基于DARTS 技術的丹參素鈉直接結合靶蛋白鑒定*

陳緣靜，蔣薇薇，李麗華，張成中，張 川，2，賈 丹**

1 海軍軍醫(yī)大學 藥學系，上海 200433；2 上海大學 醫(yī)學院，上海 200444

丹參素是唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）中主要的水溶性酚酸類化合物，廣泛用于心血管疾病的預防和治療。丹參素結構中含有鄰二酚羥基，易被氧化、穩(wěn)定性差；另外由于羧基的存在，水溶性強，很難透過細胞膜的脂質(zhì)雙分子層，口服給藥時絕對生物利用度低；同時羧基能夠與葡萄糖醛酸結合隨尿液排出體外，故在體內(nèi)的半衰期很短，極大地限制了丹參素的臨床應用[1]。丹參素鈉是丹參素的羧酸鹽，兩者生物活性相當，但前者性質(zhì)更為穩(wěn)定。

丹參素鈉注射劑于2016 年由CFDA 批準為中藥一類新藥進入Ⅰ期臨床試驗（CXZL1000089），用于冠心病及穩(wěn)定性心絞痛的治療。研究表明，丹參素鈉可通過減輕自由基損傷、抑制炎癥反應、防止心肌缺血損傷、促進血管內(nèi)皮生長等多種途徑發(fā)揮心臟保護作用[2]。但是，目前丹參素鈉直接結合的靶蛋白仍不明確，其潛在心血管保護作用機制仍待深入研究。

明確藥物作用靶點，有助于針對靶點進行藥物結構的優(yōu)化改造，以增強藥效及降低藥物的毒副作用。藥物親和反應靶點穩(wěn)定技術（drug affinity responsive target stability，DARTS）是一種新型靶標鑒定方法，它的原理是藥物與靶蛋白結合后能夠穩(wěn)定靶蛋白，使其抵抗蛋白酶的消化作用。該技術最大優(yōu)勢在于活性化合物無需任何結構修飾、不影響藥物活性，適用于任何小分子化合物的靶蛋白鑒定[3]。目前，該技術已成功用于多種藥物的靶點鑒定。因此，本研究擬采用DARTS 技術鑒定丹參素鈉可能的直接結合靶蛋白，探究其心血管保護作用機制，為臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材 料

1.1 細胞

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由海軍軍醫(yī)大學藥學系藥理學教研室贈與。

1.2 藥品與試劑

丹參素鈉鹽由海軍軍醫(yī)大學藥學系中藥鑒定學教研室提供（純度≥99%），用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成50 mmol·L-1母液于-20 ℃保存?zhèn)溆?，使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度。胎牛血清（FBS）購自Gibco Life Technology Co.（澳大利亞）；Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）和PBS 購自Hyclone（Thermo Fisher）；青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購自Gibco-BRL Co.（Rockville，MD，USA）；哺乳動物蛋白提取試劑盒M-PER?（Thermo Scientific）；鏈霉素蛋白酶（Pronase）（Roche，美國）；蛋白酶抑制劑（Complete Mini，Roche，美國）；，磷酸酶抑制劑、5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、快速銀染試劑盒（碧云天生化公司）；CD44 抗體（BioVision）；GAPDH抗體、重組人CD44 蛋白（Abcam）；IRDye 800CW 山羊抗兔或IRDye 680RD 山羊抗鼠二抗（Rockland Immunochemicals，Inc.，美國）。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

HUVEC 細胞用含10% FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

蛋白提取按照M-PER?試劑盒說明書進行操作。取約1×107個貼壁生長的HUVEC 細胞，棄去完全培養(yǎng)基，以預冷PBS 液洗滌3 次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的提取緩沖溶液1 mL，冰上孵育10 min，渦旋5 min，4 ℃14000×g 離心15 min，收集上清液即為蛋白溶液。BCA 法測定蛋白濃度，立即進行后續(xù)實驗。

2.2 鏈霉素蛋白酶Pronase 濃度的考察

取含有100 μg 蛋白的20 μL 反應體系，共7份，分別加入2 μL 不同終濃度的Pronase（0、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%和3%，濃度以蛋白酶質(zhì)量相對于總蛋白質(zhì)量的百分數(shù)表示），混勻后室溫孵育30min，分別加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液6μL，煮沸10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），對凝膠進行硝酸銀染色，采用GS-800 光密度掃描儀（Bio-Rad，美國）采集圖像。

2.3 丹參素鈉濃度的考察

取含有100 μg 蛋白的20 μL 反應體系，共6 份，分別加入不同終濃度（0、10、50、250、500、1000 μmol·L-1）的丹參素鈉2 μL，混勻后室溫孵育60 min，分別加入終濃度為0.03%的Pronase 2 μL，混勻后室溫孵育30 min，分別加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液6 μL，煮沸10 min，后續(xù)步驟同上。

2.4 鏈霉素蛋白酶、丹參素鈉濃度的考察

取含有100 μg 蛋白的20 μL 反應體系，共7份，分別加入終濃度500 μmol·L-1的丹參素鈉2 μL，混勻后室溫孵育60 min，分別加入不同終濃度的Pronase（0、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%和3%，濃度以蛋白酶質(zhì)量相對于總蛋白質(zhì)量的百分數(shù)表示）2 μL，混勻后室溫孵育30 min，分別加入5×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液6 μL，煮沸10 min，后續(xù)步驟同上。

2.5 DARTS 實驗鑒定丹參素鈉擬結合靶標蛋白

參照文獻報道[4，5]，取含有100 μg 蛋白的20 μL反應體系，共7 份，分別加入不同終濃度的丹參素鈉（0、10、50、250、500、1000 μmol·L-1）2 μL，混勻后室溫孵育60 min，分別加入終濃度0 或0.03%的Pronase（濃度以蛋白酶質(zhì)量相對于總蛋白質(zhì)量的百分數(shù)表示）2 μL，混勻后室溫孵育30 min，分別加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液6 μL，煮沸10 min，進行SDS-PAGE 電泳，銀染，取目標條帶交由生工生物工程（上海）股份有限公司通過基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）及特異性肽段進行蛋白質(zhì)解析，并通過Western blotting 驗證。

2.6 免疫印跡實驗（Western blotting）

取30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，轉移至PVDF 膜（0.45 μm），5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。然后將膜與CD44（1∶2000）和GAPDH（1∶3000）一抗4 ℃孵育過夜，最后與IRDye 800CW 山羊抗兔或IRDye 680RD 山羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫避光孵育2 h。GAPDH 作為內(nèi)參。LI-COR 檢測系統(tǒng)和Tanon圖像系統(tǒng)（Tanon，China）分析蛋白條帶灰度。

2.7 表面等離子共振分析丹參素鈉與潛在靶標蛋白的結合

將50 μg·mL-1純化的人全長CD44 蛋白（Abcam）應用氨基偶聯(lián)法固定到HisCap 傳感器芯片表面。在流動相緩沖液（1×PBS，0.5% DMSO）中加入不同濃度的丹參素鈉，觀測芯片產(chǎn)生的響應信號。使用Biacore T2000（GE Healthcare）控制軟件計算結合和解離速率常數(shù)。結合親和力用結合速率常數(shù)與解離速率常數(shù)的比率表示。

3 結果

3.1 DARTS 實驗

在DARTS 實驗中，蛋白酶的作用濃度是考慮的首要因素。不同終濃度的蛋白酶Pronase（0、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%和3%）對HUVEC 細胞總蛋白的消化作用如圖1A 所示。與不加Pronase的對照組相比，較低濃度的Pronase（0.01%）對蛋白的消化作用較弱，蛋白條帶與對照組幾乎沒有差別；而較高濃度的Pronase（0.1%、0.3%、1%和3%）對蛋白的消化作用過強，分子量較大的蛋白幾乎完全被消化成分子量較小的蛋白或肽段。因此，選取消化作用適中的0.03% Pronase 作為本次DARTS 實驗中的酶濃度。

藥物與靶蛋白的結合存在濃度依賴關系，因此藥物濃度是DARTS 實驗中的另一個重要因素。對于親和力較低或親和力未知的化合物，文獻推薦使用濃度為500 μmol·L-1的化合物，在此濃度下不會因為化合物的濃度過高產(chǎn)生非特異性結合[6]。比較不同濃度丹參素鈉作用下Pronase 對HUVEC 細胞總蛋白的消化作用，結果如圖1B 所示。在較高濃度（1000 μmol·L-1）的丹參素鈉作用時，給藥組與對照組的蛋白條帶能夠呈現(xiàn)出差異，在低分子量處對照組較重。而在較低濃度（10、50 μmol·L-1）的丹參素鈉作用時，給藥組與對照組的差異不明顯。因此，為了能夠鑒定出更為明顯的丹參素鈉的結合蛋白，選取500 μmol·L-1丹參素鈉作為本實驗中的藥物濃度。

在500 μmol·L-1丹參素鈉濃度下，加入不同濃度的Pronase 作用。如圖1C 所示，500 μmol·L-1丹參素鈉、0.03% Pronase 作用時，給藥組與對照組的差異蛋白條帶較為明顯。接下來，將HUVEC 細胞蛋白裂解液與不同濃度的丹參素鈉孵育，然后用0.03%Pronase 消化。采用SDS-PAGE 的方法來表征DARTS 實驗的結果，從凝膠上鑒別出給藥組和對照組中的差異蛋白條帶。銀染結果表明，與丹參素鈉孵育的細胞蛋白裂解物約在100 kDa 處有明顯的條帶，且隨著丹參素鈉濃度的增加愈加清晰（圖1D）。根據(jù)DARTS 技術原理，丹參素鈉能夠保護此條帶中的蛋白使其抵抗pronase 鏈霉蛋白酶的消化作用，故認為此條帶中的蛋白是可能的丹參素鈉在HUVEC 細胞中的結合靶蛋白。

圖1 DARTS 實驗中鏈霉素蛋白酶Pronase、丹參素鈉作用濃度的考察

3.2 蛋白質(zhì)譜分析及Western blotting 驗證丹參素鈉結合蛋白

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS），分析對照組與丹參素鈉給藥組的SDS-PAGE 差異蛋白切割膠。結合兩次蛋白質(zhì)譜分析結果，通過Mascot 檢索，利用特異性肽段，結合蛋白分子量、肽段可信度的綜合評分，初步篩出CD44 可能為丹參素鈉的結合靶蛋白，有4 條特異性肽段被鑒定到（見圖2A）。將經(jīng)過DARTS 實驗的樣品，采用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）通過CD44 鼠抗人單克隆抗體進一步證實。結果如圖2B 所示，不同濃度的丹參素鈉與目的蛋白CD44 結合后，均不同程度地提高了目的蛋白CD44 的穩(wěn)定性，降低了Pronase 對CD44 的消化作用。

圖2 （A）靶蛋白的質(zhì)譜鑒定結果（B）Western blotting 驗證丹參素鈉與結合靶標蛋白CD44 的DARTS 實驗結果

3.3 利用表面等離子體共振（SPR）技術測定丹參素鈉與靶蛋白之間的結合常數(shù)

DARTS 及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗表明，丹參素鈉在HUVEC 細胞中可能的結合靶蛋白為CD44，然后用BiacoreT200 生物分子相互作用分析系統(tǒng)、進行丹參素鈉與靶蛋白CD44 相互作用的動力學分析。成功測定了丹參素鈉1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μmol·L-1等濃度下的響應值，計算出丹參素鈉與靶蛋白CD44 的結合常數(shù)為4.84×10-4mol·L-1，見圖3。

圖3 CD44 對不同濃度的丹參素鈉的響應曲線

4 討論

前期課題組利用HuProtTM20K 人類蛋白組芯片，發(fā)現(xiàn)丹參素鈉可與370 個蛋白產(chǎn)生特異性結合[7]。盡管該方法是一種鑒定蛋白質(zhì)-小分子相互作用快速經(jīng)濟、高通量的手段；但其自身也存在一些局限性[8]：蛋白質(zhì)組芯片是在體外分子水平研究蛋白質(zhì)與化合物的相互作用的，芯片中的蛋白質(zhì)固定之后失去了它們的天然結構；高豐度蛋白會干擾低豐度蛋白的檢測，導致假陽性結果；非特異性結合存在干擾效應；該技術是基于“勾釣”原理，無法鑒別與化合物產(chǎn)生瞬時作用的靶蛋白。

本實驗以DARTS 技術鑒定丹參素鈉在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的結合靶蛋白。該方法最大的優(yōu)勢是小分子化合物無需任何結構修飾，不影響化合物的生物活性。鑒于DARTS 實驗對于蛋白酶作用濃度及藥物濃度都有嚴格的要求，本實驗通過酶濃度和化合物濃度梯度實驗，確定了以0.03%的蛋白酶濃度和500 mmol·L-1的化合物濃度作為實驗的最終條件。

結果表明，丹參素鈉在HUVEC 細胞中可能的結合靶蛋白為CD44。CD44 是一種細胞表面跨膜糖蛋白，參與細胞的增殖、分化、遷移以及血管生成等多項生命活動[9]。研究表明，CD44 與心血管疾病密切相關。Yang LW 等[10]發(fā)現(xiàn)，小鼠CD44 缺乏可保護心臟抵抗血管緊張素Ⅱ誘導的心臟纖維化；Suleiman M等[11]報道，CD44-透明質(zhì)酸相互作用參與細胞外基質(zhì)重塑、組織纖維化和心力衰竭等過程。另外，大量研究發(fā)現(xiàn)，CD44 在許多癌細胞中都有異常表達，與癌癥的侵襲和轉移有著密切的聯(lián)系[12]。丹參素鈉可為CD44 小分子抗腫瘤抑制劑的設計提供新型骨架。

本實驗利用表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance，SPR）測定丹參素鈉與靶蛋白之間的結合常數(shù)為4.84×10-4mol·L-1，藥物與靶蛋白的結合能力較弱，有可能是該技術本身的局限性。SPR生物傳感器靈敏度較低，尤其當生物識別原件為分子量較大的膜蛋白（如CD44）、而被檢測的藥物分子量較小時，響應信號就會比較弱[13]。所以測得分子量小的丹參素鈉與靶蛋白膜蛋白CD44 之間的結合常數(shù)較小，并不代表丹參素鈉的靶蛋白不是CD44。丹參素鈉在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的直接結合靶蛋白為CD44，可能通過與CD44 蛋白結合并發(fā)揮心血管保護作用。后續(xù)需要在分子、細胞及整體動物水平上圍繞丹參素鈉對CD44 的生物學效應開展深入研究。