基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的壇紫菜甘油-3-磷酸脅迫響應(yīng)分析

唐欣怡 趙佳麗 陳娟娟,* 駱其君 陳海敏 楊 銳 張 鵬

(1 寧波大學(xué)，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211；2 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005)

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是中國(guó)東南部具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型藻類(lèi)之一，有很高的食用和藥用價(jià)值。壇紫菜不僅是一類(lèi)富含多種維生素和微量元素的海洋蔬菜，還富含可作為化工原料的藻膠等多種生理活性物質(zhì)[1-3]。壇紫菜生長(zhǎng)在環(huán)境條件變化多端的潮間帶，溫度、鹽度和光照強(qiáng)度急劇變化，隨著潮水的漲落每天經(jīng)歷周期性的干出與浸沒(méi)交替過(guò)程[4]。因此，為了適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，壇紫菜進(jìn)化出一系列的抗逆防御方式。

研究證實(shí)甘油-3-磷酸是植物防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)新的調(diào)控因子或信號(hào)分子[5-6]，是糖代謝和卡爾文循環(huán)代謝的重要中間物[7-8]。夏菲[9]發(fā)現(xiàn)甘油-3-磷酸參與了擬南芥非生物脅迫響應(yīng)，通過(guò)自身主動(dòng)調(diào)節(jié)甘油-3-磷酸合成水平，經(jīng)一系列酶作用轉(zhuǎn)化成甘油-3-磷酸，增強(qiáng)擬南芥對(duì)鹽及干旱的耐受性。此外，Qian等[10]發(fā)現(xiàn)壇紫菜在干出脅迫后，藻體內(nèi)紅藻糖苷含量顯著升高，以保護(hù)細(xì)胞免受脫水損傷的影響，同時(shí)其前體物質(zhì)甘油-3-磷酸合成相關(guān)的甘油激酶(NHO1)和3-磷酸甘油脫氫酶(GPDH)基因表達(dá)上調(diào)，表明甘油-3-磷酸可能參與了防御反應(yīng)。這一現(xiàn)象在壇紫菜經(jīng)鞭毛蛋白肽flg22和35℃高溫刺激試驗(yàn)中得到了證實(shí)，即甘油-3-磷酸的含量在脅迫中顯著升高，參與了防御響應(yīng)。由此可知，甘油-3-磷酸作為紅藻糖苷的合成前體，在處于復(fù)雜環(huán)境的壇紫菜抗逆機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[11-13]。

目前甘油-3-磷酸的下游物質(zhì)紅藻糖苷的抗逆作用已有較多研究[14-15]，而甘油-3-磷酸的合成積累與紅藻糖苷的含量變化密切相關(guān)。因此推測(cè)，其他不同脅迫條件可能均會(huì)引起甘油-3-磷酸的響應(yīng)，且甘油-3-磷酸在不同逆境下的不同響應(yīng)或許是紅藻糖苷差異性響應(yīng)的原因之一。然而，針對(duì)溫度、鹽度以及干出脅迫下，葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸含量變化以及和紅藻糖苷異構(gòu)體的含量變化關(guān)系還未被探討?；诖?，本研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，UPLC-MS)技術(shù)，建立起甘油-3-磷酸的定量方法，探究溫度、鹽度和干出脅迫條件下壇紫菜中甘油-3-磷酸的防御響應(yīng)變化規(guī)律，旨在為進(jìn)一步探究壇紫菜抗逆機(jī)制提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油-3-磷酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，北京翰隆達(dá)科技發(fā)展有限公司；甲醇(分析純)，上海國(guó)藥化工有限公司；甲醇和乙酸銨(色譜純)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；0.22 μm孔徑有機(jī)相針式濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)、C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美國(guó)Waters公司；FreeZone冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；Cascada II超純水系統(tǒng)，美國(guó)Pall公司；Precellys 24 Dual均質(zhì)儀，法國(guó)Bertin公司；GXZ-380智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，浙江優(yōu)納特科學(xué)儀器有限公司。

1.3 壇紫菜脅迫處理

對(duì)照組培養(yǎng)條件：將葉狀體置于鹽度25‰、溫度20℃、光照強(qiáng)度20 μmol·m-2·s-1、光暗比L∶D =12 h∶12 h的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。溫度脅迫組培養(yǎng)條件：將100 mg濕重的葉狀體放置于鹽度為25‰的滅菌海水(自然海水煮沸)中，分別放入溫度為12、18、23、25、28℃，光照強(qiáng)度為20 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，其中28℃條件下分別培養(yǎng)1、6、12、24、36、48、60和72 h。鹽度脅迫組培養(yǎng)條件：將100 mg濕重的葉狀體分別放置于鹽度為15‰、20‰、30‰、35‰、40‰、45‰、50‰、60‰、70‰、80‰的滅菌海水(使用海水晶NaCl調(diào)節(jié)鹽度)中，放入溫度為20℃、光照強(qiáng)度為20 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5、1和3 h。干出脅迫組培養(yǎng)條件：用濾紙輕輕吸干100 mg濕重葉狀體的表面水分，將其平鋪于滅菌培養(yǎng)皿中，放入溫度為20℃、光照強(qiáng)度為20 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、8、10和12 h?；謴?fù)組培養(yǎng)條件：待溫度、鹽度及干出脅迫后，將壇紫菜置于鹽度為25‰的滅菌海水中，放入溫度為20℃、光照強(qiáng)度為20 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)箱內(nèi)分別恢復(fù)1和3 h。

1.4 甘油-3-磷酸的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取濕重100 mg的壇紫菜葉狀體，置于2 mL勻漿管中，然后加入1 mL 80%甲醇與直徑為0.5 mm和3 mm的破碎珠，于均質(zhì)儀中提取(5 000 r·min-1， 30 s×3，10個(gè)循環(huán))。在完全破碎后進(jìn)行離心(5 000 r·min-1， 10 min)，取上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，得到甘油-3-磷酸提取物。

1.5 UPLC-MS條件

采用C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)作為固定相；以甲醇作為有機(jī)相(A)，純水作為水相(B)，洗脫梯度為：0～2 min，10%～30%A；2～4 min，30%～50%A；4～6 min，50%～70%A；6～8 min，70%～90%A；8～10 min，90%A。流速0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃。

采用電噴霧離子電源的負(fù)離子電離模式，毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓6V，脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流量為600 L·h-1，錐孔氣流量為50 L·h-1，碰撞氣采用氬氣(Ar)，碰撞氣流量0.15 mL·min-1。掃描采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式。甘油-3-磷酸離子通道和碰撞能量分別為m/z 171→m/z 96 (16 eV) 和m/z 171→m/z 78 (12 eV)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有的液質(zhì)數(shù)據(jù)處理、獲取和分析均由Masslynx (Waters，美國(guó))軟件處理。差異性分析中，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD，n=3)表示。利用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，組與組之間差異P<0.05時(shí)定義為差異顯著，P<0.01時(shí)定義為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘油-3-磷酸的定量方法建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 mg甘油-3-磷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于2 mL 50%(v/v)甲醇，過(guò)0.22 μm濾膜后，得到濃度為1 mg·mL-1的甘油-3-磷酸母液。將母液稀釋至1 μg·mL-1， 采用直接進(jìn)樣的方式將其注入電噴霧離子源(ESI)中，分別在正、負(fù)離子電離模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描，選擇離子響應(yīng)最強(qiáng)的負(fù)離子檢測(cè)模式進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。以該離子峰為母離子，施加碰撞能量進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息，然后優(yōu)化碰撞能量，當(dāng)定性離子和定量離子的離子峰強(qiáng)度達(dá)到最大值時(shí)即為最佳碰撞能量。此外，改變色譜柱、流動(dòng)相種類(lèi)和梯度比例等液相色譜條件，比較分離度、保留時(shí)間和峰形確定最終色譜條件。甘油-3-磷酸的總離子流圖如圖1所示。

圖1 甘油-3-磷酸的總離子流圖Fig.1 The total ionization chromatograms of glycerol-3-phosphate

2.2 方法評(píng)估

2.2.1 線性曲線 將濃度為1 mg·mL-1的甘油-3-磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至濃度0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg·mL-1， 平行進(jìn)樣3次，記錄峰面積與濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。結(jié)果顯示，甘油-3-磷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1 674.7x+11 992，R2=0.998 5，如表1所示。

圖2 甘油-3-磷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 The standard curve of glycerol-3-phosphate

表1 甘油-3-磷酸的日內(nèi)精密度和日間精密度Table 1 The day precision and inter-day precision of glycerol-3-phosphate

2.2.2 最低檢測(cè)限和最低定量限 將濃度為1 mg·mL-1的母液不斷稀釋后進(jìn)樣。當(dāng)色譜峰峰高與基線高之比即信噪比(S/N)為3和9時(shí)，對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢出限和定量限。結(jié)果顯示，當(dāng)S/N=3時(shí)，最低檢測(cè)限為4 ng·mL-1；當(dāng)S/N=9時(shí)，最低定量限為10 ng·mL-1， 表明本方法靈敏度較高。

2.2.3 穩(wěn)定性 為了驗(yàn)證儀器的穩(wěn)定性，采用日間精密度和日內(nèi)精密度進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。結(jié)果顯示，高、中、低濃度的甘油-3-磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.04、0.2和2 μg·mL-1)的日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值在1.6%～5.7%范圍內(nèi)，日間精密度在4.6%～7.1%范圍內(nèi)，表明本方法精密度良好。

2.2.4 回收率 為了驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程的準(zhǔn)確度，進(jìn)行了加標(biāo)回收率的計(jì)算。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg新鮮壇紫菜，加入1 mg甘油-3-磷酸標(biāo)準(zhǔn)品作為加標(biāo)樣品，以不添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的100 mg壇紫菜為空白樣品，各設(shè)3個(gè)平行。然后根據(jù)試驗(yàn)步驟1.4的提取方法進(jìn)行甘油-3-磷酸的提取，將最終提取物溶解于1 mL 50%(v/v)甲醇，過(guò)濾膜后注入樣品瓶，上機(jī)檢測(cè)含量并計(jì)算回收率?；厥章视?jì)算公式如下所示: 加標(biāo)回收率=(加標(biāo)樣品測(cè)定值-空白樣品測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%。結(jié)果顯示，壇紫菜中甘油-3-磷酸的加標(biāo)回收率為81.8%。

2.2.5 離子抑制率 為了考察復(fù)雜基質(zhì)對(duì)甘油-3-磷酸在質(zhì)譜中的離子化能力的影響，進(jìn)行了離子抑制率的計(jì)算。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg新鮮壇紫菜，根據(jù)1.4的方法提取甘油-3-磷酸后，溶解于1 mL 50%(v/v)甲醇。取800 μL復(fù)溶液，將其分為等體積的2份，在其中1份中加入1 mg甘油-3-磷酸作為加標(biāo)樣品，以不添加標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)溶液為空白樣品。過(guò)濾膜后注入樣品瓶，上機(jī)檢測(cè)甘油-3-磷酸含量并計(jì)算離子抑制率。離子抑制率的計(jì)算公式如下所示：離子抑制率=[1- (加標(biāo)樣品測(cè)定值-空白樣品測(cè)定值)/0.04]×100%。結(jié)果顯示，壇紫菜中甘油-3-磷酸離子抑制率為10.7%，說(shuō)明基質(zhì)對(duì)甘油-3-磷酸的離子抑制影響可以忽略。

綜上所述，該提取和檢測(cè)方法較全面地滿(mǎn)足了壇紫菜樣品中甘油-3-磷酸含量的測(cè)定要求。

2.3 脅迫條件對(duì)壇紫菜中甘油-3-磷酸含量影響

壇紫菜葉狀體經(jīng)12、18、23、25和28℃ 5個(gè)不同溫度脅迫1 h后，其甘油-3-磷酸含量的變化趨勢(shì)如圖3所示。相比于最佳培養(yǎng)溫度20℃，18℃培養(yǎng)下葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸含量無(wú)明顯變化，但是在培養(yǎng)溫度降至12℃時(shí)，甘油-3-磷酸含量顯著下降，為對(duì)照組的0.67倍(P<0.05)。在23、25和28℃溫度下培養(yǎng)，其含量分別為對(duì)照組的1.17倍、1.63倍和1.90倍(P<0.05)。隨著脅迫溫度從12℃增加至28℃，甘油-3-磷酸的含量持續(xù)增加。在不同溫度脅迫1 h后，將壇紫菜葉狀體重新置于20℃的正常培養(yǎng)條件進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)1 h和3 h。結(jié)果顯示，12℃刺激后的葉狀體在恢復(fù)1 h內(nèi)其甘油-3-磷酸含量下降，為對(duì)照組的0.43倍(P<0.05)，但在恢復(fù)3 h后含量開(kāi)始回升，但仍低于對(duì)照組水平，為對(duì)照組的0.68倍(P<0.05)。而高溫刺激后的葉狀體中甘油-3-磷酸含量在恢復(fù)培養(yǎng)過(guò)程中不斷下降，漸漸趨于對(duì)照組水平。

注：A：不同溫度脅迫和恢復(fù)條件下甘油-3-磷酸含量變化； B：28℃脅迫不同時(shí)間條件下甘油-3-磷酸含量變化； CK：對(duì)照組； -1 h: 脅迫1 h組；1 h: 脅迫后恢復(fù)1 h組；3 h: 脅迫后恢復(fù)3 h組；* 表示不同溫度和恢復(fù)時(shí)間下的差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: The contents of glycerol-3-phosphate under different temperature stress and recovery process. B: The contents of glycerol-3-phosphate under 28℃ for different time. CK: Control group. -1 h: Stress for 1 h. 1 h: Recovery culture for 1 h after stress. 3 h: Recovery culture for 3 h after stress.* mean significant difference at 0.05 level. The same as following.圖3 溫度脅迫后的壇紫菜葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸的含量變化Fig.3 The contents of glycerol-3-phosphase in thallus of P. haitanensis under different temperature stress

在28℃脅迫不同時(shí)間的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少，在脅迫36 h時(shí)，含量達(dá)到最大值，為對(duì)照組的2.35倍(P<0.05)，繼續(xù)延長(zhǎng)脅迫時(shí)間(36～72 h)，甘油-3-磷酸含量略有下降，但仍顯著高于對(duì)照組。

圖4為葉狀體在鹽脅迫下的甘油-3-磷酸含量變化情況。結(jié)果表明，當(dāng)鹽度在15‰～80‰范圍內(nèi)，葉狀體中甘油-3-磷酸含量均上升。當(dāng)鹽度為15‰時(shí)，脅迫3 h， 甘油-3-磷酸含量積累幅度最小，為對(duì)照組的1.09倍。當(dāng)鹽度高于30‰，甘油-3-磷酸含量顯著升高，且保持高水平的平穩(wěn)狀態(tài)；其中在鹽度為40‰時(shí)，脅迫3 h，甘油-3-磷酸含量達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.74倍。而后將其置于正常鹽度(25‰)下進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，結(jié)果顯示葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸的含量均下降，逐步恢復(fù)到近對(duì)照組水平。其中，低鹽脅迫(15‰和20‰)組的葉狀體在恢復(fù)培養(yǎng)1 h后的甘油-3-磷酸含量下降至對(duì)照組水平，而高鹽脅迫組(30～80‰)葉狀體在恢復(fù)培養(yǎng)3 h后的甘油-3-磷酸含量依然明顯高于對(duì)照組水平?？傮w而言，甘油-3-磷酸含量在高低鹽脅迫下均上升，且高鹽下的積累量大于低鹽。此外，與脅迫組相比，恢復(fù)1 h組和3 h組的甘油-3-磷酸含量整體呈下降趨勢(shì)，其中鹽度30‰～45‰脅迫組，恢復(fù)3 h組的甘油-3-磷酸含量略高于恢復(fù)1 h組，但仍低于對(duì)應(yīng)的脅迫組，這可能是組別差異造成的?？傊?，脅迫鹽度越高，葉狀體在恢復(fù)期的甘油-3-磷酸含量下降得越快，逐漸接近于對(duì)照組水平。

注：CK：對(duì)照組； -3 h: 不同鹽度脅迫3 h組；1 h: 不同鹽度脅迫后進(jìn)行恢復(fù)1 h組；3 h: 不同鹽度脅迫后進(jìn)行3 h組。Note: CK: Control group. -3 h: Different salinity stresses for 3 h. 1 h: Recovery culture for 1 h after salinity stress. 3 h: Recovery culture for 3 h after salinity stress.圖4 鹽度脅迫后壇紫菜葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸含量Fig.4 The contents of glycerol-3-phosphate in thallus of P. haitanensis under salinity stress

干出脅迫下，葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸的含量變化如圖5-A所示，短時(shí)間1 h的干出刺激后甘油-3-磷酸含量顯著上升，為對(duì)照組的1.19倍。隨著干出時(shí)間繼續(xù)增加，甘油-3-磷酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在干出6 h時(shí)，甘油-3-磷酸含量為對(duì)照組的0.89倍，而后趨于穩(wěn)定。將干出6 h后的葉狀體置于海水中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)(圖5-B)，結(jié)果顯示，甘油-3-磷酸含量在恢復(fù)1 h時(shí)顯著增加，達(dá)到對(duì)照組的1.23倍；而在恢復(fù)3 h時(shí)，其含量基本下降至對(duì)照組水平。

注：A: 不同干出脅迫時(shí)間下的甘油-3-磷酸含量變化； B: 干出脅迫6 h后恢復(fù)培養(yǎng)1 h和3 h后的甘油-3-磷酸含量變化。Note: A: The content changes of glycerol-3-phosphate under different desiccate time. B: The content changes of G3P under recovery culture for 1 and 3 h after 6 h desiccation stress.圖5 干出脅迫后壇紫菜葉狀體內(nèi)甘油-3-磷酸的含量Fig.5 The contents of glycerol-3-phosphate in thallus of P. haitanensis under desiccation stress

3 討論

甘油-3-磷酸已被證實(shí)是植物防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)新的調(diào)控因子或信號(hào)分子，在病原等生物脅迫防御中，甘油-3-磷酸是植物廣譜免疫的重要誘導(dǎo)物，是觸發(fā)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵物質(zhì)。已有研究在擬南芥和大豆作物中發(fā)現(xiàn)甘油-3-磷酸可引發(fā)植物系統(tǒng)獲得性抗性，且效應(yīng)與甘油-3-磷酸傳輸?shù)街参锬┒私M織的時(shí)間相關(guān)[14-15]。在非生物脅迫防御方面，Adler等[18]、陸信曜等[19]、Konte等[20]陸續(xù)進(jìn)行鹽脅迫下的酵母胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)可通過(guò)高滲透壓甘油(high osmolarity glycerol，HOG)途徑實(shí)現(xiàn)甘油調(diào)節(jié)酵母菌滲透壓的重要作用，促使?jié)B透壓穩(wěn)定。甘油作為甘油-3-磷酸的代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)通過(guò)甘油磷酸酶的水解作用而產(chǎn)生。因此，可通過(guò)對(duì)甘油-3-磷酸的調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)甘油水平，以應(yīng)對(duì)外界滲透壓的變化[6]。此外，甘油與尿苷二磷酸半乳糖(uridine diphosphate galactose，UDP-Gal)在紅藻糖苷合成酶和紅藻糖苷磷酸酶的作用下可生成紅藻糖苷異構(gòu)體，作為小分子化合物發(fā)揮調(diào)節(jié)滲透壓和抗氧化損傷等作用[21-22]。

壇紫菜處于水溫劇烈變化的環(huán)境中，20℃為其最適生長(zhǎng)溫度。而壇紫菜葉狀體在18℃條件下其甘油-3-磷酸含量無(wú)明顯變化，說(shuō)明18℃仍是壇紫菜的適應(yīng)溫度。陳偉洲等[23]也發(fā)現(xiàn)在17℃培養(yǎng)溫度下，壇紫菜的生長(zhǎng)速率、光合色素及超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)活性均未受到影響，說(shuō)明葉狀體完全能適應(yīng)18℃條件。高溫引起細(xì)胞膜破壞和胞質(zhì)外流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓失衡[24]，甚至細(xì)胞壁損壞，而紅藻糖苷可作為滲透壓調(diào)節(jié)物和細(xì)胞壁合成物提高細(xì)胞的抗高溫脅迫能力[14]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示壇紫菜在35℃高溫脅迫30 min下紅藻糖苷含量略下降，而在恢復(fù)過(guò)程中逐漸升高至對(duì)照組近2倍[15]。Sun等[12]也發(fā)現(xiàn)35℃高溫脅迫30 min后，紅藻糖苷合成酶基因表達(dá)顯著上調(diào)，由此證明高溫脅迫下壇紫菜急需大量紅藻糖苷參與防御。甘油-3-磷酸是紅藻糖苷異構(gòu)體的合成前體之一，甘油相關(guān)合成基因Phnho1和Phgpdh的表達(dá)量在35℃高溫脅迫下顯著升高，與本研究結(jié)果中甘油-3-磷酸出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象相一致，即甘油-3-磷酸含量與溫度、時(shí)間呈正相關(guān)，該現(xiàn)象可以解釋為，溫度脅迫后壇紫菜迅速合成前體物甘油-3-磷酸，以促進(jìn)紅藻糖苷的大量合成。而培養(yǎng)溫度低于18℃則無(wú)法激活甚至抑制藻體的甘油-3-磷酸合成途徑，因此藻體內(nèi)原有的甘油-3-磷酸迅速被消耗，用于合成異紅藻糖苷。

鹽度脅迫中也發(fā)現(xiàn)紅藻糖苷合成酶活性直線升高，水解酶α-半乳糖甘酶活性降低，使得作為相溶性物質(zhì)的紅藻糖苷大量累積，其目的是調(diào)節(jié)滲透壓并保護(hù)細(xì)胞內(nèi)大分子和細(xì)胞膜[25-27]。Sun等[12]研究發(fā)現(xiàn)紅藻糖苷合成酶基因PhTPS在1 400 mmol·L-1NaCl脅迫下顯著升高2倍以上，同時(shí)紅藻糖苷異構(gòu)體含量增加。在低鹽12‰和22‰脅迫下，紅藻糖苷含量分別降低8倍和2.5倍[28-30]。本試驗(yàn)中也有所發(fā)現(xiàn)，甘油-3-磷酸作為紅藻糖苷的前體物質(zhì)，其在壇紫菜體內(nèi)的含量隨著鹽度(15‰～80‰)的增加而顯著上升，最高達(dá)到對(duì)照組的1.74倍；且當(dāng)鹽度高于30‰時(shí)，甘油-3-磷酸累積量大于在低鹽脅迫條件下的累積量。這可能是由于壇紫菜為了發(fā)揮在鹽度脅迫下的滲透壓調(diào)節(jié)作用，可溶性糖紅藻糖苷會(huì)出現(xiàn)不同程度的水解；為了滿(mǎn)足紅藻糖苷的含量需求，壇紫菜需要快速合成其前體物甘油-3-磷酸；而當(dāng)鹽度增高時(shí)，壇紫菜為加速調(diào)節(jié)藻體內(nèi)部滲透壓，葉狀體急需大量的紅藻糖苷或甘油調(diào)節(jié)滲透壓，從而對(duì)前體物甘油-3-磷酸的需求也急劇增加。

Sun等[12]報(bào)道顯示，壇紫菜經(jīng)干出1 h脅迫后，藻體中的紅藻糖苷合成酶表達(dá)量增加30倍以上，且隨著干出時(shí)間的增加而逐漸降低，但仍為對(duì)照組的5～12倍。此外，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)壇紫菜中紅藻糖苷含量在干出2 h后才出現(xiàn)顯著上升現(xiàn)象[10]。而本試驗(yàn)中，為了合成紅藻糖苷，甘油-3-磷酸含量在1 h內(nèi)顯著上升，這可能是由于甘油-3-磷酸作為信號(hào)分子，促進(jìn)藻體開(kāi)始激活紅藻糖苷異構(gòu)體的響應(yīng)通路，但隨著干出時(shí)間增加，紅藻糖苷的需求量開(kāi)始減少，因此其前體物質(zhì)甘油-3-磷酸的含量也開(kāi)始下降，但仍被用于合成為藻體所需的紅藻糖苷異構(gòu)體進(jìn)行防御。

4 結(jié)論

本研究建立起基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的甘油-3-磷酸定量方法，分析非生物脅迫下壇紫菜中甘油-3-磷酸的響應(yīng)變化規(guī)律。結(jié)果顯示，甘油-3-磷酸含量與溫度和鹽度脅迫程度呈正比；不同干出時(shí)間脅迫造成壇紫菜中甘油-3-磷酸含量略上升后，整體呈下降趨勢(shì)。由此可知，作為紅藻糖苷的合成前體物，壇紫菜藻體內(nèi)甘油-3-磷酸水平可快速響應(yīng)環(huán)境脅迫，溫度和鹽度脅迫導(dǎo)致甘油-3-磷酸的合成，并作為信號(hào)分子促進(jìn)了藻體開(kāi)始激活紅藻糖苷異構(gòu)體的響應(yīng)通路，從而促進(jìn)紅藻糖苷的生成，以參與藻類(lèi)抗逆應(yīng)答過(guò)程。而干出造成甘油-3-磷酸被逐漸消耗合成更多紅藻糖苷進(jìn)行防御。