鐵觀音對(duì)阿爾茨海默病小鼠行為的影響及機(jī)制

姜炫旭，周輝，葉鈺珊，劉仲華，魏月德，楊江帆，金恩惠，何普明，李博，吳媛媛，屠幼英*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，杭州 310058；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128；3.福建安溪岐山魏蔭名茶有限公司，福建 泉州 362431；4.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一種最常見的以認(rèn)知能力喪失為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。國(guó)際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)在2018年度報(bào)告中指出，全球有5 000多萬(wàn)人患有癡呆癥，估計(jì)到2050 年受影響的人數(shù)將突破1.52 億[2]。AD 已成為僅次于心血管疾病、腦卒中和癌癥的第4 大致人死亡的疾病。到2050 年可能造成的直接經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)為7 453億元[3]。雖然研究人員對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了許多研究，但是至今尚無(wú)特效藥物問世。近年來(lái)，中國(guó)大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用結(jié)果表明，某些天然產(chǎn)物在針對(duì)AD的調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)及腦內(nèi)蛋白質(zhì)含量、抗神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善腦能量代謝、減少神經(jīng)元丟失、抑制細(xì)胞凋亡等神經(jīng)生物機(jī)制方面有一定的促進(jìn)作用。使用天然物質(zhì)治療AD的研究正在不斷增多。最近的流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，富含黃酮類化合物的中草藥和果蔬可以減輕人認(rèn)知能力的下降；同時(shí)，這類物質(zhì)對(duì)人類的健康也有許多有益的作用，如抗癌[4]、抗炎[5]和抗氧化應(yīng)激[6]等。因此，了解AD的多種發(fā)病機(jī)制并研發(fā)相應(yīng)的AD藥物顯得非常迫切。

鐵觀音是聞名全國(guó)的烏龍茶，原產(chǎn)于福建省安溪縣西坪鎮(zhèn)。目前，以安溪縣的西坪鎮(zhèn)、祥華鄉(xiāng)和感德鎮(zhèn)3 個(gè)產(chǎn)地的鐵觀音品質(zhì)最為上乘，是閩南烏龍茶中的上品，素有“綠葉紅鑲邊，七泡有余香”的美譽(yù)[7]，受到國(guó)內(nèi)外愛茶者的追捧。烏龍茶中富含多種生物活性成分，主要包括生物堿類、茶氨酸、茶多酚、茶黃素、芳香類物質(zhì)等，這些成分通過(guò)協(xié)同作用對(duì)人體健康帶來(lái)益處。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，鐵觀音茶具有抗氧化、抗腫瘤、降脂、抗炎等功效[8]。鐵觀音由新鮮且完整度好的茶葉經(jīng)曬青、做青、殺青、包揉、干燥等多道工藝制作而成。清香、濃香和陳香型鐵觀音的加工工藝參數(shù)有顯著不同，其活性物質(zhì)也有顯著性差異，因此，其功效也會(huì)有所不同。

腦內(nèi)過(guò)氧化環(huán)境會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷，引起AD發(fā)生。作為健康飲品的茶葉含有豐富的抗氧化成分，如果能夠預(yù)防AD的發(fā)生，將會(huì)很好改善老年人的生存質(zhì)量。至今，AD 的治療方案仍舊是全世界的一大難題。目前，國(guó)內(nèi)外以茶葉活性成分單體對(duì)AD 保護(hù)作用的研究居多，而關(guān)于茶葉提取物對(duì)AD 保護(hù)作用的研究甚少，且尚未見鐵觀音提取物對(duì)AD 保護(hù)作用的研究報(bào)道。所以，本文將采用不同加工工藝制備而成的3 種不同香型鐵觀音進(jìn)行AD 小鼠的預(yù)防作用和機(jī)制研究，探討不同香型鐵觀音對(duì)AD小鼠的行為影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

用相同鮮葉加工而成的清香型鐵觀音（Tgy?Q）、濃香型鐵觀音（Tgy?N）、陳香型鐵觀音（Tgy?C），由福建安溪岐山魏蔭名茶有限公司魏月德大師親自制作，并且友情提供。福林酚、三氯化鋁、黃酮、茚三酮、考馬斯亮藍(lán)G?250、濃硫酸、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇和乙酸（均為分析純），乙腈（色譜純），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多奈哌齊（規(guī)格為每片5 mg，批號(hào)130821A）購(gòu)自衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH?Px）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。免疫組化試劑一抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和離子鈣接頭蛋白1（ionized calciumbinding adaptor molecule?1,Iba?1）以及二抗辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）?標(biāo)記的山羊抗鼠/兔購(gòu)自美國(guó)ProteinTech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Alpha1?4 LD plus真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）、UV759S紫外?可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀（上海帝肯貿(mào)易有限公司）、5804R 低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）、RM2016 病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）、J?12J脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、JB?P5 包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、DHG?9140A烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）、JB?L5凍臺(tái)（武漢俊杰電子有限公司）、KD?P 組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鐵觀音提取物制備及其理化成分測(cè)定

將Tgy?Q、Tgy?N 和Tgy?C 茶樣利用粉碎機(jī)磨成粉狀，各稱取3 g放入三角錐形瓶，用30倍體積的沸水?dāng)嚢韬蠓湃?00 ℃水浴鍋浸提30 min，每隔10 min用玻璃棒攪拌1次，浸提結(jié)束后使用真空過(guò)濾。濾渣則繼續(xù)加入20倍體積的沸水，在100 ℃水浴鍋中浸提20 min，同樣間隔10 min用玻璃棒攪拌1次，結(jié)束后再次過(guò)濾。剩下的濾渣再加入20 倍體積的沸蒸餾水，按同樣的方法浸提后合并全部濾液。最后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約1/10，將制成的濃縮液放入－20 ℃冰箱冷凍，再利用冷凍干燥技術(shù)制成鐵觀音提取物凍干粉，密封包裝，于－20 ℃冰箱中保存，備用。經(jīng)檢測(cè)，清香型、濃香型和陳香型鐵觀音（Tgy?Q、Tgy?N和Tgy?C）的浸提率分別是31.75%、32.24%和30.59%。

茶多酚含量的測(cè)定采用福林酚法[9]，游離氨基酸含量的測(cè)定采用茚三酮法[10]，可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[10]，可溶性糖和茶多糖含量的測(cè)定采用蒽酮?硫酸法[9]，總黃酮含量的測(cè)定采用三氯化鋁比色法[11]，咖啡堿和兒茶素含量的測(cè)定采用高效液相色譜法[12]。經(jīng)檢測(cè)，3種香型鐵觀音提取物均含有較高濃度的茶多酚、黃酮、游離氨基酸及咖啡堿等活性成分，其中茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在300 mg/g以上。此外，Tgy?Q 提取物中茶多酚（43.72%）、游離氨基酸（6.41%）和可溶性糖（18.1%）含量最高，而可溶性蛋白質(zhì)（8.86%）、茶多糖（4.86%）、黃酮（2.41%）、咖啡堿（7.13%）含量最低；Tgy?C 提取物中可溶性蛋白質(zhì)（10.47%）、茶多糖（5.74%）、黃酮（3.21%）與咖啡堿（7.49%）含量最高，茶多酚（36.82%）、游離氨基酸（4.79%）和可溶性糖（13.9%）含量最低；Tgy?N的各成分含量均在兩者之間。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

劑量設(shè)置：按照人體每日飲茶推薦劑量0.15 g/kg[13]乘以鐵觀音浸提率的20倍的高劑量作為小鼠灌胃給藥劑量。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：本研究采用的無(wú)特定病原（specific pathogen free,SPF）級(jí)6 月齡雌性APP/PS1（APPswe/PSEN1dE9）小鼠40 只及其同窩野生型小鼠（C57BL/6J）10 只購(gòu)于上海南方模式生物科技股份有限公司（源自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室），并飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有小鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境干凈衛(wèi)生，采用獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度控制在（24±2）℃，空氣相對(duì)濕度保持在50%～60%之間，采用12 h/12 h晝夜交替（每天晚8：00 熄燈，早8：00 開燈）模式飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有小鼠自由攝食和飲水。供試小鼠實(shí)驗(yàn)分組情況如表1所示。

給藥處理：每日給藥1次，各鐵觀音處理組小鼠按體質(zhì)量分別灌胃不同香型的鐵觀音提取物，正常組和模型組小鼠給予按體質(zhì)量換算的無(wú)菌水，藥物組小鼠給予1 g/（kg?d）多奈哌齊，灌胃70 d。具體的灌胃給藥方案如表1所示。

表1 供試小鼠的灌胃給藥方案Table 1 Detailed regimen for intragastric administration ofthe tested mice

1.3.3 小鼠自發(fā)交替行為實(shí)驗(yàn)

利用Y迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的自發(fā)交替行為的正確率來(lái)反映小鼠短暫學(xué)習(xí)的記憶能力[14]。Y迷宮由3等分向外呈輻射狀的3個(gè)臂組成，單臂長(zhǎng)40 cm、寬8 cm、高15 cm，在Y迷宮上方安裝紅外線攝像追蹤系統(tǒng)，并連接到含配套軟件的計(jì)算機(jī)上，各臂之間的夾角呈120°。將3個(gè)臂分別設(shè)定為A、B和C。將Y迷宮置于較為安靜的房間內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠置于Y迷宮的中點(diǎn)，打開攝像頭記錄小鼠在8 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況，然后將小鼠放回籠內(nèi)。每只檢測(cè)結(jié)束后，都使用70%乙醇清潔實(shí)驗(yàn)裝置以消除小鼠氣味。分析并記錄小鼠進(jìn)入各臂的次數(shù)，每相鄰3 次進(jìn)入不同的臂記為正確，否則記為錯(cuò)誤。通過(guò)Smart 3.0軟件記錄進(jìn)臂順序及總次數(shù)以計(jì)算自發(fā)交替行為的正確率（自發(fā)交替反應(yīng)率）。自發(fā)交替反應(yīng)率=正確進(jìn)入次數(shù)/（進(jìn)臂總次數(shù)－2）×100%。

1.3.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test, OFT）是一種在社會(huì)探索基礎(chǔ)上檢測(cè)小鼠焦慮行為學(xué)的經(jīng)典方法[15]。小鼠常喜歡挨墻行走，空曠范圍內(nèi)活動(dòng)較少，但其對(duì)新環(huán)境的探索欲望，又驅(qū)使小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域。當(dāng)進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)、運(yùn)動(dòng)距離及時(shí)間發(fā)生變化時(shí)，都是其行為改變的表現(xiàn)。小鼠在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)次數(shù)越多，說(shuō)明其焦慮越少，以此作為小鼠情緒評(píng)價(jià)的指標(biāo)[16]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置為正方形開放場(chǎng)檢測(cè)箱（長(zhǎng)50 cm、寬50 cm、高40 cm），將安裝在檢測(cè)箱上方的紅外線攝像追蹤系統(tǒng)連接到裝有配套軟件的計(jì)算機(jī)上，并將檢測(cè)箱置于安靜的房間內(nèi)。將小鼠輕放于曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)后立即開啟錄像設(shè)備，記錄小鼠在箱中5 min內(nèi)的活動(dòng)情況。檢測(cè)結(jié)束后將小鼠取出放回籠內(nèi)。每只小鼠檢測(cè)結(jié)束后，均使用70%乙醇清理曠場(chǎng)內(nèi)部，消除小鼠氣味，以防干擾下一只實(shí)驗(yàn)小鼠測(cè)試行為的結(jié)果。

1.3.5 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1 小鼠血漿氧化應(yīng)激和腦組織免疫組化影響實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 樣本采集與處理

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)小鼠均禁食12 h，不禁水，次日進(jìn)入收集血漿和組織取材階段。各組小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛，進(jìn)行全身麻醉，通過(guò)眼球取血并斷頭處死后，迅速取出大腦皮層和腦內(nèi)雙側(cè)海馬組織并置于液氮中，然后迅速轉(zhuǎn)置于－80 ℃冰箱中保存，用以進(jìn)行血漿抗氧化指標(biāo)的測(cè)定和腦組織免疫組化染色等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和處理均嚴(yán)格遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和倫理相關(guān)章程，倫理審查批號(hào)為IACUC?20190729?12。

1.3.5.2 APP/PS1小鼠血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

小鼠血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH?Px、MDA的測(cè)定方法參考試劑盒說(shuō)明書。

1.3.5.3 APP/PS1小鼠腦組織免疫組化實(shí)驗(yàn)

將供試腦組織置于20 mL 預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)常規(guī)石蠟組織包埋、切片。將切片放置于60 ℃恒溫箱內(nèi)烘30 min，然后放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液中各15 min，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）清洗，然后依次在無(wú)水乙醇及95%、85%和70%乙醇中各浸泡5 min，再用PBS 漂洗3 次，每次5 min。接著用0.025% Triton X?10 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TRIS hydrochloride,Tris?HCI）緩沖液漂洗2 次，每次5 min；0.3%的H2O2?Tris 緩沖生理鹽水（Tris?buffered saline, TBS）溶液漂洗15 min；TBS 漂洗3次，每次5 min。用含10%正常血清加1%牛血清白蛋白（bovine albumin,BSA）的TBS室溫封閉2 h后，滴加含1% BSA 的一抗TBS 稀釋液（GFAP、Iba?1）將組織完全覆蓋，于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。取出切片并放入37 ℃恒溫箱復(fù)溫30 min，用含0.025%Triton X100的TBS漂洗3次，每次5 min。輕輕甩干切片，滴加酶標(biāo)二抗（HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG），孵育10 min，用TBS漂洗3次，每次5 min，然后滴加酶標(biāo)生物素，孵育10 min，用PBS漂洗3次。用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）工作液對(duì)切片進(jìn)行顯色，在顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，及時(shí)將切片放入自來(lái)水終止顯色。然后將切片依次放入70%、85%、95%和無(wú)水乙醇中各浸泡5 min，最后將切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液中各10 min至透明，擦干切片，在其中央滴加1～2滴中性樹膠，加蓋玻片進(jìn)行封片。晾干后在顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin Pro 軟件進(jìn)行繪圖，用Excel 2019 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用單因素方差分析和Turkey法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1小鼠AD行為的影響

2.1.1 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1 小鼠Y 迷宮的自發(fā)交替行為的影響

用藥物和鐵觀音提取物處理后，各組小鼠工作記憶能力變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。模型組小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率比正常組降低了16.0%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），說(shuō)明建模成功。多奈哌齊組小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率比模型組增加了13.4%（P＜0.01）。Tgy?Q組、Tgy?N組和Tgy?C組小鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率分別比模型組增加17.3%、17.6%、19.8%，呈顯著性差異（P＜0.001），即用3 種鐵觀音提取物處理后APP/PS1 小鼠工作記憶能力較模型組顯著提高，說(shuō)明鐵觀音提取物有改善小鼠工作記憶能力的效果。這與研究報(bào)道的茶葉中茶多酚、咖啡堿等活性成分對(duì)大腦具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以有效地緩解或降低AD的發(fā)病率結(jié)論[17]相一致。

圖1 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1小鼠Y迷宮行為的影響Fig.1 Effect of Tieguanyin extracts on spontaneous alternation behavior of APP/PS1 mice in the Y-maze test

2.1.2 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1 小鼠焦慮樣行為的影響

2.1.2.1 鐵觀音提取物對(duì)小鼠曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離的影響對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)總距離、空間探索能力及焦慮行為的評(píng)估結(jié)果如圖2 所示。與正常組相比，模型組小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離顯著增加了42.28%（P＜0.001）。與模型組相比，多奈哌齊組和Tgy?C組小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離顯著減少，分別為19.22%和19.93%（P＜0.01）；雖然Tgy?Q 組和Tgy?N 組小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離也分別減少了10.65%和9.87%，但兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離Fig.2 Total run distances of six groups of mice

2.1.2.2 鐵觀音提取物對(duì)小鼠在中央?yún)^(qū)的運(yùn)動(dòng)距離及時(shí)間的影響

評(píng)估小鼠在中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離及時(shí)間（圖3）發(fā)現(xiàn)：與正常組相比，模型組小鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離及停留時(shí)間分別顯著減少了50.1%和67.4%（P＜0.001）。與模型組小鼠相比，多奈哌齊組小鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離和停留時(shí)間分別增加了32.7%和37.7%，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而3種類型鐵觀音提取物處理組小鼠在中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離和停留時(shí)間顯著增加。其中：運(yùn)動(dòng)距離以Tgy?C組的效果最佳，增加93.0%（P＜0.001），其次是Tgy?N組，增加82.0%（P＜0.001），而Tgy?Q組增加49.2%（P＜0.01）；Tgy?C組小鼠在中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間最長(zhǎng)，增加105.0%（P＜0.01），Tgy?N 組小鼠增加84.1%（P＜0.01），Tgy?Q組小鼠增加66.8%（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠在中央?yún)^(qū)的運(yùn)動(dòng)距離及時(shí)間Fig.3 Total run distances and time in central area of six groups of mice

2.1.2.3 鐵觀音提取物對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡的影響

經(jīng)過(guò)不同處理后，小鼠在曠場(chǎng)中5 min 活動(dòng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)軌跡如圖4所示。正常組小鼠在中央?yún)^(qū)域的穿越次數(shù)比其他組多。模型組小鼠穿越中央?yún)^(qū)域的次數(shù)減少，在邊緣區(qū)域帶的時(shí)間增長(zhǎng)。與模型組相比，多奈哌齊組小鼠和3 種類型鐵觀音提取物組小鼠穿越次數(shù)增加，在中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離增長(zhǎng)，尤其是Tgy?C組小鼠穿越中央?yún)^(qū)域的次數(shù)及時(shí)間明顯增加。

圖4 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡圖Fig.4 Trajectory maps of open field test of six groups of mice

2.2 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1 小鼠氧化應(yīng)激與膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1 小鼠血漿氧化應(yīng)激的影響

通過(guò)測(cè)定各組小鼠血漿的MDA 含量、SOD 和GSH?Px 活性，研究不同類型鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1小鼠血漿抗氧化水平的影響，結(jié)果如圖5所示。與正常組相比，模型組小鼠MDA 含量顯著上升19.4%，GSH?Px活性下降2.5%，SOD活性極顯著降低21.2%，表明模型組小鼠血漿內(nèi)氧化水平過(guò)高且抗氧化能力下降，出現(xiàn)了較嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，多奈哌齊組和Tgy?Q、Tgy?N、Tgy?C 組MDA 含量分別顯著降低18.40%、18.44%、12.97%、15.11%，SOD 活 性 分 別 升 高15.87%、15.31%、13.69%、18.80%；其中，Tgy?C 組極顯著升高了小鼠SOD 活性（P＜0.01），Tgy?Q 組極顯著降低了血漿MDA 含量（P＜0.001）。Tgy?Q、Tgy?N、Tgy?C 組的GSH?Px 活性較模型組分別升高了1.33%、1.06%、1.12%，但組間無(wú)明顯差異。綜上可知，3 種鐵觀音提取物和多奈哌齊都能通過(guò)降低膜脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量、升高抗氧化酶SOD 和GSH?Px活性來(lái)改善AD小鼠血漿的氧化應(yīng)激水平。

圖5 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1小鼠血漿抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of Tieguanyin extracts on the anti-oxidative abilities of blood plasma in APP/PS1 mice

2.2.2 鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1 小鼠腦組織中GFAP、Iba-1 蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)APP/PS1 小鼠腦部皮層區(qū)、海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP蛋白進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6所示。正常組小鼠皮層區(qū)和海馬區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少且分布均勻，細(xì)胞呈分枝狀，分枝纖細(xì)均勻；模型組小鼠皮層區(qū)和海馬區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化變形，呈阿米巴狀聚集，面積增大，細(xì)胞質(zhì)緊密，細(xì)胞形態(tài)皺縮；陽(yáng)性對(duì)照多奈哌齊組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)明顯改善；3 種鐵觀音提取物組小鼠活化星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和面積明顯減少，四周星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)，細(xì)胞形態(tài)和面積變小，其中Tgy?C組改善最為顯著。

圖6 免疫組化觀察鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)GFAP蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Tieguanyin extracts on expression of GFAP in the brain of APP/PS1 mice by immunohistochemical staining

通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察APP/PS1 小鼠腦部皮層區(qū)、海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物Iba?1 蛋白形態(tài)，結(jié)果如圖7 所示。在正常組小鼠皮層區(qū)和海馬區(qū)，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少且分布均勻，細(xì)胞呈圓形，分枝較少；在模型組小鼠皮層區(qū)和海馬區(qū)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化變形，面積增大，分枝增多，細(xì)胞形態(tài)皺縮；陽(yáng)性對(duì)照多奈哌齊組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)有明顯改善，變形細(xì)胞面積和數(shù)量減少；3種鐵觀音提取物組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、面積下降，周圍活化的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)有明顯恢復(fù)，呈圓形的細(xì)胞居多，細(xì)胞分枝變少，正常細(xì)胞數(shù)量增多，其中Tgy?C 組細(xì)胞形態(tài)相對(duì)更好。

圖7 免疫組化觀察鐵觀音提取物對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)Iba-1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of Tieguanyin extracts on expression of Iba-1 in the brain of APP/PS1 mice by immunohistochemical staining

3 討論與結(jié)論

茶葉被認(rèn)為具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、抗衰老等作用，而衰老、氧化應(yīng)激和由多種原因?qū)е碌纳窠?jīng)損傷甚至神經(jīng)元凋亡等都是AD 發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此，茶成分在AD 中的研究利用日益增多。有研究發(fā)現(xiàn)，給12月齡的老年雄性Wistar大鼠飲用綠茶提取物水溶液后能有效改善其學(xué)習(xí)記憶能力，并且能降低乙酰膽堿酯酶活性[18]。LI 等[19]發(fā)現(xiàn)，在岡田酸誘導(dǎo)的AD模型大鼠中，岡田酸能引起Tau蛋白高度磷酸化，而經(jīng)過(guò)茶多酚預(yù)處理后，Tau蛋白磷酸化程度明顯降低，并可改善AD 模型大鼠空間記憶能力。黃酮類化合物也已經(jīng)被證實(shí)可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，并且能夠減少神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥因子的釋放[20]。近年來(lái)的研究表明，茶對(duì)改善AD動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力有一定的作用[21]。AD 典型的行為學(xué)病理特征包括認(rèn)知功能出現(xiàn)問題、行為性格突變、學(xué)習(xí)記憶能力下降。本研究主要采用Y迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察不同類型鐵觀音提取物對(duì)8 月齡APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能的影響。Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鐵觀音提取物處理的各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與模型組相比明顯改善，與多奈哌齊組小鼠比較有改善效果。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tgy?C 組小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離呈明顯下降趨勢(shì)，Tgy?Q組和Tgy?N 組小鼠比模型組相比運(yùn)動(dòng)的總距離減少，但無(wú)顯著性差異。3種類型鐵觀音提取物組小鼠在中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離和停留時(shí)間顯著增加，其中，Tgy?C組小鼠的效果最佳，其次為Tgy?N組小鼠。

AD 的標(biāo)志性特征病變是Aβ蛋白堆積導(dǎo)致的老年斑和Tau 蛋白異常聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)[22]。神經(jīng)元細(xì)胞死亡與Aβ聯(lián)合其他機(jī)制產(chǎn)生的作用相關(guān)。如：通過(guò)各種情況產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species, ROS），呈現(xiàn)過(guò)氧化環(huán)境，線粒體膜系統(tǒng)被破壞，其自身代謝和功能都會(huì)受到損傷，并有細(xì)胞凋亡情況的出現(xiàn)；還有小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激活化后釋放促炎因子，加速腦組織的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，使神經(jīng)細(xì)胞一直處在連續(xù)凋亡的狀態(tài)下。

腦內(nèi)的過(guò)氧化環(huán)境被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷的重要因素。當(dāng)氧化產(chǎn)物ROS 過(guò)多而不能完全消耗時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)[23]。多年來(lái)的研究表明，茶葉有超強(qiáng)抗氧化能力，可有效防止氧化應(yīng)激反應(yīng)。茶葉多酚類成分對(duì)AD 相關(guān)動(dòng)物及細(xì)胞模型抗氧化效果顯著，可以明顯提高認(rèn)知能力。LI 等[24]對(duì)老年小鼠進(jìn)行兒茶素處理后發(fā)現(xiàn)，兒茶素使小鼠血清中的SOD 和GSH?Px 活性上升。CHEN等[25]發(fā)現(xiàn)，帶有沒食子?；膬翰杷貙?duì)PC12細(xì)胞活性有明顯的提高效果，并顯著減少ROS 的生成。AD 患者大腦中Aβ大量沉積為斑塊，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)，經(jīng)一系列反應(yīng)之后，MDA含量增加，SOD、GSH?Px 活性下降，老年斑更多，神經(jīng)元被損傷，最終認(rèn)知障礙加劇[26]。因此，MDA、GSH?Px 和SOD 已成為判斷氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。本文通過(guò)檢測(cè)APP/PS1 小鼠上述3 個(gè)指標(biāo)來(lái)反映其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。與模型組相比，3 種鐵觀音提取物組與多奈哌齊組均可顯著減少APP/PS1 小鼠血漿內(nèi)MDA 含量，提高SOD 和GSH?Px 活性，表現(xiàn)出對(duì)APP/PS1 小鼠氧化應(yīng)激水平的顯著改善效果。以上結(jié)果表明，3 種鐵觀音提取物和多奈哌齊在APP/PS1 小鼠血漿內(nèi)均可通過(guò)提高內(nèi)源性抗氧化能力和降低過(guò)氧化水平來(lái)釋放氧化應(yīng)激因子，但不同類型鐵觀音提取物作用效果存在一定差異。陽(yáng)性對(duì)照藥物多奈哌齊是有效延緩AD 癥狀的一種膽堿酯酶抑制劑。研究證明，多奈哌齊能夠防止Aβ毒性[27]，表現(xiàn)為Aβ誘導(dǎo)小鼠模型氧化應(yīng)激和認(rèn)知水平降低[28]，另外，還抑制APP/PS1 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥因子的釋放[29]。陳香型鐵觀音在黃酮、茶多糖、咖啡堿和可溶性蛋白質(zhì)含量上較其他2 組多，濃香型其次，清香型最少。陳香型香氣組分以醛類和酮類為主，濃香型以醇類和酮類為主，清香型以醇類和氫類為主。這可能與不同鐵觀音提取物中生化和香氣成分的差異而協(xié)同效果不同相關(guān)。

GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，充滿于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和突起內(nèi)。GFAP 和Iba?1 分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物[30?31]。本文通過(guò)觀察GFAP、Iba?1 的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，3種鐵觀音提取物組小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)有明顯的改善。這說(shuō)明鐵觀音提取物在一定程度上可以調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)功能。

綜上所述，3 種不同香型的鐵觀音均可以抑制APP/PS1 小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善8 月齡APP/PS1 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和焦慮行為，修復(fù)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。由此可推測(cè)，鐵觀音提取物對(duì)AD小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)有一定改善作用。未來(lái)擬進(jìn)一步探究鐵觀音提取物中的主要成分在AD動(dòng)物模型中的改善功效差異以及鐵觀音提取物和茶葉單體成分的協(xié)同改善效果，闡明與其他活性成分聯(lián)用是否會(huì)增強(qiáng)改善AD的作用。