基于生物信息學(xué)探討植物擬南芥的UV-B輻射保護(hù)機(jī)制

萬 莎，付蘇宏，郝豆豆，施靜，張勇群

(西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

太陽光對(duì)于植物來說是非常重要的物質(zhì)，不僅提供其光合作用的能量來源，更是調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境信號(hào)，例如調(diào)節(jié)種子發(fā)芽和開花等.紫外線(ultraviolet, UV)是太陽光的組成部分，根據(jù)其波長(zhǎng)主要可分為UV-A (315-400 nm)、UV-B (280-315 nm)和UV-C (<280 nm).UV-C和大部分的UV-B在經(jīng)過地球的臭氧層時(shí)被吸收，只有UV-A和少部分的UV-B能到達(dá)地球表面.雖然只有< 0.5%的UV-B到達(dá)地面，但是其在日光光譜中的能量卻最高，對(duì)地球上的生物圈產(chǎn)生的影響最大，過量的UV-B射線會(huì)損害植物的光合作用過程[1]，以及引起DNA光解產(chǎn)物的生成從而造成細(xì)胞損傷，甚至?xí)苯訐p傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA[2-3].此外，UV-B的照射還會(huì)引起植物形態(tài)學(xué)上的改變，Str?mme等發(fā)現(xiàn)UV-B會(huì)影響白楊芽的定型以及延遲花蕾的定植[4]，Mark等曾報(bào)道增加UV-B照射會(huì)顯著降低歐洲玉米的高度[5]，Johanson等曾報(bào)道落葉性越橘屬植物的葉片厚度隨著UV-B照射的增加減小[6]，Jenkins等曾總結(jié)發(fā)現(xiàn)UV-B照射通常引起植物葉腋分支增多[7].

臭氧是UV-B主要的吸收物質(zhì)，隨著地球臭氧層被破壞，越來越多的UV-B到達(dá)地面，對(duì)地球上的天然植物系統(tǒng)造成影響[8].因此，探討UV-B對(duì)植物基因表達(dá)的影響從而了解植物對(duì)UV-B的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制則變得十分重要.GEO (gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)包含有多個(gè)物種的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，可從中檢索出與研究相關(guān)的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)分析從而挖掘出數(shù)據(jù)背后的深層含義.擬南芥是模式植物，挖掘擬南芥的相關(guān)數(shù)據(jù)可獲取植物UV-B保護(hù)機(jī)制的參考.本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選取GSE3533和GESE22951表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，通過差異基因篩選找出UV-B照射后表達(dá)改變的DEGs(differentially expressed genes)，并進(jìn)一步對(duì)DEGs進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，并進(jìn)行DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)分析(protein-protein network)，從中找出關(guān)鍵的DEGs編碼蛋白，進(jìn)而揭示植物受UV-B照射后的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制.本研究基于生物信息學(xué)的方法對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，為植物的UV-B應(yīng)激分子機(jī)制奠定了科學(xué)的研究基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

選取模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)為研究物種，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)生物技術(shù)中心GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載UV-B輻射相關(guān)的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為GSE3533[9]和GSE22951，測(cè)試平臺(tái)為GPL198，白光照射作為對(duì)照組，UV-B照射作為實(shí)驗(yàn)組，表達(dá)芯片數(shù)據(jù)的具體信息如表1所示.

表1 表達(dá)芯片數(shù)據(jù)詳細(xì)信息

1.2 差異表達(dá)基因(DEGs)篩選

采用在線軟件GEO2R( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/ ) 對(duì)GSE3533和GSE22951表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，將基因表達(dá)值倍數(shù)變化(fold change, FC)和錯(cuò)誤檢測(cè)率 (False discovery rate, FDR)作為評(píng)定指標(biāo)，使用 Benjamini - Hochberg 錯(cuò)誤檢測(cè)率 (FDR) 方法校正 P 值，校正后的 P 值 <0.05 和 |log2FC| ≥1作為篩選條件[10].利用R軟件分別繪制GSE3533和GSE22951表達(dá)芯片的表達(dá)火山圖.利用在線軟件Venny 2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進(jìn)行GSE3533和GSE22951表達(dá)芯片的交叉基因篩選，并繪制Venny圖.

1.3 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

GO可提供基因產(chǎn)物的功能信息以助于對(duì)基因能有更全面的認(rèn)識(shí)[11]，KEGG能系統(tǒng)地分析基因功能，揭示基因功能之間的生物聯(lián)系[12]，而DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integration Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)則可對(duì)一系列基因進(jìn)行功能解釋，實(shí)現(xiàn)基因列表的GO功能富集分析[13].利用DAVID在線軟件對(duì)篩選得到的DEGs做GO功能注釋富集分析，設(shè)定篩選條件為P<0.05，獲取DEGs富集的GO條目，利用R語言的ggplot2包對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化繪圖.DEGs的KEGG通路富集分析與可視化通過Cytoscape中的ClueGO插件實(shí)現(xiàn).

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將上述分析得到的上調(diào)的交叉DEGs和下調(diào)的交叉DEGs分別導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING (https://string-db.org/)中，構(gòu)建其編碼蛋白的相互作用關(guān)系，并利用本地軟件Cytoscape 3.6.1進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的可視化，根據(jù)degree值篩選出中心度較高的DEGs.

2 結(jié)果

2.1 DEGs鑒定

數(shù)據(jù)來源于GSE3533和GSE22951兩個(gè)表達(dá)芯片，分別選取其中6例樣本，3例經(jīng)白光照射作為對(duì)照組；另3例經(jīng)UV-B照射作為實(shí)驗(yàn)組.GSE3533和GSE22951所有檢測(cè)到的基因分別如圖1A和圖1B所示，分別篩選出2 741個(gè)和1 079個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因分別為1 535個(gè)和443個(gè)(a區(qū)域)，下調(diào)基因1 183個(gè)和630個(gè)(b區(qū)域).按表達(dá)上調(diào)和下調(diào)分別取GSE3533和GSE22951的交集，共鑒定到251個(gè)上調(diào)DEGs和246個(gè)下調(diào)DEGs (圖1C和D).

圖1 差異表達(dá)基因篩選

2.2 GO功能與KEGG通路富集分析

利用DAVID分別對(duì)251個(gè)上調(diào)的交叉DEGs和246個(gè)下調(diào)的交叉DEGs進(jìn)行GO功能富集分析.上調(diào)的DEGs共注釋到58個(gè)GO條目，前20的GO條目如圖2A所示，其中顯著性較高的有karrikin反應(yīng)、UV-B反應(yīng)、熱反應(yīng)、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶活性和類黃酮生物合成過程；下調(diào)的DEGs共注釋到46個(gè)GO條目，前20的GO條目如圖2B所示，其中顯著性較高的有胞外區(qū)、3-氧-花生四烯酸基-CoA合酶活性、3-氧-二十四烷?；?CoA合酶活性、3-氧-蠟基-CoA合酶活性、羧酸酯水解酶活性、細(xì)胞壁.

圖2 GO功能富集分析

采用Cytoscape的ClueGO插件對(duì)交叉DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示上調(diào)的交叉DEGs主要注釋到苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、植物-病原體相互作用和晝夜節(jié)律通路中(圖3A)；下調(diào)的交叉DEGs主要注釋到戊糖和葡萄糖醛酸互變異構(gòu)、脂肪酸延長(zhǎng)和吞噬體通路中(圖3B).

圖3 KEGG通路富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵基因篩選

為獲取DEGs編碼蛋白的相互作用關(guān)系，我們采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建交叉DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，每一條邊表示蛋白之間的相互作用，每一個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白，節(jié)點(diǎn)越大對(duì)應(yīng)其degree值越大，degree值越大的節(jié)點(diǎn)表明其對(duì)應(yīng)的蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的中心度較高，能與多個(gè)蛋白發(fā)生相互作用(圖4).上調(diào)的DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中總共包括219個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 080條邊，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，degree值前10%的關(guān)鍵基因?yàn)锳T5G25930、BCS1、BRL3、TOC64-V、MTHSC70-1、AT1G19020、SIGE、WRKY33、HSP70、MTHSC70-2、HSP90.1、NUDT7、AT5G24810、ATRPAC42、AT3G09440、HSP70-2、WRKY46、NRPA2、HSP81-2、F3H、CRK11，其中WRKY33注釋到植物-病原體相互作用通路中，HSP70、HSP90.1、AT3G09440、HSP70-2、HSP81-2注釋到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路中，F(xiàn)3H注釋到類黃酮生物合成通路中.下調(diào)的DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中總共包括153個(gè)節(jié)點(diǎn)，306條邊，degree值排前10%的關(guān)鍵基因?yàn)锳T3G49670、HTH、AT1G09750、AT4G23820、AT3G16370、CYP86A2、DRT100、PME44、SAUR68、GAE1、CER2、KCS10、AT3G20820、FLA8、SHY2，其中PME44注釋到戊糖和葡萄糖醛酸互變異構(gòu)通路中，KCS10注釋到脂肪酸延長(zhǎng)通路中.

3 討論

本研究基于生物信息學(xué)的分析手段，下載GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥的GSE3533和GSE22951兩個(gè)表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，旨在從中挖掘出與植物UV-B保護(hù)機(jī)制相關(guān)的基因表達(dá)信息.通過對(duì)GSE3533和GSE22951進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選并整合，總共得到251個(gè)上調(diào)DEGs和246個(gè)下調(diào)DEGs，對(duì)這些DEGs分別進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的DEGs注釋到karrikin反應(yīng)、UV-B反應(yīng)、熱反應(yīng)、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶活性和類黃酮生物合成過程等GO功能，以及苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、植物-病原體相互作用和晝夜節(jié)律KEGG通路中；下調(diào)的DEGs注釋到胞外區(qū)、3-氧-花生四烯酸基-CoA合酶活性、3-氧-二十四烷酰基-CoA合酶活性、3-氧-蠟基-CoA合酶活性、羧酸酯水解酶活性、細(xì)胞壁等GO功能，以及戊糖和葡萄糖醛酸互變異構(gòu)、脂肪酸延長(zhǎng)和吞噬體KEGG通路中.此外，PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明上調(diào)DEGs中關(guān)鍵基因主要與植物-病原體相互作用/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和類黃酮生物合成相關(guān)，下調(diào)DEGs中的關(guān)鍵基因則主要與戊糖和葡萄糖醛酸互變異構(gòu)和脂肪酸延長(zhǎng)通路相關(guān).

圖4 交叉DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of cross DEGs

太陽光中的UV-B作為非生物壓力信號(hào)會(huì)對(duì)植物造成多種影響，總的而言，植物對(duì)UV-B的反應(yīng)主要分為兩類：應(yīng)激反應(yīng)和光形態(tài)建成反應(yīng)，而反應(yīng)的類型主要取決于曝光率和植物是否已適應(yīng)所照射的UV-B[2].高UV-B曝光率照射引起植物體內(nèi)壓力相關(guān)的生理過程，例如DNA損傷、ROS (reactive oxygen species)生成、細(xì)胞過程損害等，然而調(diào)節(jié)這些反應(yīng)的信號(hào)通路在其他壓力中也存在，并不是UV-B所特異性[14]；低UV-B曝光率照射則引起植物體內(nèi)的光形態(tài)建成反應(yīng)，主要引起植物下胚軸生長(zhǎng)和子葉擴(kuò)張抑制、黃酮類和花青素類化合物生物合成、氣孔打開等，是UV-B照射所特異的植物反應(yīng)[15-16].研究表明，高海拔地區(qū)生長(zhǎng)的植物相較于低海拔地區(qū)生長(zhǎng)的植物來說擁有更強(qiáng)的UV-B耐受性，其主要原因在于高海拔植物體內(nèi)的類黃酮含量更高且具有更強(qiáng)的染色質(zhì)重構(gòu)能力[8, 17-18].F3H全名為黃烷酮3-羥化酶，催化黃烷酮羥化生成黃酮醇，進(jìn)一步合成花青素、原花色素以及各類黃酮醇衍生物[19-20]，F(xiàn)3H基因在UV組中表達(dá)上調(diào)，并且具有較高的degree值，即F3H在上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)有重要的位置，說明F3H是擬南芥UV-B保護(hù)重要的分子機(jī)制之一.AT5G25930是一類富含亮氨酸重復(fù)序列型受體蛋白激酶，在上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中位于中心度最高的位置，該類蛋白在抗逆性反應(yīng)、介導(dǎo)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用，與植物對(duì)應(yīng)答逆境脅迫以及形態(tài)相關(guān)[21-23].而在下調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中AT3G49670占據(jù)著最中心的位置，調(diào)控多數(shù)DEGs的表達(dá)，AT3G49670對(duì)植物的發(fā)育進(jìn)行調(diào)控[24-25].

通過對(duì)表達(dá)芯片數(shù)據(jù)GSE3533和GSE22951的挖掘與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)對(duì)UV-B脅迫時(shí)，擬南芥上調(diào)AT5G25930和F3H的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物形態(tài)的改變以及類黃酮類化合物的生物合成，可能與植物葉片變厚、葉柄變短、莖變短、腋窩分枝增多和根芽比改變有關(guān)[26]；另一方面，受到UV-B脅迫時(shí)擬南芥抑制AT3G49670的表達(dá)，引起擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制.本研究通過挖掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)得到3個(gè)關(guān)鍵基因：AT5G25930、F3H和AT3G49670，它們?cè)谥参锏腢V-B紫外線保護(hù)機(jī)制中扮演著重要的角色，為今后進(jìn)行深入的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ).