GhCDPK4 基因的克隆和功能分析

侯夢(mèng)娟朱新霞孔 輝史光珍

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003)

鈣依賴(lài)性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)是已知的鈣離子敏感蛋白,是植物中較大、分化程度較高的基因家族之一。CDPK 蛋白結(jié)構(gòu)域由四部分組成,分別是高度可變的N 端結(jié)構(gòu)域、高度保守起催化作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)抑制蛋白自身活性的自抑制結(jié)構(gòu)域和C端有EF 手型結(jié)構(gòu)的類(lèi)鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域(Ca M-LD)。正常情況下,CDPK 的自抑制區(qū)與絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的C-球形結(jié)構(gòu)的催化位點(diǎn)結(jié)合,維持CDPKs 處于穩(wěn)態(tài)。當(dāng)植物受到外界干旱、鹽害或不適溫度刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度會(huì)瞬時(shí)升高,CDPK 可感知此信號(hào),C端Ca M-LD 的EF手型結(jié)構(gòu)就與Ca2+結(jié)合,從而解除抑制,使CDPK 發(fā)揮激酶活性,將感受到的Ca2+信號(hào)向下游傳遞和級(jí)聯(lián)放大,引發(fā)相關(guān)基因的表達(dá),改變植物細(xì)胞的生理生化過(guò)程,提高植物對(duì)不良環(huán)境的耐受性[1-2]。

CDPKs在植物中多以基因家族形式存在,數(shù)量較多,廣泛分布在植物器官、組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞中,積極參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程。如擬南芥AtCPK17和AtCPK34過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致花粉管去極化生長(zhǎng)[3],過(guò)表達(dá)AtCPK4或AtCPK11基因能促進(jìn)擬南芥種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng),提高植株的耐旱能力[4],過(guò)表達(dá)AtCPK6、AtCPK8和AtCPK10可以顯著提高植株的耐旱能力[5-7],過(guò)表達(dá)AtCPK23的植株對(duì)干旱和鹽脅迫很敏感[8],AtCPK21突變體對(duì)高滲脅迫有較強(qiáng)的耐性[9],過(guò)表達(dá)水稻OsCPK9可以提高植株的耐旱能力[10],過(guò)表達(dá)OsCPK12可以提高植株的耐鹽能力[11],玉米ZmCPK14負(fù)向參與非生物脅迫[12]。說(shuō)明CDPKs在植物響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中,既可以正向參與,也可能負(fù)向參與,CDPKs的功能可能相同,也可能不同。

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物,也是紡織工業(yè)的主要原料。中國(guó)是棉花的主產(chǎn)區(qū)之一,新疆為典型的干旱、半干旱氣候特征,雨量少,干旱、鹽堿化土地面積大,發(fā)掘棉花干旱、鹽堿相關(guān)Gh-CDPKs基因,探究其在非生物逆境中所起的作用,對(duì)闡明棉花抵御非生物逆境的機(jī)制,提高棉花抗逆性意義重大。目前雖已從陸地棉基因組中鑒定出CDPKs家族基因,眾多的棉花CDPKs基因家族成員,在根、莖、葉、花瓣、雄蕊、雌蕊以及不同發(fā)育階段的胚珠和纖維等不同組織中都有表達(dá),說(shuō)明它們功能可能呈現(xiàn)多樣化[13],而對(duì)單個(gè)CDPK基因的具體功能研究鮮有報(bào)道[14-15]。在陸地棉基因組數(shù)據(jù)[16]中發(fā)現(xiàn)棉花GhCDPK4基因響應(yīng)干旱、鹽脅迫的誘導(dǎo)。為了探究GhCDPK4基因的功能,本研究以棉花品種‘新陸早42’為材料,克隆得到屬于CDPK 家族的基因GhCDPK4,通過(guò)基因重組技術(shù),構(gòu)建GhCDPK4基因的過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化模式植物煙草,分析轉(zhuǎn)基因植株在干旱和鹽脅迫處理下的表型、抗氧化酶活性和細(xì)胞膜穩(wěn)定性變化,為進(jìn)一步研究GhCDPK4基因的功能和提高棉花的抗逆性提供候選靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉‘新陸早42’(Gossypium hirsutumL.CV.Xinluzao 42)種子由新疆石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院棉花研究所提供。野生型(wild type,WT)煙草(NicotianatabacumL.)‘NC89’、大腸桿菌(Esherichia coli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300均由石河子大學(xué)綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1GhCDPK4基因的克隆和序列分析 參照天根生物科技有限公司RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品的RNA,采用Ta Kara公司cDNA 合成試劑盒合成cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)分別帶有KpnⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物GhCDPK4-KpnⅠF和GhCDPK4-PstⅠR(序列見(jiàn)表1)。以棉花cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò) 增,反 應(yīng) 體 系(20 μL)為Mix 10 μL、dd H2O 8μL、模板1μL、引物1μL。PCR 程序?yàn)?4 ℃預(yù) 變 性5 min;94 ℃變 性1 min,55 ℃退 火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收與p MD-19T 克隆載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)PCR 及質(zhì)粒雙酶切篩選鑒定的陽(yáng)性克隆,送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。最后,利用在線(xiàn)網(wǎng)站http://smart.embl-heidelberg.de對(duì)GhCDPK4基因所編碼的蛋白進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.2GhCDPK4基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)p MD-19T-GhCDPK4質(zhì)粒與轉(zhuǎn)pCAMBIA2300質(zhì)粒的大腸桿菌株系擴(kuò)大培養(yǎng),抽提質(zhì)粒,分別用PstⅠ和KpnⅠ雙酶切,酶切回收純化后,用T4DNA 連接酶進(jìn)行過(guò)夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后,在Kan(50μg/m L)抗性平板上挑取單菌落,進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè),然后陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取重組質(zhì)粒,用PstⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA2300-Gh-CDPK4。

1.2.3 煙草的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因鑒定 采用電穿孔轉(zhuǎn)化法將p CAMBIA2300-GhCDPK4植物過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草‘NC89’,用卡那霉素進(jìn)行篩選,分化出叢生芽后,移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng),半月后移栽入營(yíng)養(yǎng)土和蛭石體積比為3∶1的塑料花盆中,待幼苗長(zhǎng)至3～4片葉片時(shí),用植物基因組DNA 提取試劑盒,提取煙草基因組DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.4 基因表達(dá)量分析 提取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以Actin為內(nèi)參基因,利用在線(xiàn)網(wǎng)站GenScript(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool#)設(shè)計(jì)GhCDPK4熒光定量PCR 的特異引物(表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照帶有ROX 的Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,采用2-ΔΔCT方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[18]。

表1 本試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草脅迫處理及生理指標(biāo)測(cè)定選取鑒定成功并且長(zhǎng)勢(shì)相近的轉(zhuǎn)基因煙草,以野生型煙草為對(duì)照,分別進(jìn)行(1)自然干旱處理18 d;(2)澆灌300 mmol/L 濃度的NaCl溶液,間隔4 d灌一次,共處理20 d。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。干旱和鹽脅迫處理后,觀(guān)察表型并采樣,分別測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)質(zhì)量和相對(duì)電導(dǎo)率,采用Jungklang等[17]方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、CAT、SOD 和POD,采用Du等[18]方法測(cè)定丙二醛(MDA)含量,每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhCDPK4 基因的獲得和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用所設(shè)計(jì)的引物在大約1 500 bp處擴(kuò)增出清晰明亮的條帶,片段長(zhǎng)度與在http://ibi.zju.edu.cn/cotton/網(wǎng)站錄入GhCDPK4基因蛋白編碼序列(CDS)一致(圖1),測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)與GhCDPK4基因CDS序列堿基一致,該基因共編碼511個(gè)氨基酸。對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該蛋白含有1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)和4個(gè)EF-hand(圖2),是典型的植物CDPK 蛋白。根據(jù)其在陸地棉染色體的排布,將目的基因命名為GhCDPK4。

圖1 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Products of PCR amplification

圖2 GhCDPK4蛋白結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of GhCDPK4 protein

2.2 GhCDPK4 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBI2300-GhCDPK4載體T-DNA 區(qū)構(gòu)建如圖3-A。用基因重組技術(shù)將p MD-19T-GhCDPK4的GhCDPK4基因片段插入到pCAMBIA2300 載體上,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定(圖3-B)與PstⅠ和KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證(圖3-C),發(fā)現(xiàn)目的基因GhCDPK4已成功整合到pCAMBIA2300載體上,表明植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 GhCDPK4 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.3 Construction and verification of GhCDPK4 overexpression vector

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

提取轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA,利用Gh-CDPK4基因特異性引物進(jìn)行PCR 鑒定(圖4-A),鑒定出15株轉(zhuǎn)基因煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行基因表達(dá)量分析(圖4-B),結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GhCDPK4基因呈現(xiàn)高水平表達(dá),說(shuō)明GhCDPK4基因在煙草中成功表達(dá)。

圖4 過(guò)表達(dá)GhCDPK4 基因煙草株系的獲得Fig.4 Acquisition of tobacco lines over expressing GhCDPK4 gene

2.4 逆境脅迫后表型變化

野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草在未進(jìn)行干旱和鹽處理時(shí),長(zhǎng)勢(shì)差異不大(圖5-A 和5-C)。自然干旱脅迫處理后,野生型煙草老葉干枯發(fā)黃,葉片萎蔫嚴(yán)重,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草植株葉片發(fā)黃,萎蔫較輕(圖5-B);在NaCl溶液脅迫處理后,野生型煙草老葉干枯發(fā)黃脫落,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草植株葉片發(fā)黃,萎蔫較輕(圖5-D)。表明過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性升高。

圖5 野生型與過(guò)表達(dá)基因煙草表型Fig.5 Phenotype of wild-type and overexpressed gene tobacco

2.5 逆境脅迫后生理指標(biāo)檢測(cè)

逆境脅迫通常會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS),引起氧化損傷。為了應(yīng)對(duì)ROS的過(guò)量積累,植物通常會(huì)產(chǎn)生各種抗氧化酶,主要包括SOD、POD 和CAT。這些酶在清除活性氧和平衡細(xì)胞活性氧水平方面起著重要作用。丙二醛(MDA)是ROS引起的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,它與相對(duì)電導(dǎo)率一起可以反映質(zhì)膜的受損傷程度。因此筆者測(cè)定了3種抗氧化酶的活性和相對(duì)電導(dǎo)率以及MDA 的含量。結(jié)果如圖6所示,在正常生長(zhǎng)條件下,野生型煙草與過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率、CAT、SOD、POD 的活性及MDA 含量沒(méi)有顯著性的差異。干旱處理后,與野生型煙草相比,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量顯著降低,分別降低1.21 倍和1.20 倍,CAT、SOD 和POD 活性顯著升高,分別是野生型煙草的1.40倍、1.63倍和1.50倍。NaCl溶液處理后,與野生型煙草相比,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低,降低1.39倍。SOD 和CAT 活性顯著升高,是野生型煙草的1.54倍和1.38倍。POD 活性升高但不顯著,而MDA 含量沒(méi)有顯著差異。

圖6 野生型與過(guò)表達(dá)GhCDPK4 基因煙草的生理指標(biāo)Fig.6 Physiological indicators of wild-type and overexpressed GhCDPK4 gene in tobacco

3 討論

Ca2+作為常見(jiàn)的第二信使,在植物響應(yīng)外界刺激中起著關(guān)鍵作用。干旱、鹽堿等刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化,CDPK 因具有獨(dú)立的激酶結(jié)構(gòu)域和類(lèi)似于鈣調(diào)素的鈣離子結(jié)合域,可以直接感知和結(jié)合Ca2+,并能把Ca2+信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)放大和傳遞,進(jìn)一步調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),啟動(dòng)相應(yīng)的生理生化代謝過(guò)程,減輕或避免脅迫對(duì)植物造成傷害[19]。

氧化損傷或活性氧(ROS)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)已經(jīng)成為CDPKs保護(hù)植物免受脅迫的另一種機(jī)制。在水稻中,OsCPK12通過(guò)調(diào)節(jié)ROS的穩(wěn)態(tài)來(lái)增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐受性[20]。此外,OsCPK10 蛋白在水稻植株中的組成性表達(dá)通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化氫酶蛋白的積累,增強(qiáng)過(guò)氧化氫的解毒作用。這種活性導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的下降,從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和耐旱性[21]。過(guò)表達(dá)OsCPK4的水稻植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的保水能力,減少了膜脂過(guò)氧化和電解質(zhì)滲漏,從而產(chǎn)生了耐旱和耐鹽性[22]。在生姜中,鹽脅迫、干旱和茉莉酸處理可快速誘導(dǎo)ZoCDPK1的表達(dá)。ZoCDPK1基因在煙草中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致種子發(fā)芽率、相對(duì)含水量、脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)及葉片葉綠素含量和光合效率高于野生型對(duì)照[23]。

本研究中,在干旱和鹽脅迫下,過(guò)表達(dá)Gh-CDPK4基因 煙 草 的SOD、CAT 和POD 活 性 顯著升高,相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低,生長(zhǎng)狀況也比野生型好,說(shuō)明GhCDPK4基因可通過(guò)調(diào)節(jié)CAT、SOD 和POD 的積累,較好地促進(jìn)植物及時(shí)清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧,提高植物對(duì)超氧化物的解毒能力,保護(hù)細(xì)胞膜的完整性,減輕干旱、鹽脅迫對(duì)植物體造成損傷。干旱處理后,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草的MDA 含量顯著降低,而鹽處理后,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因煙草與野生型煙草MDA 含量差異不顯著,說(shuō)明此試驗(yàn)中干旱處理可能對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度更大些,GhCDPK4基因能顯著降低干旱對(duì)膜的損傷,推測(cè)GhCDPK4基因在干旱脅迫中所起的作用可能比在鹽脅迫中所起作用更大些。

提高植物抗逆性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境的可持續(xù)性發(fā)展至關(guān)重要。植物在自然條件下遭受的非生物脅迫往往不只一種,有時(shí)是多種非生物脅迫疊加,同時(shí)非生物脅迫還和生物脅迫相互關(guān)聯(lián),植物脅迫應(yīng)答還和生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)等有關(guān),這就使得植物的抗逆機(jī)制研究不再單一,還要考慮多個(gè)信號(hào)、多種機(jī)制交錯(cuò)調(diào)控。棉花CDPKs家族基因成員眾多,除了GhCDPK8、GhCDPK38、Gh-CDPK54、GhCDPK55、GhCDPK1、GhCDPK32和GhCDPK4基因被證明參與鹽或(和)干旱響應(yīng)應(yīng)答外,其他CDPKs基因是否參與和如何參與都需要進(jìn)一步研究證明,而有關(guān)GhCDPK4如何調(diào)控干旱和鹽脅迫下游相關(guān)基因的表達(dá),對(duì)脅迫植物新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育的影響及與其他信號(hào)途徑的交聯(lián)都有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉中克隆得到屬于CDPK 家族的基因GhCDPK4,過(guò)表達(dá)GhCDPK4基因可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)酶CAT、SOD 和POD 的積累,顯著提高植物對(duì)干旱、鹽脅迫的適應(yīng)性。