連翹苷調(diào)控LINC00342影響胃癌細胞增殖、遷移和侵襲及炎癥因子表達的實驗研究

李紹智,練維生

李紹智,浙江省玉環(huán)市第二人民醫(yī)院腫瘤科 浙江省玉環(huán)市 317605

練維生,浙江省腫瘤醫(yī)院介入治療科 浙江省杭州市 310005

0 引言

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其進展速度快,嚴重威脅患者生命健康.胃癌發(fā)病隱匿,早期診斷率較低,多數(shù)患者確診時已處于中晚期.放化療是中晚期患者治療的常用手段,但胃癌對化療藥物耐藥性的產(chǎn)生常導致化療療效不佳.因此,需要尋找用于治療胃癌的新藥物.天然中草藥或其活性成分具有毒副作用小、作用靶點多、價格便宜等優(yōu)點,是抗腫瘤藥物研究的熱點內(nèi)容.連翹苷是中藥連翹的主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗衰老等功效.近年來研究顯示,連翹苷還具有一定的抗腫瘤作用.連翹苷可通過調(diào)控circ_0054537/miR-409-3p表達抑制肝癌細胞的惡性生物學行為;連翹苷可通過下調(diào)VEGF和上調(diào)endostatin的表達抑制肺癌腫瘤發(fā)展;連翹苷可通過抑制PI3K/Akt信號通路降低腎癌細胞的生長、遷移和侵襲能力.但是,連翹苷對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響和機制還未知.長基因間非編碼RNA 00342(LINC00342)是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA),其在非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中表達增加,促進腫瘤細胞的惡性行為.然而,LINC00342對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知.本研究主要探究了連翹苷和LINC00342對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲和炎癥因子表達的影響及連翹苷能否調(diào)控LINC00342發(fā)揮作用,報道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料:51例胃癌組織及癌旁組織取自2018-10/2020-10于浙江省腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌患者,液氮保存.男24例,女性18例,患者平均年齡(45.26±7.39)歲.納入標準:首次確診.排除標準:合并其他惡性腫瘤患者;心臟、腎等重要臟器功能障礙患者.研究符合《赫爾辛基宣言》原則.

1.1.2 細胞和試劑:HGC-27細胞系,中國科學院上海細胞庫;連翹苷,純度≥98%,上?？泼鸦瘜W科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液、BCA蛋白檢測試劑盒和CCK-8試劑盒,北京索萊寶;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),浙江天杭生物科技有限公司;Lipofectamine2000試劑盒,美國Invitrogen公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒,大連寶生物;LINC00342小干擾RNA(si-LINC00342)和過表達載體(pcDNALINC00342)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、空載體(pcDNA)及PCR引物,上海生工;E-cadherin和N-cadherin抗體,中國Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):HGC-27細胞,用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液置于CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HGC-27細胞.當細胞融合至90%時,用0.25%胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng).

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率:將200 μL對數(shù)期HGC-27細胞(5.0×10個/mL)接種至96孔板中,培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,分別用含0、5、10、20 μmol/L連翹苷的培養(yǎng)液培養(yǎng),分別記為對照組、連翹苷低劑量組、連翹苷中劑量組、連翹苷高劑量組.培養(yǎng)24 h后,加10 μL CCK-8,孵育2 h,用酶標儀(波長450 nm)測光密度(optical density,OD)值.增殖抑制率(%)=(OD-OD)/OD×100 %.實驗重復3次.

1.2.3 克隆形成實驗:取2.5 mL對數(shù)期HGC-27細胞(5.0×10個/mL)接種至6孔板中,按上述1.2.2分組處理.每2 d更換一次,培養(yǎng)14 d.棄培養(yǎng)液,經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,顯微鏡觀察,統(tǒng)計克隆形成數(shù).實驗重復3次.

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲:取2.5 mL對數(shù)期HGC-27細胞(5.0×10個/mL)接種至6孔板中,按上述1.2.2分組處理.培養(yǎng)24 h后,收集細胞,并調(diào)整各組細胞濃度為2.5×10個/mL.侵襲實驗:將Transwell小室置于24孔板中,鋪Matrigel基質(zhì)膠,自然晾干.取100 μL各組細胞懸液加至上室,500 μL完全培養(yǎng)液加至下室.培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色會后,顯微鏡觀察,記數(shù).遷移實驗:除不鋪Matrigel基質(zhì)膠外,操作過程與侵襲實驗相同.

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達:取2.5 mL對數(shù)期HGC-27細胞(5.0×10個/mL)接種至6孔板中,按上述1.2.2分組處理.培養(yǎng)24 h后,用RIPA試劑提取細胞中總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度.行10% SDS-PAGE電泳,將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉1 h.于4 ℃冰箱中分別用E-cadherin(1:500)、N-cadherin(1:500)、GAPDH(1:1000)一抗孵育過夜,洗膜后,再于山羊抗兔二抗(1:2000)中37 ℃孵育1 h.加顯影液,避光顯影,曝光拍照.

1.2.6 試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達:取2.5 mL對數(shù)期HGC-27細胞(5.0×10個/mL)接種至6孔板中,按上述1.2.2分組處理.培養(yǎng)24 h后,收集各組細胞培養(yǎng)上清液.3500 r/min離心10 min后,分別利用TNF-α和IL-6試劑盒檢測上清液中其表達水平.

1.2.7 qRT-PCR檢測LINC00342表達:(1)細胞接種和處理同1.2.5,培養(yǎng)24 h后,收集細胞,檢測細胞中LINC00342表達;(2)在液氮保護下,研磨組織樣本,檢測組織樣本中LINC00342蛋白表達.用RNA提取試劑盒提取細胞或組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后,行PCR擴增.引物序列:LINC00342上游5’-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3’,下游5’-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3’;GAPDH上游5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3’,下游5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’.2法計算LINC00342相對GAPDH的表達量.

1.2.8 細胞轉(zhuǎn)染和處理:取2.5 mL對數(shù)期HGC-27細胞(5.0×10個/m L)接種至6孔板中,培養(yǎng)24 h后,用Lipofectamine2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染si-LINC00342、si-NC、pcDNA-LINC00342、pcDNA至HGC-27細胞,轉(zhuǎn)染12 h后,更換為完全培養(yǎng)液.再培養(yǎng)24 h,qRT-PCR檢測細胞中LINC00342表達驗證轉(zhuǎn)染效果,方法同1.2.8.將轉(zhuǎn)染后的HGC-27細胞均接種至培養(yǎng)板中,培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,分組處理.其中轉(zhuǎn)染si-LINC00342、si-NC的HGC-27細胞均用不含連翹苷的培養(yǎng)液培養(yǎng),分別記為si-LINC00342組、si-NC組.轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00342、pcDNA的HGC-27細胞均用含20 μmol/L連翹苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)分別記為連翹苷+pcDNA-LINC00342組、連翹苷+pcDNA組.培養(yǎng)24 h后,分別參照1.2.2-1.2.6檢測細胞細胞抑制率、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲數(shù)、細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達及細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達.

SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù).計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后,兩組間比較行獨立樣本檢驗;多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-檢驗.以＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 連翹苷對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響 與對照組比較,胃癌HGC-27細胞經(jīng)不同劑量連翹苷作用后,細胞增殖抑制率升高(＜0.05),細胞克隆數(shù)、遷移數(shù)和侵襲數(shù)及細胞中N-cadherin蛋白表達均降低(＜0.05),E-cadherin蛋白表達升高(＜0.05),細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達降低(＜0.05),且呈劑量依賴性.見圖1、表1及補充材料表1.

圖1 連翹苷對HGC-27細胞克隆、遷移和侵襲及E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響. A:連翹苷對HGC-27細胞克隆的影響;B:連翹苷對HGC-27細胞遷移侵襲的影響;C:連翹苷對HGC-27細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響.

表1 連翹苷對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響(mean±SD,n=3)

2.2 連翹苷對胃癌HGC-27細胞中LINC00342表達的影響 與對照組比較,胃癌HGC-27細胞經(jīng)不同劑量連翹苷作用后,細胞中LINC00342表達降低(＜0.05),且呈劑量依賴性.見表2.

表2 連翹苷對HGC-27中LINC00342表達的檢測(mean±SD,n=3)

2.3 LINC00342在胃癌組織中的表達 胃癌組織中LINC00342的表達量為2.39±0.40,顯著高于癌旁組織中LINC00342的表達量0.95±0.28 (=21.062,＜0.05).

2.4 LINC00342轉(zhuǎn)染效果驗證 轉(zhuǎn)染si-LINC0034的胃癌HGC-27細胞中LINC00342表達量為0.35±0.05,顯著低于轉(zhuǎn)染si-NC的HGC-27細胞中LINC00342表達量1.00±0.00 (=22.517,＜0.05),說明敲減LINC00342的HGC-27細胞構(gòu)建成功.轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC0034的胃癌HGC-27細胞中LINC00342表達量為3.00±0.11,顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA的HGC-27細胞中LINC00342表達量1.00±0.00 (=31.492,＜0.05),說明過表達LINC00342的HGC-27細胞構(gòu)建成功.

2.5 敲減LINC00342對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響 si-LINC0034組胃癌HGC-27細胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達均高于si-NC組(＜0.05),細胞克隆數(shù)、遷移數(shù)和侵襲數(shù)、細胞中N-cadherin蛋白表達及細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達均低于si-NC組(＜0.05).見圖2、表3.

圖2 敲減LINC00342對HGC-27細胞克隆、遷移、侵襲及E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響.A:敲減LINC00342對HGC-27細胞克隆的影響;B:敲減LINC00342對HGC-27細胞遷移侵襲的影響;C:敲減LINC00342對HGC-27細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響.

表3 敲減LINC00342對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響(mean±SD,n=3)

2.6 過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)連翹苷對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響 連翹苷+pcDNA-LINC00342組胃癌HGC-27細胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達均高于連翹苷組(＜0.05),細胞克隆數(shù)、遷移數(shù)和侵襲數(shù)、細胞中N-cadherin蛋白表達及細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達均低于連翹苷組(＜0.05).見圖3、表4.

圖3 過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)連翹苷對HGC-27細胞克隆、遷移、侵襲及E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響.A:過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)連翹苷對HGC-27細胞克隆的影響;B:過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)連翹苷對HGC-27細胞遷移侵襲的影響;C:過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)連翹苷對HGC-27細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響.

表4 過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)連翹苷對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響(mean±SD,n=3)

3 討論

近年來,天然中草藥或其活性成分在腫瘤治療中表現(xiàn)出良好優(yōu)勢,是抗腫瘤藥物研究的熱點對象.研究已表明,多種草藥或其活性成分具有抗胃癌作用.例如,白江江等研究顯示,冬凌草甲素抑制胃癌細胞增殖并增強胃癌細胞對化療藥物西妥昔單的敏感性,其作用機制與抑制細胞中EGFR/STAT3通路有關(guān).楊振方等研究顯示,牛蒡子苷元可通過下調(diào)SETDB1的表達抑制胃癌細胞的惡性生物學行為.洪星輝等研究顯示,重樓總皂苷可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌細胞遷移和侵襲.

連翹是我國傳統(tǒng)常用中草藥,有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效.作為連翹的主要活性成分,連翹苷對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響還未見相關(guān)報道.胃癌細胞過度增殖促進胃癌發(fā)生發(fā)展,而胃癌細胞遷移和侵襲則是胃癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因.本研究結(jié)果顯示,胃癌HGC-27細胞經(jīng)不同劑量連翹苷作用后,細胞增殖抑制率明顯升高,克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)均明顯降低,說明連翹苷抑制了胃癌HGC-27細胞增殖、遷移和侵襲,提示其可能通過抑制胃癌細胞的惡性行為來發(fā)揮抗胃癌作用.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤的發(fā)生發(fā)生中起重要作用,腫瘤細胞在經(jīng)歷此過程后,細胞間粘附作用降低,遷移和侵襲性增強.EMT過程中伴隨多種分子標志物的改變,如上皮標志物E-cadherin表達降低,而間質(zhì)標志物N-cadherin表達升高.本研究結(jié)果顯示,連翹苷促進了胃癌HGC-27細胞中E-cadherin蛋白表達,而抑制了N-cadherin蛋白表達,且呈劑量依賴性,提示其可能通過抑制EMT過程降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力.

胃癌的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥密切相關(guān).TNF-α和IL-6是促炎細胞因子,對胃癌發(fā)展具有促進作用.TNF-α可通過與其受體結(jié)合激活多種信號通路,調(diào)控細胞凋亡、炎癥反應及免疫.IL-6是一種多功能細胞因子,參與調(diào)控細胞增殖、凋亡和免疫防御等過程.研究顯示,胃癌患者血清中TNF-α和IL-6的表達明顯上調(diào),聯(lián)合檢測血清TNF-α和IL-6有助于胃癌預后判斷;IL-6可通過活化STAT3促進胃癌細胞增殖活性及順鉑抗性.本研究結(jié)果顯示,連翹苷降低了胃癌HGC-27細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達,提示連翹苷發(fā)揮抗胃癌作用也可

能與其抑制炎癥環(huán)境有關(guān).

中藥作用途徑及作用靶點較為廣泛,這也是其具有較好抗腫瘤作用的原因之一.lncRNA是一類長鏈非編碼RNA,在真核生物中廣泛存在.研究顯示,腫瘤中存在大量異常表達的lncRNA,這些lncRNA參與調(diào)控腫瘤細胞惡性生物學行為,可作為腫瘤治療的分子靶點.研究已表明,LINC00511、LINC00265和LINC00649等多種lncRNA在胃癌中表達增加,促進胃癌的發(fā)展進程;LINC00982和HAND2-AS1等lncRNA在胃癌中表達降低,作為抑癌基因影響胃癌發(fā)生發(fā)展.此外,lncRNA還參與調(diào)控腫瘤炎癥微環(huán)境.例如,Liu等研究顯示,lncRNA MSC-AS1在胃癌中表達上調(diào),其可促進胃癌細胞生長、細胞周期進程及分泌炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α,促進胃癌的發(fā)展進程.本研究結(jié)果顯示,LINC00342在胃癌腫瘤組織中的表達明顯高于癌旁組織,提示其可能也促進胃癌的發(fā)展進程;通過敲減胃癌細胞中LINC00342的表達發(fā)現(xiàn),敲減LINC00342可有效阻礙胃癌細胞增殖、遷移和侵襲,并抑制胃癌細胞分泌TNF-α和IL-6,提示LINC00342有可能成為胃癌治療的分子靶點.此外,本研究還顯示,連翹苷可呈劑量依賴性抑制胃癌細胞中LINC00342的表達,而過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)了連翹苷對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響,提示連翹苷發(fā)揮抗胃癌作用也可能通過與其下調(diào)細胞中LINC00342的表達有關(guān).

4 結(jié)論

綜上,一定劑量的連翹苷對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲及炎癥因子表達具有明顯的抑制作用,其作用機制可能與下調(diào)細胞中LINC00342的表達有關(guān),具有治療胃癌的潛在價值.LINC00342可發(fā)揮微小RNA(miRNA)分子海綿作用調(diào)控miRNA靶基因的表達,進而發(fā)揮生物學作用,本研究中尚未對LINC00342結(jié)合的miRNA及下游靶基因進行探究,這將是加下來要進行的研究工作;同時,尚需進一步通過裸鼠移植瘤實驗在體內(nèi)驗證連翹苷的抗胃癌作用.

胃癌發(fā)病機制尚未闡明,且缺乏有效的治療方法.作為重要連翹的主要活成成分,連翹苷對肝癌、肺癌和腎癌等腫瘤細胞的惡性行為具有顯著抑制作用,表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用,但其能否抑制胃癌細胞的惡性行為還未知.長基因間非編碼RNA 00342(LINC00342)是促進非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌發(fā)展的lncRNA,可作為非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌治療的分子靶點.但連翹苷能否通過調(diào)控LINC00342來影響胃癌的發(fā)生發(fā)展也還未知.

本研究旨在探究連翹苷對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子表達的影響及其能否通過調(diào)控LINC00342發(fā)揮作用,以期為其用于胃癌的治療提供一定的實驗依據(jù).

本研究的主要目標是觀察連翹苷能否影響胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6的表達,同時觀察其能否通過調(diào)控LINC00342發(fā)揮作用,初步了解連翹苷對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響和機制.

將不同劑量(5、10、20 μmol/L)的連翹苷作用于胃癌HGC-27細胞,CCK-8法和克隆形成實驗檢測細胞增殖,Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲,蛋白質(zhì)印跡法檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達,試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達,qRT-PCR檢測LINC00342表達.同時敲減HGC-27細胞中LINC00342的表達,觀察敲減LINC00342對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響.此外,通過恢復實驗觀察過表達LINC00342能否逆轉(zhuǎn)連翹苷對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響.

本研究達到實驗目標,結(jié)果表明連翹苷對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6的表達具有抑制作用;敲減LINC00342對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6的表達也具有抑制作用.同時,連翹苷抑制了HGC-27細胞中LINC00342的表達,過表達LINC00342逆轉(zhuǎn)了連翹苷對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響.

本研究發(fā)現(xiàn)連翹苷可抑制胃癌HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥因子TNF-α和IL-6的表達,其作用機制可能與下調(diào)細胞中LINC00342的表達有關(guān).

本研究初步發(fā)現(xiàn)連翹苷具有抗胃癌的潛在價值,但尚需進一步在體內(nèi)驗證.同時,LINC00342下游調(diào)控的基因或通路也有待探究.接下來,將通過建立裸鼠移植瘤實驗,在體內(nèi)觀察連翹苷對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響,并對LINC00342下游調(diào)控的基因或通路進行預測和驗證,更加全面了解連翹苷的抗胃癌作用和機制,為胃癌治療藥物的研發(fā)提供新途徑.