils under experimental conditions, and showed the higher ToMMV infection rate in the seeds, the greater impact on the growth of seedlings. ToMMV could infect almost all of the tested solanaceae and cruciferae plants, and some leguminosae and cucurbitaceae plants. One pepper germplasm material was identified as immune to ToMMV, and two pepper germplasm materials were high resistance to ToMMV, while two tomato germplasm materials showed high resistance to ToMMV.【Conclusion】ToMMV has been occurring on pepper and tomato in China at present, and the host range of ToMMV is wide and the pathogenicity is strong under experimental conditions. ToMMV has a gradual spread and epidemic trend in China, and it is likely to become one of the most harmful viruses on vegetable crop production, especially in solanaceae crops in the future.

(ToMMV); solanaceae crops; occurrence and distribution; transmission way; pathogenicity

2019-08-07；

2019-09-19

國家自然科學(xué)基金（31660039）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303028）、云南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（云教科[2014] 22號）

李月月，E-mail：yuey_li@126.com。通信作者譚冠林，E-mail：gltan@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）