C型凝集素樣受體2與急性腦梗死病情程度及腦動(dòng)脈狹窄的相關(guān)性研究

陳歌迪， 陶中海， 伏 兵， 譚 玉， 聶紅霞， 周 芳， 張照婷， 于善花， 曾慶宏

急性腦梗死目前是我國(guó)中老年人死亡和致殘的主要原因，降低人們的生存及生活質(zhì)量[1]。而腦動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄是引起急性腦梗死的主要病因[2]，較早期識(shí)別血管狹窄及準(zhǔn)確判斷患者的病情程度并采取針對(duì)性的治療措施，是改善預(yù)后的關(guān)鍵。為了評(píng)估發(fā)生急性腦血管事件患者的神經(jīng)功能缺損程度，臨床上采用NIHSS量表[3],但存在評(píng)分偏向左側(cè)大腦半球等局限。CLEC-2作為血小板膜受體，與相應(yīng)配體結(jié)合后，在血小板的活化與聚集[4]、激活炎癥反應(yīng)等方面參與血栓形成[5～7]。有研究表明CLEC-2與缺血性疾病相關(guān)，而CLEC-2與急性腦梗死病情程度及腦動(dòng)脈狹窄研究鮮有報(bào)道。對(duì)此我們進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，試圖闡明其相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 前瞻性選取2020年6月-2021年7月在連云港市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科首次發(fā)病住院的急性腦梗死患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)病時(shí)間在2 w之內(nèi)；(2)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)急性腦梗死診斷指南2010診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)經(jīng)MRI明確診斷；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往口服過抗血小板及抗凝藥物等；(2)既往有卒中病史者；(3)出血性卒中或心源性栓塞；(4)動(dòng)靜脈血管畸形、煙霧病、大動(dòng)脈炎、動(dòng)脈夾層分離、高凝狀態(tài)、術(shù)后狹窄引起的缺血性卒中；(5)有明顯感染或存在嚴(yán)重臟器功能不全、惡性腫瘤、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心功能不全者。該研究獲得本院倫理委員會(huì)的審批，所有患者知情同意。并設(shè)同期本院105例健康體檢者為對(duì)照組。

1.2 資料收集 詳細(xì)記錄所有患者以下資料：(1)年齡、性別、BMI指數(shù)等一般人口學(xué)資料；(2)吸煙、飲酒史；(3)既往糖尿病、高血壓病病史；(4)入院收縮壓、舒張壓；(5)實(shí)驗(yàn)室檢查：血糖(隨機(jī)、空腹)、糖化血紅蛋白、高同型半胱氨酸血癥、甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、纖維蛋白原、尿酸；(6)臨床資料：NIHSS評(píng)分。

1.3 分組方法 根據(jù)入院時(shí)NIHSS評(píng)分評(píng)估病情，并分為3個(gè)亞組：輕度組NIHSS<6分，中度組6分≤NIHSS≤13分，重度組NIHSS≥14分。每位患者均行MRA檢查，由2位以上經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師判斷MRA結(jié)果后分為，腦動(dòng)脈狹窄組：MRA顯示管腔節(jié)段性變細(xì)甚至缺失(見圖1)；無腦動(dòng)脈狹窄組：為血管腔光滑，直徑均勻一致(見圖2)。

圖1 右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈閉塞

圖2 無腦動(dòng)脈狹窄

1.4 血漿CLEC-2的測(cè)定 入組患者入院當(dāng)天采集靜脈血2～5 ml收集在含有檸檬酸鈉作為抗凝劑的試管中，并以3000 rpm離心10 min后，將上清液存放于EP管中，統(tǒng)一保存到-80 ℃冰箱中，血漿標(biāo)本于同一批次送檢,采用 ELISA雙抗體夾心法按照操作說明測(cè)定CLEC-2濃度，并對(duì)血漿CLEC-2濃度進(jìn)行一式兩份定量檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 血漿CLEC-2水平與急性腦梗死病情嚴(yán)重程度的關(guān)系 共納入急性腦梗死患者211例，其中男131例(62.1%)，女80例(38.4%)，年齡(61.23±11.38)歲，血漿CLEC-2水平為(269.340±68.551)pg/ml，同期健康對(duì)照組105人，男62例(59.1%)，女43例(40.9%)，年齡(58.75±7.97)歲，CLEC-2水平為(172.980±21.012)pg/ml，前者CLEC-2水平明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。按照入院時(shí)NIHSS評(píng)分把患者分為輕(128例，60.7%)、中(55例，26.1%)、重(28例，13.3%)3個(gè)亞組，CLEC-2水平分為(226.55±48.51)pg/ml、(323.23±28.72)pg/ml、(359.09±29.75)pg/ml，CLEC-2水平逐漸升高且3組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 腦動(dòng)脈狹窄與無腦動(dòng)脈狹窄兩亞組間基線資料比較 梗死組患者根據(jù)MRA結(jié)果分為腦動(dòng)脈狹窄組(122例，57.820%)和無腦動(dòng)脈狹窄組(89例，42.180%)。單變量分析顯示，腦動(dòng)脈狹窄組年齡、BMI、吸煙史、入院收縮壓、入院血糖(隨機(jī)、空腹)、糖化血紅蛋白、低密度脂蛋白、纖維蛋白原、高半胱氨酸、入院NIHSS評(píng)分和CLEC-2濃度與非狹窄組存在顯著性差異(P<0.05)，可能為急性腦梗死患者合并腦動(dòng)脈狹窄的危險(xiǎn)因素(見表1)。

表1 狹窄組與無狹窄組危險(xiǎn)因素的單變量分析

2.3 急性腦梗死患者腦動(dòng)脈狹窄的多因素Logistic回歸分析結(jié)果 以存在腦動(dòng)脈狹窄為應(yīng)變量，上述各項(xiàng)危險(xiǎn)因素為自變量進(jìn)行的多因素Logistic回歸分析顯示，年齡(OR=1.078，95%CI1.032～1.126，P=0.001)、BMI(OR=1.453,95%CI1.122～1.881,P=0.005)、纖維蛋白原(OR=2.159，95%CI1.191～3.915，P=0.011)、CLEC-2濃度(OR=1.034，95%CI1.020～1.048，P<0.001)為ACI患者存在腦動(dòng)脈狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.4 CLEC-2預(yù)測(cè)急性腦梗死患者腦動(dòng)脈狹窄ROC曲線分析結(jié)果 ROC曲線分析結(jié)果顯示，CLEC-2濃度預(yù)測(cè)急性腦梗死患者腦動(dòng)脈狹窄的曲線下面積為0.862(95%CI0.812～0.912，P<0.001)；最佳截?cái)嘀禐?66.40 pg/ml，預(yù)測(cè)急性腦梗死患者腦動(dòng)脈狹窄的敏感度為80.3%，特異度為80.9%(見圖3)。

圖3 入院時(shí)CLEC-2濃度預(yù)測(cè)急性腦梗死患者腦動(dòng)脈狹窄的 受試者工作曲線

3 討 論

急性腦梗死為神經(jīng)內(nèi)科最常見的腦血管疾病，發(fā)病率正逐年增長(zhǎng)。能早期準(zhǔn)確判斷患者的病情程度并預(yù)測(cè)有無腦動(dòng)脈狹窄，有效識(shí)別高?；颊?，并由此采取針對(duì)性的治療，將會(huì)使患者大大獲益。

CLEC-2為血小板Ⅱ型跨膜受體，屬于C型凝集素超家族的一員，包括跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)，胞質(zhì)尾區(qū)的YXXL結(jié)構(gòu)對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要[8]。CLEC-2與內(nèi)源性配體平足蛋白(podoplanin,PDPN)結(jié)合后可使酪氨酸激酶磷酸化，并激活磷脂酶γ2(PLCγ2)，最終使血小板聚集[9,10]。越來越多的研究報(bào)道了CLEC-2與血栓形成的密切相關(guān)，并維持血小板聚集體的穩(wěn)定。Payne等使用下腔靜脈狹窄的小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，人為補(bǔ)充缺失的CLEC-2后，引起血小板聚集，PDPN隨之表達(dá)增加，而應(yīng)用抗PDPN抗體可使血栓減小，提示CLEC-2和PDPN的表達(dá)及相互作用引起血栓形成[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，CLEC-2可在一定程度上反應(yīng)血小板活化。費(fèi)敏等人研究指出，血漿高CLEC-2水平是冠心病獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。張偉等研究報(bào)道，高CLEC-2水平較低CLEC-2水平發(fā)生卒中進(jìn)展及不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)為7.69、4.58倍[13]。

本研究首次探討了CLEC-2與急性腦梗死早期神經(jīng)功能缺損程度的相關(guān)性，表明血漿CLEC-2水平與急性腦梗死病情程度相關(guān)。當(dāng)各種原因所致血管內(nèi)皮損傷時(shí)，血小板被激活，引起血栓形成、管腔狹窄。如果腦組織缺血缺氧未及時(shí)得到改善，出現(xiàn)不可逆損傷，此時(shí)CLEC-2水平進(jìn)一步增加，血小板活化及聚集反應(yīng)會(huì)更加強(qiáng)化，可能導(dǎo)致腦動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展及和持續(xù)的血栓栓塞癥狀，腦組織損傷進(jìn)一步加重[14]。此外，CLEC-2還可以和單核細(xì)胞PDPN可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并通過調(diào)控巨噬細(xì)胞功能促使動(dòng)脈粥樣硬化。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過PDPN抗體處理后的大腦中動(dòng)脈閉塞的小鼠，IL-18和IL-1β顯著降低，腦梗死的體積縮小，并改善神經(jīng)缺損的癥狀，表明CLEC-2/PDPN軸通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)在小鼠腦缺血性損傷中發(fā)揮著重要作用[5]，以上為CLEC-2與急性腦梗死病情程度相關(guān)的病理生理學(xué)機(jī)制。

腦動(dòng)脈狹窄發(fā)生的主要病理生理過程就是動(dòng)脈粥樣硬化及血栓的形成，是急性腦梗死的重要病因和明確的危險(xiǎn)因素[15,16]，既往細(xì)胞及動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)CLEC-2與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)在晚期動(dòng)脈粥樣硬化病變中發(fā)現(xiàn)了CLEC-2的配體PDPN，當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展時(shí)，PDPN濃度增加，并進(jìn)一步加重?fù)p傷[17]。而在早期的動(dòng)脈粥樣病變，血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞表達(dá)S100A13，引發(fā)血小板聚集，表明可能是獨(dú)立于PDPN的另一個(gè)CLEC2的潛在配體，S100A13和podoplanin的不同定位可能與其作用不同有關(guān)[18]。此外Furukoji等也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)，平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和都可以表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)其誘導(dǎo)PDPN的過度表達(dá)并激活CLEC-2，導(dǎo)致血栓形成[19]。因此，本研究綜合選擇了腦梗死的常見危險(xiǎn)因素并包括CLEC-2在內(nèi)的多項(xiàng)生化指標(biāo)，對(duì)梗死組腦動(dòng)脈狹窄患者和無腦動(dòng)脈狹窄患者進(jìn)行比較，將有差異的變量納入多因素Logistic回歸分析后，表明腦動(dòng)脈狹窄發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分別是年齡、BMI、纖維蛋白原、CLEC-2濃度，且狹窄組的風(fēng)險(xiǎn)是無狹窄組的1.078、1.453、2.159、1.034倍，雖然研究顯示糖尿病、低密度脂蛋白等分布差異不明顯，可能與患者為初次發(fā)病，發(fā)病年齡低，較多人處于糖尿病前期，病變處于動(dòng)脈硬化早期階段，低密度脂蛋白較纖維蛋白原沉積并不顯著[20]。ROC曲線提示，CLEC-2水平高于266.40 pg/ml可能有較高的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生腦動(dòng)脈狹窄。以上結(jié)果表明，CLEC-2可能反映了動(dòng)脈粥樣硬化疾病中的血小板活化和斑塊易損性，提示CLEC-2及其配體是血小板、免疫細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的分子橋梁，是炎癥和血栓形成之間的新型機(jī)制聯(lián)系。

總之，本研究結(jié)果提示血漿CLEC-2升高可作為急性腦梗死病情程度及有無血管狹窄的評(píng)估，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。未來找到CLEC-2及其配體在疾病診斷、治療和應(yīng)用中的平衡具有十分重要的意義。本研究局限：(1)少量樣本研究有一定的選擇性偏倚；(2)我們只測(cè)定了入院時(shí)CLEC-2水平，不能揭示CLEC-2水平升高是腦血管疾病的結(jié)果還是致病因素,二者之間因果關(guān)系尚不能確定;(3)腦血管狹窄的危險(xiǎn)因素并未完全納入,且血漿CLEC-2升高與大動(dòng)脈狹窄的獨(dú)立關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不清楚，上述的不足之處均可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此應(yīng)謹(jǐn)慎看待本研究結(jié)果，未來需要更大樣本、更加完善的設(shè)計(jì)方案來進(jìn)一步證實(shí)。