馬尾松針提取物調(diào)控Nrf2-ARE通路治療雄激素性脫發(fā)的研究

朱紅柳,魏躍鋼,閔仲生,高以紅,羊劍秋

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江陰附屬醫(yī)院,江蘇 江陰 214400;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

雄激素性脫發(fā)(Androgenetic alopecia,AGA)是一種發(fā)生于青春期和青春期后的毛發(fā)進(jìn)行性減少性疾病,也是臨床最常見的脫發(fā)性疾病。據(jù)調(diào)查,全球約有60%～70%的人受到該病的影響[1]。在我國,男性AGA患病率為21.3%,女性為6.0%[2]。近年來,隨著生活節(jié)奏的加快、飲食習(xí)慣的改變等,AGA的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸增多且年輕化的趨勢。該病對患者的心理健康和生活質(zhì)量有重要影響,目前經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療AGA的藥物非那雄胺和米諾地爾的有效率分別為48%和35%[1],且二者存在不同程度的不良反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)毛囊提前進(jìn)入退行期,抑制毛發(fā)生長并呈劑量依賴性地促進(jìn)人毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡,參與AGA的病理發(fā)生[3-4]。松針提取物是指從松葉中提取的以黃酮類化合物為主的天然物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種生物學(xué)活性[5-6]。Kamimura等[7]研究發(fā)現(xiàn)原花青素作為一種天然抗氧化劑,能夠呈劑量依賴性地抑制TGF-β1和TGF-β2誘導(dǎo)的毛囊上皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)毛發(fā)生長。據(jù)此推測,同樣具有較強(qiáng)抗氧化活性的松針提取物可能也具有促毛發(fā)生長的作用,但目前尚未見相關(guān)報(bào)道。馬尾松針是分布最廣、資源最多的一種松針。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT)誘導(dǎo)的AGA小鼠模型,觀察馬尾松針提取物促毛發(fā)生長的作用,探討馬尾松針提取物對抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵信號通路核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為尋找新的治療AGA藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只SPF級雄性C57BL/6小鼠,6～8周齡,18～22 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SYXK(渝)2018-0003。所有小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)溫度(23±2)℃,濕度35%～60%,光照12 h。實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理道德的相關(guān)規(guī)定,實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)江陰附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過，審查批件號:2018001。

1.2 藥物與試劑

馬尾松針由江陰市中醫(yī)院提供。DHT(純度≥98%,批號:ID0310)購自北京索萊寶科技有限公司，將1.2 g DHT粉末溶于橄欖油定容至20 mL配置成60 mg·mL-1混懸液。原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,批號:MB7051)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，將原花青素B2粉末22.4 mg溶于224 μL乙醇溶液至完全溶解,加0.5% CMC溶液定容至22.4 mL配置成1 mg·mL-1混懸液。

總RNA提取試劑盒(批號:R1200)購自北京索萊寶科技有限公司;Dullbecco改良Eagle高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(批號:c11885500CP、1438121)購自美國Gibco公司;胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素液(×100)、活性氧(ROS)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、RIPA裂解液(批號:H120711、082119190922、S0033S、S0131S、P0013B)購自上海碧云天生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(批號:ISEQ00010)購自美國Millipore公司；ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(批號:WP20005)購自美國Thermo Fisher公司;二喹啉甲酸(BCA)法蛋白濃度試劑盒(批號:T9300A)購自日本TaKaRa公司；Nrf2抗體(貨號:A0674)、醌氧化還原酶1(NQO1)抗體(貨號:A0047)、血紅素加氧酶1(HO-1)抗體(貨號:A1346)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)抗體(貨號:A17061)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗體(貨號:A15103)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;HRP標(biāo)記二抗(貨號:A0208)購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器

CytoFLEX型流式細(xì)胞檢測儀(美國Beckman公司),ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo公司),ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 馬尾松針提取物的制備

選取新鮮的馬尾松針,參考文獻(xiàn)[8],鼓風(fēng)加熱干燥至質(zhì)量恒定(含水量<10%),粉碎后過80目篩,采用85%乙醇溶液萃取,按照松針∶溶劑=1∶10提取松針中的活性物質(zhì),提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,終濃度為10 mg·mL-1,保存?zhèn)溆?。使用時(shí)將馬尾松針提取物分別溶入0.5%CMC,制備混懸液,調(diào)至所需濃度0.8、1.6、2.4 mg·mL-1。

2.2 AGA小鼠模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,采用1%戊巴比妥鈉(每100 g小鼠體質(zhì)量給予0.4 mL)麻醉成功后,用剃毛刀剃除小鼠背部毛發(fā),面積約2 cm×3 cm,然后按說明書涂抹脫毛膏,去除殘留的毛發(fā),確認(rèn)小鼠毛發(fā)屬于休止期(皮膚呈粉色),然后每只給予脫毛區(qū)(2 cm×3 cm)分區(qū)皮下注射DHT 500 μL(相當(dāng)于30 mg·d-1)。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將小鼠隨機(jī)分為6組:空白組(皮下不注射DHT)、DHT組(僅皮下注射DHT)、原花青素組(皮下注射DHT+原花青素B2 5 mg·kg-1)、松針低劑量組(皮下注射DHT+馬尾松針提取物4 mg·kg-1)、松針中劑量組(皮下注射DHT+馬尾松針提取物8 mg·kg-1)、松針高劑量組(皮下注射DHT+馬尾松針提取物12 mg·kg-1)，每組8只。小鼠每日灌胃給藥100 μL,給藥28 d。

2.4 AGA小鼠模型毛發(fā)生長評價(jià)

①分別在給藥前(d0)以及給藥后第7、14、21、28天(d7、d14、d21、d28)給小鼠拍照,記錄毛發(fā)生長情況并評分:未生長,脫毛區(qū)皮膚呈肉色,為0分;脫毛區(qū)皮膚呈灰色,為1分;脫毛區(qū)皮膚呈黑色,為2分;脫毛區(qū)皮膚呈黑色并有少許毛發(fā)長出為3分。

②給藥后d28,采用1%戊巴比妥鈉(每100 g小鼠體質(zhì)量給予0.4 mL)進(jìn)行麻醉,取小鼠背部脫毛區(qū)皮膚,用20 mm打孔器于每只小鼠脫毛區(qū)相同位置取圓形皮片,手術(shù)刀刮除皮片上所有體毛,分析天平稱質(zhì)量,計(jì)算各組小鼠毛發(fā)質(zhì)量均值。

③取圓形皮片進(jìn)一步做常規(guī)石蠟切片,脫蠟復(fù)水,HE染色,光學(xué)顯微鏡下計(jì)算生長期、休止期毛囊數(shù)量及二者的比值。計(jì)算毛囊數(shù)量(0.09 mm2,×100)。

2.5 皮膚組織中ROS和MDA含量的檢測

將取下的小鼠背部皮膚置于含雙抗的PBS中浸洗30 s,取出剪碎,加胰酶消化液放入孵化箱消化1 h,隨后研磨，取研磨液,用含血清的培養(yǎng)基終止消化,1 500 r·min-1離心5 min,用PBS重懸細(xì)胞洗滌2次,取上清液。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS含量，MDA試劑盒測定MDA含量。

2.6 qPCR檢測Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、TGF-β1 mRNA的表達(dá)

Trizol法抽提總RNA,qPCR分別檢測各組小鼠背部皮膚組織樣本中Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、TGF-β1 mRNA的表達(dá)。根據(jù)在線引物設(shè)計(jì)軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計(jì)上述基因引物,由重慶博艾邁迪森生物科技有限公司合成,具體序列見表1。以β-actin為內(nèi)參基因,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。兩步法qPCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30～34 s,共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primer

2.7 Western blot檢測Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、TGF-β1蛋白的表達(dá)

將小鼠背部皮膚組織放入液氮冷卻的研缽中冷凍并研碎,加入RIPA裂解液。4 ℃,13 000 r·min-1離心20 min,將離心后的上清分裝到1.5 mL EP管中,-70 ℃保存。取蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4∶1混合后于沸水中煮5 min使蛋白變性。加樣孔中加入樣品;80 V跑濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120 V,轉(zhuǎn)PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液(溶于TBST)室溫振蕩封閉1 h。加入一抗(1∶1 000～1∶2 000),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10 min,加入二抗(1∶1 000),室溫孵育1 h。最后將ECL曝光液按A液∶B液=1∶1混勻后均勻覆蓋于PVDF膜,反應(yīng)1 min放入曝光儀檢測。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組毛發(fā)生長情況的比較

如圖1所示,DHT組脫毛區(qū)在28 d內(nèi)未見毛發(fā)長出,部分在d14后小片區(qū)域皮膚呈現(xiàn)灰色但不明顯,顯示DHT注射后AGA小鼠建模成功。松針各劑量組于d14起大部分背部皮膚呈現(xiàn)灰色,且部分出現(xiàn)片狀黑色毛發(fā),尤其是高劑量組最為顯著。原花青素組也在d14開始見效,但起效時(shí)間較松針高劑量組晚。

圖1 各組小鼠毛發(fā)生長情況的比較Fig.1 Comparison of hair growth in each group

如圖2所示,除DHT組外,各組隨著用藥時(shí)間的延長,毛發(fā)生長情況評分值逐漸升高?？瞻捉M于d7達(dá)到1分,d14即達(dá)到3分,而原花青素組和松針各劑量組在d14均大于1分,d21開始均接近3分。

圖2 各組小鼠背部毛發(fā)生長情況評分比較Fig.2 Comparison of hair growth scores in each group

如圖3所示,與空白組比較,DHT組毛發(fā)質(zhì)量顯著降低(P<0.001)。松針組隨著給藥劑量的升高,毛發(fā)質(zhì)量逐漸增長,與DHT組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3.2 各組小鼠背部皮膚組織中生長期、休止期毛囊數(shù)量及其比值的比較

HE染色如圖4所示,空白組的毛囊呈活躍增生狀態(tài),毛囊數(shù)較多,可以看到新生的毛囊及內(nèi)毛根鞘,毛球內(nèi)有明顯的黑素形成。DHT組毛囊數(shù)明顯減少,毛囊體積較小。與DHT組比較，松針低、中劑量組未見明顯差異,但松針高劑量組毛囊密度明顯增加,其鏡下改變與空白組和原花青素組相似,可見較多的新生毛囊及內(nèi)毛根鞘,毛球內(nèi)有黑素形成,毛囊數(shù)較多,體積較大。

注:與空白組比較,***P<0.001;與DHT組比較,圖3 各組小鼠背部毛發(fā)質(zhì)量比較Fig.3 Comparison of hair weight in each group

圖4 各組小鼠背部圓形皮片HE染色(×100)Fig.4 HE staining of the circle skin in each group (×100)

如表2所示，在生長期毛囊計(jì)數(shù)中,空白組計(jì)數(shù)最多,DHT組最低,2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。松針高劑量組生長期毛囊計(jì)數(shù)與DHT組相比,具有顯著性差異(P<0.01),與空白組和原花青素組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在休止期毛囊計(jì)數(shù)中,各組間差異不明顯,除了松針中、高劑量組與空白組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),其余均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在生長期與休止期毛囊計(jì)數(shù)比值中,DHT組比值最低,與空白組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，松針高劑量組和原花青素組明顯高于空白組(P<0.05,P<0.01)。

表2 各組小鼠背部皮膚毛囊數(shù)量比較

3.3 各組小鼠背部皮膚組織中ROS和MDA含量比較

如圖5～6顯示,與空白組比較,DHT組ROS、MDA含量顯著升高(P<0.01);與DHT組比較,松針中、高劑量組ROS、MDA含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

注:與空白組比較,**P<0.01;與DHT組比較,圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠背部皮膚組織中ROS含量Fig.5 Comparison of ROS content in each group by flow cytometry

注:與空白組比較,**P<0.01;與DHT組比較,圖6 各組小鼠背部皮膚組織中MDA含量比較Fig.6 Comparison of MDA content in each group

3.4 各組小鼠皮膚組織中相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)的比較

qPCR結(jié)果如圖7所示,與空白組相比,DHT組Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01),而Keap1和TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。松針組呈劑量依賴性地促進(jìn)Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA表達(dá),抑制Keap1和TGF-β1 mRNA表達(dá),中、高劑量組與DHT組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。Western blot結(jié)果如圖8所示,與qPCR結(jié)果基本一致,松針高劑量組促進(jìn)Nrf2、NQO1、HO-1蛋白的表達(dá),抑制Keap1和TGF-β1蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。

注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DHT組比較,圖7 qPCR檢測各組小鼠皮膚組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1及TGF-β1 mRNA的表達(dá)Fig.7 Expressions of Nrf2, NQO1, HO-1, Keap1, TGF-β1 mRNA in each group by qPCR

注:與空白組比較,*P<0.05;與DHT組比較,圖8 Western blot檢測各組小鼠皮膚組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1及TGF-β1蛋白表達(dá)Fig.8 Expressions of Nrf2, NQO1, HO-1, Keap1, TGF-β1 protein in each group by Western blot

4 討論

毛發(fā)周期分生長期、退行期和休止期。C57BL/6小鼠是研究AGA常用的動(dòng)物模型,其毛發(fā)呈周期性生長。該小鼠軀干皮膚的黑素細(xì)胞只存在于毛囊中,而且僅在生長期時(shí)合成黑素并傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞,使皮膚變成黑色,而退行期皮膚變成灰色,休止期皮膚變?yōu)榉奂t色,因此可根據(jù)皮膚顏色大致判斷毛發(fā)周期情況[9]。本研究結(jié)果顯示,人工脫毛后的C57BL/6小鼠背部皮膚均呈現(xiàn)粉紅色,說明毛發(fā)進(jìn)入休止期。

DHT是導(dǎo)致AGA的重要分子,其由睪酮在毛乳頭細(xì)胞中經(jīng)Ⅱ型5α-還原酶作用下轉(zhuǎn)變而成。DHT與雄激素受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用,可使毛發(fā)生長期縮短,生長期/休止期毛囊比例下降[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DHT組小鼠背部皮膚未見顏色改變和毛發(fā)長出,HE染色顯示，生長期毛囊數(shù)量明顯減少(P<0.01),生長期/休止期毛囊比例顯著降低(P<0.05)。而馬尾松針提取物各劑量組小鼠背部皮膚從d14起，基本由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑?且部分可見黑色毛發(fā)長出,d21開始可見明顯黑色毛發(fā)長出。HE染色可觀察到馬尾松針高劑量組生長期毛囊數(shù)量較DHT組明顯增多,生長期/休止期毛囊比例顯著升高(P<0.01)，作用與原花青素組相似,提示馬尾松針可誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入生長期,延長生長期時(shí)間,并推遲進(jìn)入休止期。

ROS是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵啟動(dòng)因子[11]。研究表明,在正常毛囊的新陳代謝過程中線粒體會產(chǎn)生一定量的ROS以維持其信號通路正常運(yùn)行[12]。但當(dāng)ROS產(chǎn)生過多且超出機(jī)體抗氧化物的清除能力時(shí),會造成氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷,導(dǎo)致毛乳頭細(xì)胞脂質(zhì)過氧化,促進(jìn)其凋亡,并抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,從而誘導(dǎo)毛發(fā)進(jìn)入退行期[3]。本研究結(jié)果顯示,DHT組ROS含量顯著升高(P<0.05)。而MDA作為脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一,同樣在DHT組中表達(dá)量顯著升高(P<0.01),說明DHT對細(xì)胞有明顯的過氧化損傷,而馬尾松針可降低AGA小鼠ROS和MDA的含量(P<0.05，P<0.01)。

Nrf2-ARE信號通路是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路[13]。在無任何刺激的情況下,Nrf2與Keap1相結(jié)合,處于相對抑制狀態(tài),并被鉚釘在胞漿中。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),Nrf2將與Keap1解除偶聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核,與核內(nèi)ARE結(jié)合,啟動(dòng)一系列Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因，如NQO1、HO-1等的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,與空白組比較,DHT組Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)顯著下降(P<0.05，P<0.01),Keap1的表達(dá)升高(P<0.05),而松針高劑量組促進(jìn)Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá),抑制Keap1的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。TGF-β是毛發(fā)生長的負(fù)調(diào)控因子,其中TGF-β1被認(rèn)為是AGA發(fā)病的關(guān)鍵因素[10]。DHT組TGF-β1的表達(dá)高于空白組(P<0.05),與DHT組相比,松針高劑量組TGF-β1的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

綜上所述，馬尾松針可能是通過激活Nrf2-ARE信號通路,改善氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮AGA的治療作用，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。