長(zhǎng)枝木霉T6與阿維菌素復(fù)配對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)的室內(nèi)毒殺效果

吉寶麗毛維興張樹(shù)武徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)(Heteroderaavenae)是一種危害禾谷類作物和禾本科牧草根部的土傳病原線蟲(chóng),屬于固著性寄生線蟲(chóng),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[1]。該線蟲(chóng)于1874年在德國(guó)被首次發(fā)現(xiàn),目前已經(jīng)在全球近40個(gè)國(guó)家的小麥種植區(qū)發(fā)生和危害[2];在澳大利亞的小麥種植區(qū),導(dǎo)致糧食減產(chǎn)23%～89%,每年造成高達(dá)7 000萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失[3];在西班牙重發(fā)區(qū)高達(dá)90%[4]。在中國(guó),該病原線蟲(chóng)于1989年在湖北首次被發(fā)現(xiàn),目前已在青海、山西、江蘇、河北等16個(gè)省(市)廣泛分布[5-6],危害面積達(dá)小麥種植面積的80%,導(dǎo)致小麥產(chǎn)量損失達(dá)20%～70%[7-8]。另外,禾谷孢囊線蟲(chóng)發(fā)生危害時(shí)造成小麥根部損傷,增加了土壤中植物病原菌侵染的機(jī)會(huì),進(jìn)一步加重小麥產(chǎn)量的損失[9]。因此,小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病已成為制約中國(guó)小麥生產(chǎn)和糧食安全的重要因素。

當(dāng)前,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,主要采用化學(xué)防治(如米樂(lè)爾和好年冬)以及抗耐病品種等措施對(duì)植物病原線蟲(chóng)進(jìn)行防治[10]。但是,目前中國(guó)大面積種植的小麥品種抗性較差,同時(shí),抗耐性品種的選育是一項(xiàng)長(zhǎng)期的戰(zhàn)略[11-12];化學(xué)防治效果可達(dá)90%以上,但其具有土壤殘留高和毒性大,以及危害土壤中有益微生物等缺陷,且隨著人們環(huán)保和安全意識(shí)的提高,化學(xué)農(nóng)藥的使用正在不斷減少[13]。因此,尋找綠色高效生物農(nóng)藥防治禾谷包囊線蟲(chóng)已成為必然的趨勢(shì)。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種絲狀真菌,其特點(diǎn)是分布廣泛、抑菌譜廣、環(huán)境適應(yīng)強(qiáng),目前已被證實(shí)對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythiumspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.)等多種植物病原菌具有拮抗作用[14-15]。同時(shí),木霉菌對(duì)植物病原線蟲(chóng)也有一定的防治效果,如使用擬康氏木霉(T.pseudokoningii)防治根結(jié)線蟲(chóng)能夠顯著降低卵的孵化率,同時(shí)對(duì)2齡幼蟲(chóng)也具有較強(qiáng)的毒殺作用[16]。張樹(shù)武等[17]研究表明,長(zhǎng)枝木霉菌(T.longibrachiatum)分生孢子懸浮液對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)卵具有明顯的寄生和致死作用,從而降低2齡幼蟲(chóng)的數(shù)量。阿維菌素是一種廣譜、高效、安全、穩(wěn)定的神經(jīng)毒劑類生物農(nóng)藥,對(duì)農(nóng)業(yè)上許多害蟲(chóng)包括植物寄生線蟲(chóng)具有一定的防治效果,且在土壤中降解迅速,無(wú)累積、無(wú)殘留[18]。張同慶等[19]研究表明,1%阿維菌素對(duì)鐵棍山藥根結(jié)線蟲(chóng)的防效為60.54%。但是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中單一使用阿維菌素容易引起小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)的抗藥性和效果不穩(wěn)定等問(wèn)題[20]。

生防真菌與生物農(nóng)藥混配使用,不僅能夠提高防治效果,還能起到擴(kuò)大防病譜、延緩線蟲(chóng)抗藥性等作用[21-22]。因此,本試驗(yàn)以禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)為研究對(duì)象,測(cè)定長(zhǎng)枝木霉T6、阿維菌素及其不同比例混用對(duì)其室內(nèi)毒殺效果,以期獲得一種高效的復(fù)配型生物農(nóng)藥,為新型生防制劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的長(zhǎng)枝木霉T6菌株,于2016年保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏號(hào)為CGMCC No.13183。

1.1.2 供試土樣 采用五點(diǎn)取樣法于2015年7月在河南省小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)發(fā)生較嚴(yán)重的地塊采集土樣,取樣時(shí)先去除土塊的表層干土,然后取0～20 cm 層的土壤,將多點(diǎn)土樣混勻,備用。

1.1.3 供試藥劑 有效成分含量為1.8%的阿維菌素乳油,浙江世佳科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)分離 采用“漂浮法”[23]分離孢囊。向河南采集的病田土樣中加入一定量的自來(lái)水,充分?jǐn)嚢柚镣翗尤咳芙?靜置2～3 min即為土壤懸浮液,利用嵌在65目網(wǎng)篩中的25目網(wǎng)篩緩慢過(guò)濾懸浮液,重復(fù)3次,以防止孢囊被過(guò)濾掉。去掉25目網(wǎng)篩,用干凈的水緩慢沖去65目網(wǎng)篩中的泥沙,將剩余物倒入墊有雙層擦鏡紙的漏斗內(nèi)。然后將過(guò)濾后的剩余物移入干凈的培養(yǎng)皿中,用竹簽在體式顯微鏡下挑取新鮮、飽滿的棕色孢囊,置于4 ℃冰箱,備用。挑取的孢囊用1% NaCl O 溶液消毒1 min,并用無(wú)菌水沖洗6次。然后將消毒的孢囊放入墊有擦鏡紙的線蟲(chóng)分離器中,置于15～20℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵化13～22 d,每天收集孵化的2齡幼蟲(chóng),置于顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板配制濃度為200 m L-1的2齡幼蟲(chóng)懸浮液,4 ℃下保存,備用。

1.2.2 長(zhǎng)枝木霉菌T6菌株孢子懸浮液的制備

取25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d的長(zhǎng)枝木霉T6菌株P(guān)DA 平板,加入100μL Tween 80及5 m L無(wú)菌水,用無(wú)菌毛刷將孢子刷入無(wú)菌的10 m L 離心管中充分震蕩,即獲得分生孢子懸浮液,利用血球計(jì)數(shù)板配制使終濃度為2.0×107cfu·m L-1,備用。

1.2.3 阿維菌素溶液的制備 將1.8%的阿維菌素乳油用無(wú)菌水分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg·m L-1溶液,備用。

1.2.4 長(zhǎng)枝木霉T6孢子懸浮液與阿維菌素溶液復(fù)配劑的制備 按體積比為1∶1、2∶1、3∶1的比例分別復(fù)配濃度為2.0×107cfu·m L-1的長(zhǎng)枝木霉T6分生孢子懸浮液和上述5個(gè)濃度的阿維菌素溶液,充分震蕩使其混合均勻,備用。

1.2.5 長(zhǎng)枝木霉與阿維菌素及其復(fù)配對(duì)2齡幼蟲(chóng)毒殺作用的測(cè)定 利用無(wú)菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板測(cè)定單劑和復(fù)配劑的殺線活性,每孔中先加入10μL濃度為2×102m L-1的2齡幼蟲(chóng)懸浮液,再分別加入90μL長(zhǎng)枝木霉T6與阿維菌素復(fù)配劑、單一長(zhǎng)枝木霉T6孢子懸浮液和不同濃度的阿維菌素溶液,以加入等量的無(wú)菌水作為對(duì)照處理。每個(gè)處理16個(gè)重復(fù),置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h在顯微鏡下觀察并記錄線蟲(chóng)的死亡蟲(chóng)數(shù),根據(jù)記錄數(shù)據(jù)計(jì)算其校正死亡率、致死中量并進(jìn)行方差分析。

死亡率=死亡2齡幼蟲(chóng)數(shù)量/供試2齡幼蟲(chóng)數(shù)量×100%

校正死亡率=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2017對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液對(duì)線蟲(chóng)毒殺活性

長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液處理禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較好的毒殺活性,并且隨處理時(shí)間的增大活性增強(qiáng),與對(duì)照相比存在顯著差異(表1)。

表1 長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒殺效果Table 1 Toxic effect of T.longibrachiatum T6 spore on the second stage juveniles of H.avenae

2.2 不同濃度阿維菌素溶液對(duì)線蟲(chóng)毒殺活性

阿維菌素溶液對(duì)2齡幼蟲(chóng)具有較好的毒殺活性,隨著阿維菌素濃度和處理時(shí)間的增加而不斷增強(qiáng),且不同濃度對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死作用存在顯著差異。由毒力回歸方程和LC50可知,阿維菌素溶液對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死作用與其濃度以及處理時(shí)間呈正相關(guān)(表2)。

表2 不同濃度阿維菌素對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒殺效果Table 2 Toxic effect of different concentrations of Avermectin on second stage juveniles of H.avenae

2.3 長(zhǎng)枝木霉T6菌株和阿維菌素復(fù)配溶液對(duì)線蟲(chóng)毒殺活性

長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液與阿維菌素溶液復(fù)配后對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒殺作用,其活性明顯高于單一木霉菌株或單一阿維菌素,顯著提高單一木霉或單一阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)的毒殺效果。濃度為2.0×107cfu·m L-1的長(zhǎng)枝木霉T6 菌株孢子懸浮液與0.5μg·m L-1的阿維菌素按體積比1∶1 復(fù)配處理2齡幼蟲(chóng)48 h后的死亡率高達(dá)96.30%,校正死亡率為96.30%(表3)。由毒力回歸方程和LC50可知,長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液與不同濃度阿維菌素復(fù)配對(duì)2齡幼蟲(chóng)的毒殺作用與阿維菌素濃度以及處理時(shí)間呈正相關(guān)。

表3 長(zhǎng)枝木霉與阿維菌素1∶1混劑對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒殺作用Table 3 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 1∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

濃度為2.0×107cfu·m L-1的長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液與0.5μg·m L-1的阿維菌素按體積比2∶1復(fù)配處理2齡幼蟲(chóng)24 h和48 h后的死亡率分別為64.44%與91.24%(表4);兩者按體積比3∶1復(fù)配處理2齡幼蟲(chóng)24 h和48 h后的死亡率分別為74.29%與91.07%(表5)。試驗(yàn)結(jié)果表明,長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液與阿維菌素溶液按不同體積比復(fù)配后對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)均具有較強(qiáng)的毒殺作用,與單一木霉或單一阿維菌素處理2齡幼蟲(chóng)的毒殺效果相比,均有顯著提高,表明長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液與阿維菌素有很好的兼容性,而且當(dāng)阿維菌素濃度為0.5 μg·m L-1時(shí),長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液與其按1∶1、2∶1、3∶1的體積比混合處理2齡幼蟲(chóng)24 h,對(duì)線蟲(chóng)毒殺活性有顯著差異,而在處理48 h后毒殺活性無(wú)顯著差異。

表4 長(zhǎng)枝木霉與阿維菌素2∶1混劑對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒殺作用Table 4 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 2∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

表5 長(zhǎng)枝木霉與阿維菌素3∶1混劑對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒殺作用Table 5 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 3∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

3 結(jié)論與討論

單一阿維菌素和單一長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)均具有較好的毒殺效果,且隨處理濃度和時(shí)間的增大效果增強(qiáng);長(zhǎng)枝木霉T6孢子懸浮液與阿維菌素有很好的兼容性,長(zhǎng)枝木霉T6菌株孢子懸浮液與不同濃度阿維菌素溶液按不同體積比復(fù)配后對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)均具有較強(qiáng)的毒殺作用,毒殺效果顯著優(yōu)于單一木霉或單一阿維菌素。

馬金慧等[24]利用哈茨木霉發(fā)酵液原液處理南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng),48 h后的校正死亡率達(dá)到100%;本試驗(yàn)中,長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液處理2 齡幼蟲(chóng)48 h 后,線蟲(chóng)的校正死亡率為71.43%,校正死亡率的差異可能與生防真菌的種類、殺線機(jī)制以及病原線蟲(chóng)的不同等有關(guān)[25]。

通過(guò)將不同作用機(jī)制的生防菌與生物農(nóng)藥復(fù)配后進(jìn)行植物病原菌的防治,能夠顯著提高防治效果,同時(shí)減少農(nóng)藥的使用并延長(zhǎng)農(nóng)藥的持效期。楊波等[26]利用生防真菌淡紫紫孢菌顆粒劑與阿維菌素復(fù)配防治黃瓜根結(jié)線蟲(chóng),復(fù)配后阿維菌素的用量顯著降低,且有明顯的增效作用。木霉菌與阿維菌素均與環(huán)境相容性好,復(fù)配使用生產(chǎn)成本低,成分多樣,線蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性,具有擴(kuò)大防治譜和協(xié)同增效等作用[18,27]。在本試驗(yàn)中,長(zhǎng)枝木霉T6 菌株孢子懸浮液與阿維菌素溶液以1∶1體積比復(fù)配時(shí),對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的防效達(dá)96.3%,所需的長(zhǎng)枝木霉T6菌株分生孢子懸浮液用量少,生產(chǎn)成本低,具有良好的應(yīng)用前景。