黃連溫膽湯調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路干預(yù)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

楊金果，鞠建慶，湯獻(xiàn)文，嚴(yán)權(quán)浩

隨著社會(huì)老齡化加重及居民不健康生活方式，我國(guó)心血管疾病發(fā)病率、死亡率持續(xù)升高，疾病負(fù)擔(dān)日漸加重，防治心血管疾病刻不容緩[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病的重要病理基礎(chǔ)[2]。既往研究表明，抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減輕炎癥反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。黃連溫膽湯是治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的常用復(fù)方，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，其具有降低血脂水平，減小主動(dòng)脈斑塊面積和抑制動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展的作用[3]。黃連溫膽腸能否通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究報(bào)道較少。本研究采用黃連溫膽湯為干預(yù)措施，高脂飼料飼養(yǎng)的載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，探討黃連溫膽湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)效應(yīng)及其與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)系，以期揭示黃連溫膽湯干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7～8周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)ApoE-/-小鼠30只，相同周齡C57BL/6J小鼠6只，雄性，體質(zhì)量(25±5)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，批號(hào)：1100111911017204。高脂飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：京飼證(2014)06057，批號(hào)：1103221900009954。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 黃連溫膽湯組方：黃連10 g，半夏15 g，竹茹10 g，枳實(shí)15 g，陳皮15 g，茯苓15 g，生姜5 g，炙甘草5 g，水煎2次合并濃縮為1 g/mL，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。雷帕霉?aladdin，批號(hào)：CAS53123-8)；氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H13023201)；三酰甘油(TG)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20190810)；總膽固醇(TC)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20190810)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20190810)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20190810)；Anti-PI3K抗體(美國(guó)Abcam，批號(hào)ab182651)，Anti-Akt1/Akt2/Akt3抗體(美國(guó)Abcam，批號(hào)ab179463)，Anti-mTOR抗體(美國(guó)Abcam，批號(hào)ab32028)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平(Sartorius公司，型號(hào)：BSA3202S-CW)，小動(dòng)物體重天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：YP1002)；邁瑞B(yǎng)S-420全自動(dòng)生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；高清成像系統(tǒng)，佳能(Canon)EOS 5D。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)造模、分組及給藥 ApoE-/-小鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予高脂飼料飼養(yǎng)4周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型[4-6]，隨機(jī)分為模型組、雷帕霉素組[4 g/(kg·d)]、黃連溫膽湯低劑量組[9 g/(kg·d)]、黃連溫膽湯中劑量組[18 g/(kg·d)]、黃連溫膽湯高劑量組[36 g/(kg·d)]，每組6只小鼠。同時(shí)選取雄性C57BL/6J小鼠6只作為對(duì)照組，給予普通飼料飼養(yǎng)。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，對(duì)照組、模型組給予等體積純凈水灌胃。4周后處死小鼠取材。

1.4.2 觀察指標(biāo)

1.4.2.1 血脂 從小鼠眼球靜脈叢取血，將離心管靜置室溫2 h，待血液凝固成血塊收縮后，3 000 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.4.2.2 病理學(xué)染色 蘇木精-伊紅(HE)染色：取小鼠主動(dòng)脈根部組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，覆水，蘇木素染液染色5 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化3～5 s，返藍(lán)，0.5%伊紅染液染色1 min，脫水封片。Masson染色：取小鼠主動(dòng)脈根部組織石蠟包埋，切片，脫蠟，Masson染色試劑盒內(nèi)Weigert氏鐵蘇木素染5 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘返藍(lán)，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液處理3～5 min，苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸分化處理1 min，脫水封片。油紅O染色：取小鼠主動(dòng)脈根部組織取材后使用OCT包埋，進(jìn)行6～8 μm冰凍切片，之后將組織粘貼于載玻片上，蒸餾水沖洗，油紅O工作液10～15 min，75%乙醇分化2 s，水洗，蘇木素1～2 min，水洗，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，水洗，紙巾擦去周圍水，甘油明膠封片。

觀察、拍照并采用Image-pro-plus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行分析。主動(dòng)脈根部斑塊面積即主動(dòng)脈根部脂質(zhì)面積與管腔面積百分比，膠原纖維含量即膠原纖維面積與血管總面積(含斑塊)百分比。

1.4.2.3 免疫組化法檢測(cè)PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá) 取小鼠主動(dòng)脈根部組織并用石蠟常規(guī)切片，脫蠟，蒸餾水沖洗3 min，3次，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4 ℃冰箱中過(guò)夜，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)振蕩清洗后分別滴加二抗、三抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片，觀察后拍照。采用Image-pro-plus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 黃連溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組TG降低(P<0.05)，TC、LDL-C有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯中劑量組LDL-C、TG降低(P<0.05)，TC有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯高劑量組TC、TG、LDL-C均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組、黃連溫膽湯高劑量組HDL-C比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

2.2 黃連溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊病理形態(tài)學(xué)的影響 主動(dòng)脈根部HE染色顯示：對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈根部血管壁層次清晰，內(nèi)膜平滑完整，無(wú)粥樣斑塊沉積。模型組與各給藥組小鼠主動(dòng)脈根部均有不同程度的粥樣斑塊沉積。模型組易損斑塊特征明顯，管壁彌漫性增厚，斑塊體積大，斑塊內(nèi)脂核大、數(shù)量多，可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶沉積，纖維帽細(xì)薄或不連續(xù)，中膜變薄；各給藥組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積減小，病變較局限，粥樣斑塊纖維帽厚，脂核小，泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶少，斑塊趨于穩(wěn)定。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠主動(dòng)脈根部HE染色圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

2.3 黃連溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積的影響 油紅O染色顯示：對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈根部血管內(nèi)膜光滑完整，未見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組主動(dòng)脈根部斑塊面積有減小趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雷帕霉素組、黃連溫膽湯高劑量組較模型組主動(dòng)脈根部斑塊面積減小(P<0.05)；但雷帕霉素組與黃連溫膽湯高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組主動(dòng)脈根部油紅O染色圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

與模型組比較，＊P<0.05。

2.4 黃連溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊中膠原纖維含量的影響 Masson染色顯示，與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組小鼠主動(dòng)脈根部膠原纖維含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但雷帕霉素組、黃連溫膽湯高劑量組較模型組膠原纖維含量升高(P<0.05)；雷帕霉素組、黃連溫膽湯高劑量組膠原纖維含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 各組主動(dòng)脈根部Masson染色圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

與模型組比較，＊P<0.05。

2.5 黃連溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，雷帕霉素組、黃連溫膽湯中劑量組和黃連溫膽湯高劑量組小鼠主動(dòng)脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黃連溫膽湯低劑量組有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖7～圖10。

圖7 各組主動(dòng)脈根部病變區(qū)PI3K蛋白免疫組化染色圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

圖8 各組主動(dòng)脈根部病變區(qū)Akt蛋白免疫組化染色圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

圖9 各組主動(dòng)脈根部病變區(qū)mTOR蛋白免疫組化染色圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

與模型組比較，＊P<0.05。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種好發(fā)于大動(dòng)脈、中動(dòng)脈的血管壁慢性炎癥病變，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是一條經(jīng)典的促存活和抗凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在自噬中發(fā)揮核心和關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[7-8]。其中PI3K是上游關(guān)鍵分子，負(fù)調(diào)節(jié)自噬，可連接到細(xì)胞膜上，進(jìn)而激活A(yù)kt；活化的Akt可解除下游結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物對(duì)mTOR的抑制作用，增加mTOR活性；活化的mTOR是自噬相關(guān)信號(hào)通路的核心，可抑制由多種誘因?qū)е碌募?xì)胞自噬。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生存、增殖、凋亡等，參與高血壓、冠心病、腫瘤等多種疾病的病理?yè)p傷過(guò)程。相關(guān)研究顯示，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減少斑塊巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制炎癥反應(yīng)，繼而穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊[9-11]。目前已知某些中藥有效成分通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，調(diào)控巨噬細(xì)胞發(fā)揮自噬抗動(dòng)脈粥樣硬化。滿藝璁等[12]研究顯示，化瘀祛痰方通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化家兔肝臟自噬穩(wěn)態(tài)，減緩肝臟脂質(zhì)損傷，從而改善動(dòng)脈粥樣硬化。張志鑫等[13]研究顯示，黃芪甲苷通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

中醫(yī)學(xué)中無(wú)“動(dòng)脈粥樣硬化”病名，根據(jù)病人臨床表現(xiàn)，歸屬于“眩暈”“頭痛”“中風(fēng)”“胸痹”“脈痹”等病癥范疇，病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛包括氣虛、陰虛、陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)包括血瘀、痰濁、寒凝、氣滯、熱毒，其中痰濁和熱毒是防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理因素，痰熱互結(jié)是嶺南地區(qū)常見(jiàn)病機(jī)之一[14]。黃連溫膽湯出自清代陸廷珍的《六因條辨》，由宋代醫(yī)學(xué)家陳言《三因極一病癥方論》中記載的溫膽湯基礎(chǔ)上去大棗加黃連而成，藥物組方為黃連、半夏、竹茹、枳實(shí)、陳皮、炙甘草、茯苓、生姜，主要功效為清熱、燥濕、化痰，臨床廣泛用于內(nèi)科雜病的治療，亦是治療動(dòng)脈粥樣硬化痰熱互結(jié)證的代表復(fù)方[15]。朱瑞等[16]研究顯示黃連溫膽湯治療冠心病心絞痛療效顯著。燕珊等[3]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，黃連溫膽湯具有降低血脂水平、減小主動(dòng)脈斑塊面積和抑制動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展的作用。

本研究以高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，探討黃連溫膽湯是否通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，結(jié)果顯示，黃連溫膽湯干預(yù)后小鼠血清TG、TC、LDL-C較模型組降低，表明黃連溫膽湯可降低小鼠血清TG、TC、LDL-C水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。HE染色、油紅O、Masson染色顯示：模型組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積增大，脂質(zhì)含量增多，纖維膠原含量減少，泡沫細(xì)胞聚集，且脂核大，纖維帽變薄，斑塊不穩(wěn)定。藥物干預(yù)后，黃連溫膽湯高劑量組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積比例減小，膠原纖維含量增加，斑塊趨于穩(wěn)定，表明黃連溫膽湯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、穩(wěn)定易損斑塊的作用。雷帕霉素組、黃連溫膽湯中劑量組、黃連溫膽湯高劑量組小鼠主動(dòng)脈根部PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)較模型組降低，表明黃連溫膽湯可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化，穩(wěn)定易損斑塊的作用。

綜上所述，黃連溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠具有良好的降脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化，穩(wěn)定易損斑塊作用，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷和炎癥反應(yīng)有關(guān)。