MTHFR 基因多態(tài)性與ALL 患兒MTX 血藥濃度及嚴重毒副反應的相關性研究*

杜小換，李 芳，朱增燕，周 密，王文娟，高 莉，劉 虎，王文靜，繆麗燕

蘇州大學附屬兒童醫(yī)院 1 藥劑科；2 血液科，蘇州 215025;3 蘇州大學附屬第一醫(yī)院 藥學部，蘇州 215006

大劑量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HDMTX）是兒童急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia，ALL）治療方案中的關鍵藥物之一。MTX 作為葉酸類似物進入細胞內，競爭性抑制二氫葉酸還原酶，阻斷二氫葉酸向四氫葉酸轉化，抑制腫瘤細胞的異常增殖[1]。然而，ALL 患兒在接受HD-MTX 化療后對MTX 的敏感性和耐受性出現一定的個體差異性，所產生的毒副反應導致后續(xù)療程中MTX 劑量的降低或治療的中斷，給ALL 患兒的預后造成不利影響。研究表明，遺傳變異可能是出現個體差異的原因[2]。

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是維持細胞內葉酸代謝和穩(wěn)態(tài)的關鍵酶，用于催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為蛋白質合成和核酸甲基化所需的5-甲基四氫葉酸。當MTHFR 酶活性發(fā)生改變時，葉酸轉化過程受損，細胞內葉酸代謝狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響機體對MTX 的耐受性[3]。已知MTHFR 基因編碼區(qū)存在多個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），其中C677T 和A1298C 是常見的MTHFR 基因多態(tài)性位點[4]。目前有關C677T 和A1298C 基因多態(tài)性對ALL 患兒接受HD-MTX 治療的影響及疾病發(fā)展的相關研究結果之間尚存爭議[5，6]。

現通過回顧性分析MTHFR C677T 和A1298C基因多態(tài)性對ALL 患兒接受HD-MTX 化療后的MTX 排泄延遲及血液學指標與肝臟嚴重毒副反應發(fā)生的影響，為臨床實施MTX 個體化用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2019 年7 月至2021 年7 月期間在蘇州大學附屬兒童醫(yī)院收治并接受HD-MTX 化療的77例ALL 患兒資料；疾病診斷標準參照《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第4 次修訂版）》”[7]。

1.2 方法

1.2.1 治療方案ALL 患兒的治療方案參照中國兒童腫瘤協(xié)作組《急性淋巴細胞白血病方案（CCCGALL-2015 或2020 方案）》，即予HD-MTX 加亞葉酸鈣（calcium folinate，CF）沖擊治療。低危與中、高危患者MTX 的使用劑量分別為3 g·m-2與5 g·m-2。HDMTX 用藥方式為24 h 持續(xù)靜脈滴注，首先在0.5 h內給予負荷劑量（總劑量的10%），余量隨后于23.5 h內持續(xù)勻速滴注?；颊呔邮? 次HD-MTX 化療，常規(guī)監(jiān)測每次MTX 輸注開始后16、44、66 h 的血藥濃度，部分患者同時監(jiān)測20 h 和＞68 h 的血藥濃度。在MTX 輸注42 h 后開始CF 解救治療，每6 h 重復一次，共給藥3 次。CF 劑量為15 mg·m-2（中、高危）或10 mg·m-2（低危）。然后根據MTX 44 h 血藥濃度結果進行調整，MTX 44 h 血藥濃度＞1.0 μmol·L-1者增加CF 劑量并持續(xù)至MTX 低于毒性閾值。如果患者出現明顯早期毒性表現，CF 解救提前到36 h。同時對患兒口腔黏膜、胃腸道及重要臟器進行保護，治療期間監(jiān)測血象、肝腎功能、水化、堿化尿液等。

1.2.2 觀察指標

①MTX 44 h 血藥濃度：分別于MTX 輸注后不同時間點采集患兒外周靜脈血2 mL 左右，應用全自動生化分析儀Viva-E（西門子公司）進行MTX 血藥濃度檢測。當MTX44～48 h 的血藥濃度＞1.0 μmol·L-1時，考慮存在MTX 排泄延遲，需要增加CF 解救劑量，因此本研究主要以MTX 輸注后44 h 的血藥濃度為觀察指標。

②嚴重毒副反應指標：在HD-MTX 化療前后及化療過程中常規(guī)監(jiān)測患兒血象、肝腎功能等。本研究主要觀察血液學毒性和肝功能損害情況。血液學毒性指標含白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血小板減少計數和血紅蛋白（貧血）降低；肝損情況根據谷丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶的指標判斷。按照美國國家癌癥研究所常見不良事件評價標準（CTCAE5.0 版），對記錄的毒副反應指標按照嚴重程度進行分級。任何一項指標分級≥Ⅱ級時被認為發(fā)生與MTX 化療相關的嚴重毒副反應。收集每位患者每次MTX 療程后所發(fā)生的毒副反應情況。

1.2.3 MTHFR 基因多態(tài)性檢測采用微量熒光檢測儀Fluotec48E（西安天隆科技公司）和測序反應試劑盒（北京華夏時代基因科技公司）分別對MTHFR C677T 和A1298C 兩個位點作基因分型定性檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

以SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數據處理。采用χ2檢驗分析患兒臨床特征（性別、年齡、體重）與MTHFR C677T 和A1298C 基因型分布的相關性；采用χ2檢驗比較MTHFR 各基因型與MTX 44 h 血藥濃度間的相關性；采用非條件Logistic 回歸模型進行多因素分析，計算比值比（OR 值）及其95%置信區(qū)間（95%CI），評估MTHFR 基因多態(tài)性與HD-MTX 化療后各嚴重毒副反應發(fā)生之間的相關性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料與MTHFR 基因型分布情況

本研究共納入ALL 患兒77 例，男性43 例（占55.84%），女性34 例（占44.16%）。中位年齡5.1 歲（1.0～16.5 歲），中位體重18.0kg（9.5～43.0kg）。MTHFR C677T 基因型分布頻率為CC 型19 例（占24.68%）、CT 型44 例（占57.14%）和TT 型14 例（占18.18%）；MTHFR A1298C 基因型分布頻率中以AA 型多見、共56 例（占72.73%），AC 型21 例（占27.27%），無純和突變基因型（CC 型）。經χ2檢驗顯示，患兒人群的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05）?；純旱男詣e、年齡、體重等臨床特征在MTHFR C677T 和A1298C 基因型分布頻率上均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 MTHFR 基因型與MTX 44 h 血藥濃度的相關性

本研究中77 例ALL 患兒經過4 次HD-MTX化療后，計308 例次MTX 44 h 血藥濃度的分析結果顯示，發(fā)生MTX 排泄延遲的共計65 例次（占21.10%）。經χ2檢驗顯示，MTHFR C677T 和MTHFR A1298C 基因多態(tài)性與MTX 44 h 血藥濃度之間無顯著相關性（P＞0.05），見表1。

表1 MTHFR C677T 和A1298C 基因多態(tài)性與MTX 44 h 血藥濃度之間的相關性[n（%）]

2.3 MTHFR 基因多態(tài)性與嚴重毒副反應的相關性

經統(tǒng)計，77 例患兒在接受每次MTX 療程后，發(fā)生Ⅱ級以上血小板減少的僅有2 例，故未納入分析。發(fā)生其他Ⅱ級以上嚴重毒副反應的共計904 例次（占58.7%），其中發(fā)生白細胞減少225 例次（占73.05%）、中性粒細胞減少194 例次（占62.99%）、淋巴細胞減少197 例次（占63.97%）、血紅蛋白降低171 例次（占55.51%）；發(fā)生肝功能損害為117 例次（占37.99%）。經性別、年齡以及MTX 劑量校正后的Logistic 回歸模型評估結果顯示，MTHFR A1298C位點雜合突變型（AC 型）發(fā)生血紅蛋白減少的風險是野生型（AA 型）的2.52 倍（P=0.002），MTHFR A1298C 基因位點突變與其他各毒副反應之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MTHFR C677T 基因多態(tài)性與MTX 化療后各嚴重毒副反應之間的差異均無 統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 MTHFR C677T 和A1298C 基因多態(tài)性與嚴重毒副反應之間的相關性（例次）

3 討論

ALL 是兒童常見的惡性血液系統(tǒng)疾病之一，HD-MTX 在ALL 患兒化療方案中發(fā)揮著重要的作用。由于MTX 藥動學、藥效學以及毒副反應在不同個體間存在顯著差異性，MTX 血藥濃度監(jiān)測是預測MTX 化療后的量效關系以及毒副反應的必要手段。研究表明，藥物代謝酶及其靶點的基因多態(tài)性可能會影響ALL 患兒對于MTX 化療的敏感性和耐受性，因此MTX 代謝酶基因型的檢測對于提高MTX治療效果、降低毒副反應具有重要的臨床意義[8]。

體外MTHFR 酶活性的研究表明，當MTHFR C677T 基因型為CT 和TT 型時，MTHFR 酶活性分別為CC 型的60%和30%[9]，酶活性的降低將可能造成機體對MTX 的代謝能力的減弱，從而發(fā)生代謝延遲。Haase R 等[1]的研究表明，MTHFR 677CC 型患者MTX 42 h 和54 h 血藥濃度均值顯著高于CT/TT 型患者，而MTHFR A1298C 位點突變與否與MTX 血藥濃度之間未觀察到差異性。在本研究中，MTX 化療后44 h 的血藥濃度與MTHFR C677T、A1298C 各基因型之間均未觀察到統(tǒng)計學差異，這也與其他ALL患兒群體的研究結論一致[1，10]。提示MTHFR C677T、A1298C 基因多態(tài)性可能與MTX 代謝延遲之間不存在相關性。有研究顯示，除了遺傳變異的影響，MTX代謝延遲也可能受到患者的生理狀態(tài)、藥物相互作用的影響[11]。另外，需要考慮的是，當部分患者出現MTX 早期中毒表現時，臨床醫(yī)生將提前給予患者CF 解救，這一措施將有利于減少MTX 排泄延遲的發(fā)生。在后續(xù)的研究中，還將注意將患者是否提前接受CF 解救這一可能的影響因素納入分析中。

有研究表明，由于MTHFR酶活性的降低，MTX化療相關毒性發(fā)生風險可能增加[12]。如Aráoz HV等[5]在阿根廷ALL 患兒中發(fā)現，MTX 給藥劑量2 g·m-2·d-1的情況下，當患兒攜帶至少一個677T 等位基因時，發(fā)生嚴重白細胞和中性粒細胞減少的風險增加，而Haase R 等[1]的研究則顯示，C677T 突變基因型與嚴重貧血和白細胞減少負相關；當A1298C基因出現純和突變時，嚴重貧血的發(fā)生率增加；但Fukushima H 等[13]的研究卻有相反結論。Meta[14]分析表明，MTHFR C677T 突變型與嚴重血液毒性或骨髓抑制正相關；A1298C 突變型則與更低毒性事件風險相關?？梢姡壳瓣P于MTHFR C677T 和A1298C 基因多態(tài)性與MTX 化療后各毒副反應之間的相關性、國內外各項研究結果之間尚存在著爭議性。在本研究中，未能觀察到MTHFR C677T 基因多態(tài)性與ALL 患兒MTX 化療后嚴重毒副反應之間的相關性，這與鄭明霞等[15]的研究一致。當MTHFR A1298C 發(fā)生雜合突變時，血紅蛋白減少的發(fā)生風險較未突變型顯著增加。不同研究群體之間的種族差異、樣本量的大小、患者的基礎疾病及葉酸狀態(tài)、MTX 用藥劑量以及后續(xù)劑量的調整、方案中的其他化療藥物的影響以及毒副反應的判定標準不同等，均可能是各研究結論存在爭議的原因[6]。

此外，MTX 血藥濃度水平及毒性也與MTX 轉運體多態(tài)性相關，如SLC19A1、SLCO1B1、ABCC2 或ABCC4 等[16]。由此可見，MTX 代謝相關的遺傳變異因素對于ALL 患兒實施MTX 個體化治療過程的作用尚有待更深入和更大樣本量的研究。