基于譜效分析評價(jià)電子束輻照滅菌對山銀花藥材質(zhì)量的影響

徐遠(yuǎn)芳 彭 玲 李鵬輝 張祺玲 高美須 周毅吉李文革 鄧鋼橋,*

(1 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所/湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心/生物輻照技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410125；2 湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006；3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

《中華人民共和國藥典》自2005年版起將金銀花分列為金銀花和山銀花，兩種藥材的基源不同，但藥理作用相似[1-2]。山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand. -Mazz.)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、華南忍冬(LoniceraconfusaDC.)或黃褐毛忍冬(Lonicerafulvoto-mentosaHsu et S. C. Cheng)的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱[3]。山銀花因產(chǎn)量高、易采收、花期長等特點(diǎn)而被大量種植，主產(chǎn)于我國湖南、廣東、四川等南方地區(qū)[4]。山銀花作為中醫(yī)臨床常用藥材，是銀翹解毒丸(片)、犀羚解毒丸(片)、銀花口服液、維C銀翹片等多種中成藥的主要原料，同時(shí)也屬于藥食同源類原料。近年來，山銀花還被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸藥等領(lǐng)域，市場需求量逐年增加[5]。山銀花含有綠原酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、皂苷等多種活性成分[6-7]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山銀花具有抗菌[8]、抗病毒[9]、抗炎[10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、護(hù)肝[13]及調(diào)節(jié)免疫[14]等功效。其中，綠原酸含量是山銀花藥材內(nèi)在質(zhì)量的標(biāo)志，與價(jià)格、藥用價(jià)值和臨床療效密切相關(guān)[15]。山銀花中綠原酸含量明顯高于金銀花[16]。李泮霖等[17]研究發(fā)現(xiàn)山銀花對口腔炎癥因子的調(diào)控作用明顯強(qiáng)于金銀花，說明綠原酸含量與其藥效密切相關(guān)。

山銀花藥材在貯藏過程中易出現(xiàn)蟲蛀、霉變等問題，不僅浪費(fèi)藥材，造成經(jīng)濟(jì)損失，還可能使藥材的藥性發(fā)生改變，導(dǎo)致藥材質(zhì)量和療效下降。傳統(tǒng)的中藥材貯藏養(yǎng)護(hù)方法包括硫磺熏蒸等化學(xué)方法以及干燥、氣調(diào)貯藏等物理方法，但普遍存在化學(xué)殘留、有效成分含量降低以及成本高等問題。因此，探索科學(xué)的貯藏養(yǎng)護(hù)方法對保障山銀花藥材質(zhì)量具有重要意義。輻照滅菌是目前常用的中藥滅菌方法之一，與傳統(tǒng)的中藥材滅菌方法相比，具有效果好、安全、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于含揮發(fā)性、熱敏性中藥材的滅菌[18]。60Co-γ射線和電子束是輻照技術(shù)應(yīng)用的兩種主要射線類型，目前已廣泛應(yīng)用于食品貯藏與保鮮等領(lǐng)域[19]。但電子束輻照在中藥滅菌領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究較少，有關(guān)中藥材電子束輻照滅菌的研究僅見于黨參[20]、黃連[21]、貫葉金絲桃[22]等少數(shù)品種，且僅關(guān)注電子束輻照對中藥材有效成分含量的影響，而對電子束輻照滅菌中藥材質(zhì)量控制技術(shù)缺少深入研究。

本研究以中藥材山銀花及其提取物為對象，采用不同劑量的電子束進(jìn)行輻照處理，通過對其指標(biāo)成分綠原酸含量和1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH·)清除率的測定、高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)指紋圖譜相似度評價(jià)及聚類分析(cluster analysis, CA)，利用譜效變化的分析方法評價(jià)電子束輻照滅菌對山銀花及其提取物質(zhì)量的影響，旨在為電子束輻照技術(shù)在山銀花藥材貯藏應(yīng)用中的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山銀花，購自湖南省長沙市高橋中藥材市場，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院專家鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬黃綠色干燥的花蕾。山銀花提取物，其中綠原酸含量為5%，棕黃色粉狀，購自長沙市惠瑞生物科技有限公司。

綠原酸對照品(96.8%)、木犀草苷對照品(93.5%)、蘆丁對照品(91.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；DPPH，日本W(wǎng)AKO公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙腈(色譜純)，美國SIGMA公司；甲醇、乙醇、磷酸等試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B3 WINdose輻照劑量計(jì)，美國GEX公司；IS1020電子束輻照加工系統(tǒng)(10 MeV/20 kW)，北京同方威視技術(shù)股份有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；SB-5200D超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；SQP電子天平，德國Sartorius公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；MJ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備 采用PE自封袋分裝，山銀花和山銀花提取物樣品各15袋，每袋約50 g，用于微生物限度檢查；2種樣品各15 袋，每袋約100 g，用于DPPH·清除率、綠原酸含量以及HPLC指紋圖譜檢測，其中山銀花經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎后過60目篩。

1.3.2 電子束輻照 電子束輻照在湖南湘華華大生物科技有限公司進(jìn)行，輻照過程用輻照變色薄膜劑量計(jì)進(jìn)行劑量跟蹤。試驗(yàn)輻照劑量分別設(shè)定為0、3、6、9、18 kGy，吸收劑量實(shí)測值分別為0、2.8、6.3、9.5、18.8 kGy，以上每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行。樣品輻照完成后即進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，所有指標(biāo)均重復(fù)檢測3次。

1.3.3 微生物限度檢測 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢測參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法[23]。

1.3.4 抗氧化活性測定[24]

1.3.4.1 DPPH乙醇溶液的制備 準(zhǔn)確稱取0.002 0 g DPPH置于50 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，避光保存，即得 0.1 mmol·mL-1DPPH溶液。

1.3.4.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品粉末，置于具塞錐形瓶中，加入10 mL 60%乙醇溶液，65℃超聲提取30 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液0.48 mL于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，即得供試品溶液。

1.3.4.3 樣品DPPH·清除率的測定 準(zhǔn)確移取1 mL供試品溶液、4 mL DPPH溶液于試管中，搖勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度值(A1)。準(zhǔn)確移取1 mL供試品溶液與4 mL 60%乙醇于試管中，搖勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長處測定吸光度值(A2)。準(zhǔn)確移取1 mL 60%乙醇溶液與4 mL DPPH溶液于試管中，搖勻，避光反應(yīng) 30 min，于517 nm波長處測定吸光度值(A0)。按照公式計(jì)算樣品DPPH·清除率：

DPPH·清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.3.5 HLPC指紋圖譜測定[3]

1.3.5.1 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取綠原酸、木犀草苷、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品5.02、5.53、5.32 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得3種對照品溶液。

1.3.5.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶液，稱定重量，超聲(功率300 W，頻率40 kHz)提取40 min，取出，冷卻，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.3.5.3 HPLC色譜分析 Welchrom C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相，按照表1的程序進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1， 柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，雙波長檢測，樣品指紋圖譜檢測波長220 nm，綠原酸含量檢測波長330 nm。

表1 流動(dòng)相時(shí)間程序Table 1 The time program of mobile phase

1.3.5.4 指紋圖譜采集 按前述方法分別制備對照品和供試品溶液，以50%甲醇溶液作為溶劑空白，精密吸取溶劑空白、對照品、供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀于波長220 nm處進(jìn)行測定，即得HPLC指紋圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對山銀花藥材生物負(fù)載的影響

2020年版《中華人民共和國藥典》中明確規(guī)定了非無菌藥用原料及輔料、中藥提取物的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，即需氧菌總數(shù)不超過103CFU·g-1，霉菌和酵母菌總數(shù)不超過102CFU·g-1，對控制菌未做統(tǒng)一規(guī)定[23]。經(jīng)不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花藥材的生物負(fù)載情況見表2，可以看出，未輻照(0 kGy)山銀花及其提取物中需氧菌總數(shù)分別為9.7×103CFU·g-1和5.6×104CFU·g-1，霉菌和酵母菌總數(shù)分別為6.3×103CFU·g-1和3.3×103CFU·g-1。電子束輻照對山銀花及其提取物中微生物具有明顯的殺滅作用，隨著吸收劑量增大，其存活數(shù)減少。6.3 kGy吸收劑量電子束輻照后，2種樣品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。吸收劑量達(dá)到9.5 kGy時(shí)，其微生物指標(biāo)均降至10 CFU·g-1以下。由此可見，電子束輻照技術(shù)是一種有效降低山銀花中生物負(fù)載的方法。

表2 不同吸收劑量電子束輻照山銀花藥材的生物負(fù)載Table 2 The bioburden of Lonicerae flos irradiated by different absorbed doses of electron beam /(CFU·g-1)

2.2 電子束輻照對山銀花藥材綠原酸含量的影響

綠原酸是山銀花的主要活性成分，其含量是衡量山銀花質(zhì)量的重要指標(biāo)。經(jīng)不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花中綠原酸含量的變化如圖1所示，山銀花樣品中綠原酸的含量介于5.34%～5.66%之間，經(jīng)不同劑量電子束輻照處理山銀花樣品中綠原酸的含量未發(fā)生顯著變化，且與未輻照樣品相比均無顯著差異(P>0.05)；山銀花提取物樣品中綠原酸的含量介于5.80%～6.28%之間，與未輻照樣品相比，2.8、6.3、9.5 kGy吸收劑量電子束輻照處理樣品中綠原酸的含量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，但變化幅度不大，其變化率分別為1.79、4.89和1.79個(gè)百分點(diǎn)；當(dāng)吸收劑量為18.8 kGy時(shí)，其差異不顯著(P>0.05)。以山銀花及其提取物的綠原酸含量(y)對吸收劑量(x)做一元線性回歸分析，分別得到回歸方程y=-0.004 6x+ 5.570 4,R2=0.417 1(P=0.24)和y=0.000 8x+ 6.119 8,R2=0.001 3(P=0.96)，顯示山銀花中綠原酸含量的變化與吸收劑量無明顯的線性相關(guān)性(P>0.05)?？梢姡娮邮椪諏ι姐y花中綠原酸含量影響不大，吸收劑量達(dá)到18.8 kGy時(shí)，其含量與未輻照樣品相比無顯著差異(P>0.05)。

注：不同小寫字母表示不同劑量電子束輻照樣品間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters represent significant differences between samples under the conditions of different electron beam irradiation dose at 0.05 level. The same as following.圖1 不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花藥材綠原酸含量Fig.1 Chlorogenic acid content of Lonicerae flos irradiated with different absorbed doses of electron beam

2.3 電子束輻照對山銀花藥材DPPH·清除率的影響

經(jīng)不同吸收劑量電子束輻照處理后，山銀花及其提取物DPPH·清除率的變化情況如圖2所示。與未輻照樣品相比，不同劑量電子束輻照山銀花樣品的DPPH·清除率顯著增加，但總體變化率較小，介于0.77～1.48個(gè)百分點(diǎn)之間。不同劑量電子束輻照處理山銀花提取物樣品的DPPH·清除率無明顯的變化規(guī)律。與未輻照樣品相比，6.3 kGy吸收劑量電子束輻照樣品的DPPH·清除率顯著降低(P<0.05)，變化率為11.26個(gè)百分點(diǎn)，與之相應(yīng)綠原酸含量也顯著低于對照樣品，究其原因，可能與山銀花提取物樣品本身的一致性有關(guān)，但也說明山銀花中綠原酸含量與其抗氧化活性密切相關(guān)；9.5 kGy時(shí)則顯著升高(P<0.05)，變化率為3.86個(gè)百分點(diǎn)；吸收劑量為18.8 kGy時(shí)，樣品的DPPH·清除率與未輻照樣品無顯著差異(P>0.05)。以山銀花及其提取物DPPH·清除率(y)對吸收劑量(x)做一元線性回歸分析，分別得到回歸方程y=-0.062 2x+ 89.014 0,R2=0.766 7(P=0.05)和y=0.129 3x+ 93.073 0,R2=0.029 7(P=0.78)，顯示山銀花的DPPH·清除率變化與吸收劑量無明顯的線性相關(guān)性(P>0.05)?？梢?，電子束輻照對山銀花藥材DPPH·清除率的影響不大，吸收劑量達(dá)到18.8 kGy時(shí)，山銀花的DPPH·清除率與未輻照樣品無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花藥材的DPPH·清除率Fig.2 DPPH· scavenging ratio of Lonicerae flos irradiated with different absorbed doses of electron beam

2.4 電子束輻照對山銀花藥材指紋圖譜的影響

未輻照(0 kGy)山銀花及其提取物、綠原酸、木犀草苷與蘆丁對照品的HPLC圖見圖3。不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花及其提取物的HPLC圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012A版》軟件進(jìn)行處理，以未輻照(0 kGy)山銀花及其提取物樣品作為參照圖譜，利用中位數(shù)法進(jìn)行多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配(時(shí)間窗寬度為0.10)，共標(biāo)定了22和24個(gè)共有峰分別作為山銀花及其提取物指紋圖譜的特征峰，生成對照圖譜R1、R2，即共有模式圖，分別見圖4和圖5，其中，對照圖譜R1中9號峰和R2中10號峰為綠原酸。

注：S0：溶劑空白；S1：綠原酸對照品；S2：蘆丁對照品；S3：木犀草苷對照品；S4：未輻照山銀花(0 kGy)；S5：未輻照山銀花提取物(0 kGy)。Note: S0: Blank solvent. S1: Reference substance of chlorogenic acid. S2: Reference substance of rutin. S3: Reference substance of cynaroside. S4: Unirradiated Lonicerae flos. S5: Unirradiated Lonicerae flos extact.圖3 對照品與山銀花藥材的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of reference substances and Lonicerae flos

注：R1：山銀花對照圖譜；S1～S3：未輻照樣品(0 kGy)；S4～S6：2.8 kGy輻照樣品；S7～S9：6.3 kGy輻照樣品；S10～S12：9.5 kGy輻照樣品；S13～S15：18.8 kGy輻照樣品。Note: R1: Reference spectrum of Lonicerae flos. S1～S3: Unirradiated sample. S4～S6: Sample irradiated with 2.8 kGy. S7～S9: Sample irradiated with 6.3 kGy. S10～S12: Sample irradiated with 9.5 kGy. S13～S15: Sample irradiated with 18.8 kGy.圖4 山銀花的HPLC指紋圖譜及其對照指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint chromatograms and reference of Lonicerae flos

注：R2：山銀花提取物對照圖譜；S1～S3：未輻照樣品(0 kGy)；S4～S6∶2.8 kGy輻照樣品；S7～S9∶6.3 kGy輻照樣品；S10～S12∶9.5 kGy輻照樣品；S13～S15：18.8 kGy輻照樣品。Note: R2: Reference spectrum of Lonicerae flos extact. S1～S3: Unirradiated sample. S4～S6: Sample irradiated with 2.8 kGy. S7～S9: Sample irradiated with 6.3 kGy. S10～S12: Sample irradiated with 9.5 kGy. S13～S15: Sample irradiated with 18.8 kGy.圖5 山銀花提取物的HPLC指紋圖譜及其對照指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint chromatograms and reference of Lonicerae flos extract

將經(jīng)不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花及其提取物的指紋圖譜與對照圖譜進(jìn)行比較，分別計(jì)算不同處理山銀花及其提取物樣品與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表3和表4。由相似度評價(jià)結(jié)果可以看出，不同劑量電子束輻照處理山銀花及其提取物圖譜與其對照圖譜R1、R2的相似度均為1.0。以9、10號峰綠原酸為參比峰，以其保留時(shí)間為1，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。其中，山銀花指紋圖譜相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)小于0.21%，相對峰面積的RSD范圍為0.65%～41.41%；山銀花提取物指紋圖譜相對保留時(shí)間的RSD小于3.09%，相對峰面積的RSD范圍為0.19%～48.93%。可見，不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花及其提取物的圖譜整體相貌相同，化學(xué)組成一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花的HPLC指紋圖譜相似度Table 3 HPLC chromatograms similarity evaluation of Lonicerae flos irradiated by different absorbed doses of electron beam

表4 不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花提取物的HPLC指紋圖譜相似度Table 4 HPLC chromatograms similarity evaluation of Lonicerae flos extract irradiated by different absorbed doses of electron beam

2.5 電子束輻照山銀花藥材HPLC指紋圖譜的聚類分析

聚類分析(CA)是一種靜態(tài)數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，能夠把相似的對象通過靜態(tài)分類方式分成不同的組別或者更多的子集，讓在同一個(gè)子集中的對象都有一些相似的屬性，目前已廣泛應(yīng)用于模式識別和圖像分析等領(lǐng)域[25]。本研究將不同吸收劑量電子束輻照處理的山銀花及其提取物樣品指紋圖譜的共有峰峰面積進(jìn)行歸一化處理，采用MATLAB軟件對其進(jìn)行聚類分析，結(jié)果分別見圖6和圖7?？梢钥闯?，山銀花及其提取物樣品并未隨不同吸收劑量呈現(xiàn)各自分組，且縱坐標(biāo)歐氏距離相差較小，表明不同吸收劑量電子束輻照處理的山銀花及其提取物與未輻照樣品未呈現(xiàn)明顯區(qū)分?？梢?，18.8 kGy以內(nèi)吸收劑量電子束輻照不會使山銀花藥材指紋圖譜出現(xiàn)顯著差異。

圖6 不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花指紋圖譜的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of HPLC fingerprint chromatogram of Lonicerae flos irradiated with different absorbed doses of electron beam

圖7 不同吸收劑量電子束輻照處理山銀花提取物指紋圖譜的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of HPLC fingerprint chromatogram of Lonicerae flos extract irradiated with different absorbed doses of electron beam

3 討論

中藥材貯藏養(yǎng)護(hù)是保障中藥材質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，不同加工方法對山銀花中化學(xué)成分影響很大[26-27]。硫磺熏蒸曾作為一種傳統(tǒng)的中藥材養(yǎng)護(hù)方法在中藥材及飲片加工貯藏中廣泛使用，但由于存在二氧化硫殘留、有效成分含量明顯降低等安全性問題，自2005年版《中華人民共和國藥典》起不再收載硫磺熏蒸方法[28]。輻照滅菌是目前中藥滅菌常用的方法之一，我國在“六五”、“七五”、“八五”期間對60Co輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)開展了大量、系統(tǒng)、深入的研究工作。1997年，衛(wèi)生部發(fā)布了“60Co輻射中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)”(內(nèi)部試行)文件，金銀花被列為允許輻照的中藥材品種之一[29]。2015年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》，以指導(dǎo)規(guī)范合理地使用中藥輻照滅菌技術(shù)[30]。但電子束輻照技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥滅菌的歷史較短，基礎(chǔ)研究較少，需不斷完善以滿足其應(yīng)用需求。本研究結(jié)果表明，電子束輻照對山銀花藥材中污染微生物具有明顯的殺滅作用，吸收劑量越大，生物負(fù)載越低。經(jīng)6.3 kGy吸收劑量電子束輻照樣品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，吸收劑量為9.5 kGy時(shí)，樣品的微生物總數(shù)均低于10 CFU·g-1。 符國棟[31]、蔡汶莉[32]研究電子束輻照山銀花藥材的貯藏效果，結(jié)果表明電子束輻照對山銀花中微生物具有明顯的殺滅和抑制作用，這與本研究中電子束輻照滅菌山銀花及其提取物的結(jié)果相似。綜上，采用10 kGy以內(nèi)吸收劑量的電子束輻照可有效控制山銀花藥材的生物負(fù)載，從而達(dá)到相關(guān)規(guī)定的要求。

中藥輻照滅菌的效果取決于輻照劑量、微生物菌相、中藥劑型等因素，輻照劑量越大，滅菌效果越好，但劑量過大對中藥的影響也可能越大[33]。目前對于山銀花藥材的質(zhì)量控制，2020年版《中華人民共和國藥典》僅規(guī)定其性狀、鑒別以及指標(biāo)成分綠原酸含量等[3]。本研究以0～18.8 kGy吸收劑量的電子束輻照山銀花及其提取物，結(jié)果表明電子束輻照對其指標(biāo)成分綠原酸含量的影響不大，這與符國棟[31]、蔡汶莉[32]的研究結(jié)論一致。但中藥成分復(fù)雜，主要以多種成分協(xié)同發(fā)揮療效，簡單用單一成分含量高低評價(jià)中藥質(zhì)量存在局限性。中藥指紋圖譜因其整體性、宏觀性和模糊性的特點(diǎn)，已成為中藥質(zhì)量控制的常用方法。目前，山銀花藥材指紋圖譜研究已有相關(guān)報(bào)道[34-36]，有關(guān)60Co-γ射線輻照滅菌中藥的指紋圖譜研究可見于連翹[37]、姜黃[38]以及六味安消散[39]等，而電子束輻照滅菌中藥的指紋圖譜研究尚鮮見。本研究利用指紋圖譜分析電子束輻照山銀花及其提取物，結(jié)果表明電子束輻照前后樣品指紋圖譜未出現(xiàn)顯著差異。指紋圖譜在一定程度上可對中藥質(zhì)量進(jìn)行控制，但只能對其中的化學(xué)成分進(jìn)行穩(wěn)定性分析，并不能解釋其與中藥藥效的相關(guān)性，要建立嚴(yán)格的中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)關(guān)注其與療效的相關(guān)性[24, 40-41]。因此，本研究進(jìn)一步以DPPH·清除能力評價(jià)電子束輻照對山銀花及其提取物抗氧化活性的影響，結(jié)果表明不超過18.8 kGy電子束輻照對樣品的抗氧化活性影響不大。本課題組前期利用抗氧化活性結(jié)合指紋圖譜評價(jià)輻照葛根提取物的質(zhì)量穩(wěn)定性，具有一定的參考價(jià)值[42]。本研究中利用譜效分析較為全面地評價(jià)了電子束輻照滅菌對山銀花藥材質(zhì)量的影響。綜合評價(jià)結(jié)果表明，電子束輻照技術(shù)是一種能有效降低山銀花藥材中生物負(fù)載的方法，且對其質(zhì)量的影響不大，可在滿足其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的前提下，按照《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求盡可能采用不超過10 kGy的低劑量進(jìn)行輻照[30]。

4 結(jié)論

本研究分析了不同吸收劑量電子束輻照處理對中藥材山銀花及其提取物的生物負(fù)載、綠原酸含量、DPPH·清除率及HPLC指紋圖譜的影響。結(jié)果表明，電子束輻照能夠有效降低山銀花藥材的生物負(fù)載，18.8 kGy以內(nèi)吸收劑量電子束輻照對其主要功效成分及抗氧化活性影響不大，不同劑量輻照處理樣品的指紋圖譜相似度為1，聚類分析(CA)結(jié)果也表明不同樣品間未呈現(xiàn)顯著差異。綜上，電子束輻照是一種控制山銀花藥材中生物負(fù)載的有效方法，且對其化學(xué)成分一致性及藥材質(zhì)量穩(wěn)定性無明顯影響。