口疳散穴位貼敷的制備工藝及體外透皮吸收研究*

李 清，周秋娟，瞿發(fā)林**，陳 穎，董文遷，樓欣譽(yù)

1 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院，常州 213003；2 常州市武進(jìn)區(qū)中西結(jié)合醫(yī)院，常州 213003；3 常州衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，常州 213003

口疳散穴位貼敷為本院中醫(yī)師自擬方，方中吳茱萸、細(xì)辛、生大黃、川黃連、肉桂研粉、以醋調(diào)勻，搓制成直徑1 cm 左右藥球，貼于雙足底涌泉穴，夜敷晝?nèi)ィ灾慰诏彲熜э@著。其中吳茱萸、細(xì)辛、肉桂為溫里藥，滋陰降火，導(dǎo)熱下行；大黃、黃連味苦性寒，清熱瀉火，用于上焦實(shí)火去炎。吳茱萸在本方中占比最大，其所含的主要成分是以吳茱萸堿為代表的生物堿類[1]，具有一定的透皮吸收性[2]。故本研究以吳茱萸堿為指標(biāo)成分，對(duì)不同制備工藝的口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的透皮吸收效果進(jìn)行比較，為穴位貼敷制備工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

TP-2A 型智能藥物透皮儀（河南佰澤儀器設(shè)備有限公司）；Waters2467 高效液相色譜儀（515 HPLC Pump 泵，Waters CapLC2487 雙λ 吸光度檢測器，Empower2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters 公司）；FA1004型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

吳茱萸堿對(duì)照品（南京世洲生物科技有限公司，純度：98%，批號(hào)：201901WZYJ）；大黃（批號(hào)：180923）、黃連片（批號(hào)：181221）、肉桂（批號(hào)：180807）、制吳茱萸（批號(hào)：181118）、細(xì)辛（批號(hào)：181118），均購自江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司；聚乙二醇400（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190806）；月桂氮卓酮（湖北科捷制藥有限公司，批號(hào)：181103）；甲醇為色譜純；白醋、生理鹽水為市售品；乙腈為色譜純；乙醇為藥用級(jí)；水為純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)BALB/c 小鼠10 只，雄性，質(zhì)量（20±2）g（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18（150×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（50∶50）；檢測波長：225 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液精密稱取吳茱萸堿對(duì)照品4.85 mg，置50 mL 量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，即得吳茱萸堿對(duì)照品儲(chǔ)備液（95.06 μg·mL-1）；取該溶按一定比例甲醇稀釋得對(duì)照品溶液。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)溶液①供試品透皮接收溶液：生理鹽水-乙醇-聚乙二醇400（6∶3∶1）；②透皮吸收樣液：在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)從接受池中精密取樣1.0mL，用0.45μm的濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液；③皮膚滯留藥物樣液：24 h 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將皮膚取出，用新鮮接收液清洗表面殘留物，再用生理鹽水清洗干凈，用濾紙將其吸干，把有效滲透皮膚剪下并將其剪碎，加入1.0 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取2 次，每次30 min，用甲醇補(bǔ)足失重后取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，即得。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)使用的藥材粉末分為兩種：一種是100目普通粉；另一種是500 目超微粉。實(shí)驗(yàn)共分為7組。超微粉與普通組：分別將藥材的超微粉或普通粉按處方比例混勻后，加入適量的白醋調(diào)和成糊狀；水調(diào)和組：將藥材的超微粉按處方比例混勻后，加入適量的純化水調(diào)和成糊狀；不同比例氮酮組：將藥材的超微粉按處方比例混勻后，分別加入不同濃度氮酮（1%、3%、5%），加入適量的白醋調(diào)和成糊狀；陰性對(duì)照組：不含吳茱萸藥材的超微粉，按處方比例混勻，加適量白醋調(diào)和成糊狀。

2.4 專屬性考察

分別將對(duì)照品溶液、供試品透皮接收溶液和陰性樣品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，吳茱萸堿與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，陰性樣品溶液對(duì)測定無干擾，該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 吳茱萸堿的HPLC 圖

2.5 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品貯備液按一定比例甲醇稀釋，得濃度分別為95.06、9.51、1.90、0.19、0.04、0.02 μg·mL-1系列對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：

Y=225 769X+51 885，r=0.999 9；表明吳茱萸堿在0.02～95.06 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.00%，表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一時(shí)間的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、3、6、9、12、18、24 h 進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算RSD 為1.68%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取適量空白透皮接收液6 份，分別加入適量的吳茱萸堿對(duì)照品溶液，混勻后用0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率為98.40%，RSD 為1.79%。

2.9 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)

2.9.1 離體鼠皮的制備將健康裸鼠脫臼處死后，小心剝離腹部皮膚；去除脂肪以及皮下組織，用生理鹽水洗凈，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存[3]，使用前自然解凍，生理鹽水浸泡30 min，濾紙吸干后備用。

2.9.2 實(shí)驗(yàn)過程采用改良Franz 擴(kuò)散池為透皮擴(kuò)散裝置：接受池體積為18 mL，接受面積為1.23 cm2，接受液為生理鹽水-乙醇-聚乙二醇400（6∶3∶1）。取3 份已經(jīng)處理好的裸鼠皮膚，裁剪成適當(dāng)大小，固定于接受池與供給池之間，皮膚角質(zhì)層面向供給池。在接受池中注滿接受液，轉(zhuǎn)速300 r·min-1，水浴溫度為（37±1）℃，排盡氣泡，平衡0.5 h。然后在供給池中分別加入0.65 g 按處方調(diào)制好的糊狀樣品并取不透光的紙箱，蓋住透皮擴(kuò)散裝置，以達(dá)到避光效果。在1、2、4、8、12、24 h 從接收池中取樣1 mL，同時(shí)加入1 mL 的新鮮等溫接受液。將取出的溶液用0.45 μm的濾膜過濾，取續(xù)濾液，即供試品透皮接受溶液。24 h 之后，將皮膚小心拿下，依據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下的方法完成皮膚滯留藥物樣品。將之前得到的供試品透皮接受溶液以及后續(xù)制作的滯留藥物樣品，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行吳茱萸堿的含量測定，并計(jì)算其累積透皮量[4]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥物的累積透皮量Qn可通過式（1）進(jìn)行計(jì)算：

Cn為第n 個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；Ci為第i 個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V 為接受液體積；Vi為取樣體積；S 為有效滲透面積[5]。以藥物的Qn（μg·cm-2）對(duì)取樣時(shí)間t（h）作曲線，并通過公式（2）對(duì)曲線中直線部分進(jìn)行線性回歸，求得直線斜率，即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js（μg·cm-2·h-1）。

皮膚的藥物滯留量Qs（μg·cm-2）可按式（3）計(jì)算[6]：

A 為有效面積，V 為提取液的體積，C 為得到的藥物質(zhì)量濃度。

不同制備工藝的口疳散穴位貼敷，在體外透皮實(shí)驗(yàn)的接收液中均檢測到了吳茱萸堿成分，各組吳茱萸堿的24 h 累積透皮量（Q24）如圖2 所示，其中超微粉組（5.43±0.17）μg·cm-2與普通粉組（3.71±0.10）μg·cm-2相比較，吳茱萸堿的Q24顯著性增加（P＜0.01）；水調(diào)和組（3.22±0.22）μg·cm-2與超微粉組相比，吳茱萸堿的Q24減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義（P＜0.001）；而加入了促透皮吸收劑氮酮的3 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與超微粉組相比較，只有3%氮酮組（6.35±0.52）μg·cm-2的吳茱萸堿Q24增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各組的吳茱萸堿體外透皮吸收曲線、Q-t 擬合曲線和穩(wěn)態(tài)透皮速率Js分別見圖3 和表1。

表1 口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的體外透皮吸收Q-t 擬合曲線和穩(wěn)態(tài)透皮速率Js

圖2 口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的24 h 體外累積透皮量（，n=3）

圖3 口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的體外透皮吸收曲線

皮膚滯留量的檢測結(jié)果見圖4。吳茱萸堿的Qs在普通粉組（0.55±0.06）μg·cm-2與超微粉組（0.60±0.12）μg·cm-2相比較，無明顯差異；水調(diào)和組（0.25±0.08）μg·cm-2與超微粉組相比，吳茱萸堿的Qs出現(xiàn)顯著性減少（P＜0.05）；而加入了促透皮吸收劑氮酮的3 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與超微粉組相比較，只有5%氮酮組（0.31±0.07）μg·cm-2的吳茱萸堿Qs有明顯減少（P＜0.05），1%組（0.54±0.15）μg·cm-2和3%組（0.69±0.02）μg·cm-2均無顯著性差異。

圖4 疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的皮膚滯留量（，n=3）

4 討論

穴位貼敷療法既可以刺激穴位，又可以通過有效成分的透皮吸收而發(fā)揮顯著的藥理作用，因此具有較好的治療效果[7]。將口疳散穴位貼敷粘貼到足底涌泉穴，通過上病下治的機(jī)理，以達(dá)到治療口瘡病的目的。上病下治法是以中醫(yī)的整體觀念為前提，將疾病的病因病機(jī)、臟腑經(jīng)絡(luò)辨證以及氣機(jī)升降調(diào)節(jié)相結(jié)合而確立的治療原則，辨證論治、治病求本[8]。

通過透皮吸收實(shí)驗(yàn)，測定不同制備工藝的口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿透皮吸收量，從而對(duì)其制備工藝進(jìn)行研究。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，未能在接收液中成功檢測到吳茱萸堿，分析原因可能是透皮后的吳茱萸堿不穩(wěn)定，對(duì)光敏感，易被破壞，故在正式試驗(yàn)的全過程中采用避光處理，從而準(zhǔn)確測得接收液中吳茱萸堿的含量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，藥材飲片經(jīng)過超微粉碎后，粒徑約為25 μm 與粒徑為150～200 μm 普通粉碎的藥材相比，其制得的口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿Q24顯著性增加。分別使用醋和水調(diào)和超微粉、其配制的穴位貼敷中吳茱萸堿Q24也出現(xiàn)顯著性差異，醋調(diào)和組的吳茱萸堿Q24要明顯高于水調(diào)和組，表明醋對(duì)于口疳散穴位貼敷的療效發(fā)揮了重要作用。另外，兩者皮膚滯留量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醋調(diào)和組的吳茱萸堿皮膚滯留量也明顯高于水調(diào)和組?？赡苁且?yàn)榇着c藥材中的吳茱萸堿等有效成分結(jié)合形成鹽，不僅使溶解度增加，使其從藥材中游離出來，且組成帶正電荷水溶液，更易于透過皮膚[9]。本研究還對(duì)促透皮吸收劑用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（1%、3%、5%氮酮），探討其對(duì)體外透皮吸收的影響，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，只有3%氮酮的吳茱萸堿Q24出現(xiàn)顯著性增加，5%氮酮的吳茱萸堿Q24以及皮膚滯留量甚至比不加入促透皮吸收劑還低?？梢娂尤脒m量促透皮吸收劑對(duì)貼敷的體外吸收有一定的促進(jìn)作用；但若用量過多，其透皮效果適得其反。考慮到醋酸能促進(jìn)口疳散穴位貼敷有效成分的透皮吸收作用，宜優(yōu)先選擇酸性的促透皮吸收劑，如油酸。在本研究中，探討了不同制備工藝對(duì)口疳散穴位貼敷中的吳茱萸堿透皮吸收的影響，為進(jìn)一步開發(fā)該制劑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。