丁苯酞注射液預處理對腦缺血大鼠出血轉化及ERK5通路的影響

邵 婧，汪玉寶，張 淳，劉玉梅，趙 夢

缺血性腦卒中是由于腦供血動脈閉塞、狹窄或血栓等引起腦部供血不足，導致腦組織壞死的一類疾病，常引起神經功能障礙、動脈粥樣硬化等疾病，且病情發(fā)展不可逆，對缺血性腦卒中病人身體健康帶來嚴重影響[1-2]。治療腦缺血的方法包括溶栓、手術、抗凝藥物等，溶栓治療具有較好的療效，但溶栓后易發(fā)生出血性轉化等并發(fā)癥，是病人死亡的主要原因，腦梗死面積越大出血轉化發(fā)生率越高，而炎癥反應在腦梗死中發(fā)揮作用的同時也對腦內出血轉化有一定的影響[3-4]。因此，緩解腦缺血引起的出血轉化的新型藥物是研究的熱點。腦缺血疾病發(fā)展過程中，機體炎性因子增多，神經細胞、腦膠質細胞功能紊亂。有研究顯示，丁苯酞參與腦缺血再灌注病理過程，具有清除自由基，抑制細胞凋亡，抗局灶性炎癥等，在中樞神經系統(tǒng)疾病神經細胞保護方面發(fā)揮著積極作用，同時可減輕神經功能損傷，但具體作用機制尚不明確[5-6]。細胞外信號調節(jié)激酶5(extracellular signal-regulated protein kinase 5，ERK5)是體內普遍存在的信號系統(tǒng)之一，被缺血、高氧等多種刺激因素激活，通過磷酸化ERK5(phosphorylation ERK5，pERK5)將核外信號傳輸到細胞核內，參與細胞增殖、分化、凋亡等，與腦缺血引起的炎癥反應、腦梗死、血小板活化、大腦損傷及神經元死亡關系密切[7]。本研究通過構建腦缺血大鼠模型，觀察經丁苯酞注射液(NBP)預處理過的大鼠腦梗死、出血轉化及ERK5通路的變化，探討丁苯酞注射液的藥理機制，為腦缺血的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠(廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，約2月齡，體質量250～280 g，生產許可證號：SCXK(粵)2016-0002，動物質量合格證號：省科委2000A027。所有大鼠飼養(yǎng)于本院動物房中，自然光照，溫度25 ℃，相對濕度55%，自由進食、進水，保持動物房環(huán)境整潔，每周清潔1次鼠籠，每日更新食物及飲用水。本研究經動物倫理委員會批準同意。

1.2 實驗試劑及儀器 丁苯酞注射液(批號：101035-200901；規(guī)格：每瓶200 mg)，尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司生產，批號：D14202003034；規(guī)格：每片2 mg)，三苯基氯化四氮唑(TTC)(Amresco生物公司生產，批號298964)，MAP激酶激酶5(MAP kinase kinase 5，MEK5)、ERK5、肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer-binding factor 2C，MEF2C)，兔抗鼠單抗(批號：100953-T10、BCP1772400290、H00004208-D01P)、羊抗鼠IgG二抗(批號：RJC1793)均購自上海容創(chuàng)生物科技有限公司；β-actin抗體(貨號：C1843)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(貨號：E021010)購自中國博奧森公司；蘇木精染液(批號：YYJK-923)、伊紅染液(批號：230251)購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒(批號：JK-201)購自上海經科化學科技有限公司；尼康SMZ745光學顯微鏡(批號：325435)購自上海普赫生物科技有限公司；GIS-500凝膠成像儀(批號：1306412)購自Miulab公司；分光光度儀(型號：DR6000)購自HACH公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組、給藥及模型制備 將118只健康SD雄性大鼠按照隨機數字法分為假手術組、單純腦缺血再灌注組(模型組)、尼莫地平組[8.0 mg/(kg·d)]、NBP低劑量組[20 mg/(kg·d)]、NBP中劑量組[40 mg/(kg·d)]、NBP高劑量組[80 mg/(kg·d)][8]；其中假手術組18只，其余組各20只。參照文獻[9]進行腦缺血再灌注損傷大鼠模型制備，將大鼠麻醉后進行頸部皮膚消毒，經頸正中切口暴露總動脈、頸內動脈、頸外動脈，使用絲線結扎頸外動脈，由頸外動脈殘端插入尼龍線栓阻斷大鼠腦中動脈血流，尼龍線栓直徑0.38 mm，插入深度為(19±1)mm，術中監(jiān)測大鼠心率、動脈壓等，保證各項生理指標均正常，之后立即按照給藥劑量腹腔注射相應藥物，假手術組和模型組給予等量生理鹽水，2 h后拔除線栓，恢復血流后進行再灌注，假手術組總動脈、頸內動脈、頸外動脈暴露后不進行線栓插入等處理，立即縫合。

1.3.2 腦缺血再灌注損傷大鼠模型神經功能缺損評分 再灌注24 h后參考Longa等[10]分級法評定大鼠神經功能，神經功能無缺損計0分，出現雙側前肢屈曲等癥狀計1分，出現行走時向對側旋轉等癥狀計2分，行走時向對側傾倒計3分，意識喪失或無法獨立行走計4分，重復評定3次，評分1～3分提示模型構建成功。剔除死亡和評分不合格的大鼠，各組大鼠建模成功18～20只，共建模成功93只，模型構建成功率為93%。

1.3.3 TTC法測定大鼠腦梗死面積 造模后24 h，每組各選取3只大鼠，將其麻醉后斷頭取腦，去除額極、枕極，沿冠狀面行切片處理，厚度約2 mm，將切片置于2%TTC磷酸緩沖鹽溶液中，染色并固定24 h，無梗死區(qū)呈紅色，梗死區(qū)呈白色，拍照觀察后使用Image-pro Plus 6.0計算腦梗死面積，腦梗死面積=全腦梗死面積/全腦面積×100%。

1.3.4 分光光度法測量梗死區(qū)腦組織血紅蛋白含量 參照文獻[11]測定大鼠腦中血紅蛋白含量評估出血轉化量，各組取6只大鼠全腦組織去除腦干和小腦，加入組織裂解液進行勻漿處理，取2 mL腦組織勻漿離心后取上清液，540 nm處測得吸光度值，根據標準曲線得到血紅蛋白含量。取非實驗正常大鼠，麻醉后取腦，取心臟血液(0 μL，2 μL，4 μL，8 μL，16 μL)與正常腦組織勻漿混勻后離心，取上清液測定吸光度，采用測得的吸光度值與相應血紅蛋白光度值繪制標準曲線。

1.3.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腦組織出血情況 選取3只大鼠腦組織行HE染色，將組織置于生理鹽水中漂洗干凈，采用4%多聚甲醛溶液固定后，經低濃度到高濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后使用切片機進行切片，得到常規(guī)病理切片，之后進行蘇木精染色，伊紅復染，脫水封片，具體操作按照說明書進行。封片后于高倍鏡下觀察出血情況。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測大鼠腦組織MEK5、p-MEK5、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C蛋白表達量 取各組6只大鼠腦組織0.25 g，使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后研磨，加入蛋白裂解液后置于冰上靜置30 min，離心并收集上清液，參照BCA試劑盒說明書測定其蛋白濃度，配制8%分離膠、5%濃縮膠，取50 μg蛋白上樣，電泳開始時設置電壓為80 V，進入分離膠電泳時電壓升高至120 V，電泳結束后，將目的蛋白凝膠轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，電壓為110 V，反應時間1 h，轉膜完成后使用TBST溶液清洗，加入5%脫脂牛奶于室溫下封閉1 h，TBST洗滌后加入一抗(MEK5、p-MEK5、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C、GAPDH抗體，稀釋倍數1 ∶1 000)，4 ℃過夜，經TBST洗滌后加入羊抗鼠IgG二抗(稀釋倍數1∶5 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗后進行電化學發(fā)光(ECL)顯色，置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達情況。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分升高(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組大鼠神經功能缺損評分呈下降趨勢(P<0.05)，且NBP預處理組呈一定的劑量效應關系；NBP高劑量組與尼莫地平組神經功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(±s) 單位：分

2.2 NBP預處理對大鼠腦梗死面積的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死面積增加(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組腦梗死面積減小(P<0.05)，且NBP預處理組呈一定劑量效應關系；NBP高劑量組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 大鼠腦組織TTC染色情況

表2 各組大鼠腦梗死面積比較(±s) 單位：%

2.3 NBP預處理對大鼠出血轉化的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血紅蛋白含量升高，出血點增多(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組大鼠血紅蛋白含量降低(P<0.05)，且NBP預處理組呈一定劑量效應關系；NBP高劑量組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 大鼠腦組織HE染色圖(×400)

表3 各組大鼠血紅蛋白含量比較(±s) 單位：μg/半球

2.4 各組大鼠MEK5、ERK5、MEF2C蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，NBP各劑量組和尼莫地平組大鼠p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C蛋白表達水平升高(P<0.05)，且NBP預處理組呈一定的劑量效應關系；NBP高劑量組與尼莫地平組p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 大鼠腦組織p-MEK5、MEK5、p-ERK5、ERK5、p-MEF2C、MEF2C蛋白表達電泳圖(A為假手術組；B為模型組；C為NBP低劑量組；D為NBP中劑量組；E為NBP高劑量組；F為尼莫地平組)

表4 各組大鼠p-MEK5、MEK5、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C蛋白表達比較(±s)

3 討 論

缺血性腦損傷機制復雜，機體氧化應激反應、炎癥反應、鈣離子超載、神經元凋亡等均被認為參與腦損傷過程，是高致殘率、高致死率、高復發(fā)率的神經系統(tǒng)疾病，大腦中動脈栓塞、狹窄、閉塞，血栓形成，低血壓等因素均可導致該疾病發(fā)生，神經功能缺損又加劇各種心腦血管并發(fā)癥發(fā)生，嚴重影響病人生活質量及心理健康，給病人家庭及社會帶來沉重負擔[12-13]。目前，急性缺血性腦卒中以機械性取血栓和溶栓治療為主，從而形成再灌注，常導致腦梗死及出血轉化情況，對病人生命造成較大威脅，因此，構建腦缺血大鼠對研究腦缺血疾病具有重要的臨床意義。構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型的方式有多種，其中，線栓法是公認的較理想的模型構建方法，在研究中應用廣泛[14]。本研究采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，結果顯示，模型組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死面積大于假手術組，表明腦缺血再灌注對大鼠神經功能及腦組織造成較大的損傷，提示大鼠腦缺血再灌注損傷模型構建成功。

有研究顯示，腦缺血易引發(fā)腦梗死等，腦梗死同時引發(fā)腦部炎癥反應，加重顱內出血等，嚴重時導致全身出血，對病人生命造成威脅[15]，因此，研究新型腦缺血治療藥物是近年來的研究熱點。丁苯酞是從芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素消旋體，具有一定的神經保護作用。多項研究顯示，丁苯酞對急性缺血性腦卒中病人的神經功能損傷有改善作用，可能通過減少腦水腫、縮小腦梗死面積、改善血腦屏障通透性和腦能量代謝、抗炎及抑制神經細胞凋亡等發(fā)揮神經保護作用[16-17]。本研究結果顯示，經過NBP預處理的大鼠神經功能缺損評分、腦梗死面積均低于模型組，且呈一定的劑量效應關系，表明丁苯酞注射液具有保護腦缺血再灌注大鼠神經功能及改善腦梗死的作用。

相關研究顯示，溶栓治療大面積腦梗死后易引起神經系統(tǒng)疾病、炎癥反應及腦組織出血，加重腦損傷，提高腦梗死病人死亡率，因此尋找緩解腦梗死后出血轉化的藥物為治療腦缺血提供了新方向[18-19]。ERK5是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，易被多種炎性因子激活，在血小板活化中發(fā)揮調控作用，可能參與動脈血栓形成。MEK5是ERK5獨特的特異性上游激酶，可特異性激活ERK5，活化的ERK5誘導p-ERK5表達升高，進而發(fā)揮抗神經元損傷，抑制神經細胞凋亡等作用，ERK5同時又激活MEF2C，使MEF2C去磷酸化具有轉錄活性，誘導機體胚胎干細胞分化為神經細胞，進而起到神經保護作用。有研究顯示，激活的MEK5-ERK5-MEF2C信號通路對腦缺血引起的炎癥反應具有一定的抑制作用，可能緩解腦缺血引起的腦出血轉化情況[20]。本研究結果顯示，經NBP預處理的大鼠血紅蛋白含量及腦出血量降低，腦組織p-ERK5/ERK5、p-MEK5/MEK5、p-MEF2C/MEF2C水平升高，表明丁苯肽注射液能有效減輕腦缺血大鼠出血轉化情況，可能通過激活MEK5-ERK5-MEF2C通路發(fā)揮神經保護作用。

綜上所述，丁苯酞注射液對腦缺血大鼠具有一定的療效，可能通過激活MEK5-ERK5-MEF2C通路，緩解出血轉化，減少腦梗死面積等發(fā)揮神經功能保護作用，為臨床治療腦缺血提供新思路。本研究未通過抑制該通路進行對照，存在一定的不足，仍需進一步研究。