黃腐酸鈉預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制研究

宋健康 李鐵成(通信作者)

124010 錦州醫(yī)科大學(xué)盤(pán)錦遼油寶石花醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地1，遼寧盤(pán)錦

121000 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院2，遼寧錦州

以急性心肌梗死為代表的缺血性心臟病嚴(yán)重危害著人們的生命健康，死亡率位居世界第一。目前以冠狀動(dòng)脈介入重新恢復(fù)血液灌注療效最為顯著，然而阻塞的血管血流再通后可能會(huì)引起原有缺血心肌組織損害進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，臨床上稱(chēng)為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。這種再灌注后所帶來(lái)不可預(yù)估的心肌二次損害，給醫(yī)療工作人員帶來(lái)很大困擾。黃腐酸鈉具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用，并有活血化瘀、改善微循環(huán)的功效[2]。黃腐酸鈉在I/R誘導(dǎo)的組織損傷中具有有益作用，特別是在肝、腦組織中，但是尚無(wú)研究證明黃腐酸鈉對(duì)心臟是否同樣會(huì)起到保護(hù)作用。本文中構(gòu)建I/R大鼠心肌損傷模型，通過(guò)預(yù)處理的方式來(lái)探討黃腐酸鈉保護(hù)作用及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

試驗(yàn)動(dòng)物：選取50 只健康的SD 大鼠，重量200～250 g，均為雄性，正常喂養(yǎng)；試驗(yàn)動(dòng)物為錦州醫(yī)科大學(xué)生物試驗(yàn)室提供。

主要試劑：黃腐酸鈉，有效物質(zhì)含量99%，批號(hào)：Z41020418，訂購(gòu)于山西省呂梁市盛大生物發(fā)展有限公司；其他試劑由錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院試驗(yàn)室提供。

方法：①分組及給藥：將50 只大鼠隨機(jī)平均分為五組，每組10 只。I/R 模型組：結(jié)扎左前降支(LAD)進(jìn)行30 min局部缺血，然后保持120 min的穩(wěn)定灌注。黃腐酸鈉高、中、低劑量預(yù)處理組：黃腐酸鈉組按其各自劑量，于術(shù)前1 周用黃腐酸鈉水溶制劑灌胃預(yù)處理，1 次/d，其他操作同I/R 模型組。假手術(shù)組：假手術(shù)的大鼠進(jìn)行與I/R 模型組完全相同的程序，除了在LAD 下通過(guò)的縫合線(xiàn)保持不結(jié)扎狀態(tài)。各組大鼠均在術(shù)前12 h 禁食不禁飲。②MIRI 模型建造：依據(jù)文獻(xiàn)方法，以20%烏拉坦0.5 mL/100 g 的劑量進(jìn)行大鼠腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠取仰臥位固定于操作臺(tái)，行氣管插管并連接動(dòng)物呼吸機(jī)(頻率60 次/min，潮氣量15 mL/kg)，插入針型電極于四肢皮下進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)[3]。剃除胸部鼠毛并進(jìn)行消毒，隨后由胸骨左緣心搏最明顯處縱向切開(kāi)皮膚，彎鉗鈍性分離肌肉組織，暴露肋骨之后將3～5 肋剪斷，剝離心包充分暴露心臟，將4-0帶針絲線(xiàn)穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)下方后，將一個(gè)小的1 mm聚乙烯管(PE)放在LAD頂部，并將縫合線(xiàn)結(jié)扎在PE管的頂部，而不會(huì)損壞動(dòng)脈。手術(shù)全程心電監(jiān)護(hù)，根據(jù)心電圖及左室前壁心肌顏色變化來(lái)判斷造模成功與否。結(jié)扎后心電圖顯示出相應(yīng)的ST 段升高，伴隨著左心室顏色逐漸變暗可確認(rèn)缺血；缺血30 min 后，通過(guò)切開(kāi)該P(yáng)E管頂部的線(xiàn)結(jié)去除結(jié)扎，觀(guān)察缺血區(qū)心肌恢復(fù)紅潤(rùn)和ST 段回落幅度高于50%的改變確認(rèn)再灌注。③造模結(jié)果：試驗(yàn)中各組均有l(wèi)～2 只大鼠由于心室顫動(dòng)、大出血及氣胸等因素死亡，將其排除，其他剩余每組8只大鼠進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)。④標(biāo)本采集：再灌注120 min 后，立即游離頸總動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈處取血并摘取大鼠心臟。血液裝于試管中進(jìn)行離心(3 000 r/min，10 min)，采血清于EP 管中冷藏保存?zhèn)溆?。⑤指?biāo)檢測(cè)：檢測(cè)心肌梗死面積(NBT 染色)；對(duì)心肌組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察；測(cè)定相關(guān)的血清指標(biāo)：應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝公司，TBA-120)測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T(cTnT)含量；使用試劑盒對(duì)血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)行分析，其中SOD、MDA 試劑盒是購(gòu)買(mǎi)自南京建成生物工程研究所，而IL-6和TNF-α含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)自RD公司。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析；計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

心肌梗死面積：與假手術(shù)組比較，I/R 模型組梗死面積增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；說(shuō)明MIRI大鼠模型構(gòu)建成功；與I/R模型組比較，黃腐酸鈉各組心肌梗死面積均縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 心肌梗死面積

心肌組織形態(tài)學(xué)改變：假手術(shù)組心肌紋理規(guī)整清晰，心肌纖維排列整齊，細(xì)胞正常無(wú)水腫、出血跡象，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R 模型組心肌纖維扭曲雜亂，心肌細(xì)胞水腫并伴有變性和壞死，存在部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。黃腐酸鈉各組心肌組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)介于I/R模型組和假手術(shù)組之間，并且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減輕，見(jiàn)圖2。

圖2 心肌組織形態(tài)學(xué)改變

各組大鼠血清CK-MB和cTnT含量比較：與假手術(shù)組相比，I/R 模型組血清CK-MB 和cTnT 含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與I/R 模型組相比，黃腐酸鈉各劑量組CK-MB和cTnT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清CK-MB和cTnT含量比較(±s)

表1 各組大鼠血清CK-MB和cTnT含量比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與I/R模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) CK-MB(U/L) cTnT(pg/mL)假手術(shù)組 8 39.46±3.96 406.51±27.50 I/R模型組 8 112.35±6.21* 1652.37±202.21*黃腐酸鈉低劑量組 50 103.02±8.60# 1554.45±139.34#黃腐酸鈉中劑量組 100 78.82±8.19# 1264.26±111.80#黃腐酸鈉高劑量組 150 63.15±8.21# 1022.19±129.12#

各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較：與假手術(shù)組相比，I/R 模型組IL-6 和TNF-α水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與I/R 模型組相比，黃腐酸鈉各劑量組IL-6和TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與I/R模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手術(shù)組 8 106.48±9.13 32.50±2.91 I/R模型組 8 187.84±8.96* 92.83±7.74*黃腐酸鈉低劑量組 50 172.33±9.19# 78.81±7.49#黃腐酸鈉中劑量組 100 152.05±15.06# 68.39±8.32#黃腐酸鈉高劑量組 150 144.14±13.79# 53.65±3.38#

各組大鼠血清SOD 活性和MDA 含量比較：與假手術(shù)組相比，I/R模型組SOD活性減少且MDA含量提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與I/R 模型組相比，黃腐酸鈉各劑量組SOD 活性均升高，而MDA 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較(±s)

表3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與I/R模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) SOD(U/mL) MDA(μg/uL)假手術(shù)組 8 50.94±4.67 39.50±4.54 I/R模型組 8 20.60±3.06* 94.85±7.36*黃腐酸鈉低劑量組 50 24.82±4.09# 79.71±9.37#黃腐酸鈉中劑量組 100 33.87±4.30# 73.77±6.35#黃腐酸鈉高劑量組 150 36.72±6.13# 64.24±7.28#

討 論

cTnT和CK-MB是目前臨床上比較認(rèn)可的心肌損傷標(biāo)志物，對(duì)于診斷心肌梗死、評(píng)價(jià)溶栓效果及再灌注損傷程度具有重要意義[4]。本試驗(yàn)中黃腐酸鈉預(yù)處理可以降低CK-MB、cTnT 含量，并且心肌梗死面積較模型組顯著減少，證實(shí)黃腐酸鈉能夠改善心肌損傷情況。同時(shí)，黃腐酸鈉各劑量組的心肌纖維排列規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示黃腐酸鈉預(yù)處理可以減輕再灌注后心肌組織形態(tài)損傷的程度[5]。

心肌組織擁有氧耗高且不可再生的特性，當(dāng)機(jī)體組織缺血缺氧時(shí)，SOD活性被抑制，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成具有細(xì)胞毒性的產(chǎn)物MDA，并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞激活和炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放，引起心肌組織的損傷[6]。研究顯示，藥物預(yù)處理能夠提高血清中SOD的活性，改善機(jī)體氧自由基產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)，從而很好地減輕組織細(xì)胞所受到的傷害[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃腐酸鈉預(yù)處理組可以使缺血區(qū)域心肌組織血清中SOD 活性增強(qiáng)，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低，說(shuō)明黃腐酸鈉能夠減輕氧化應(yīng)激并抑制炎性反應(yīng)，從而起到對(duì)心肌的保護(hù)作用。

綜上所述，黃腐酸鈉預(yù)處理可以保護(hù)心臟免受I/R損傷，其作用機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激及炎性因子的釋放相關(guān)聯(lián)。