梨果黑斑病菌磷酸二酯酶PDE基因克隆及其在侵染結構分化中的表達分析

毛仁燕 蔣倩倩 李永才 畢 陽 劉勇翔 黃 怡 張 苗

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

鏈格孢菌(Alternariaalternata)作為典型的潛伏性侵染真菌[1]，是梨果采后主要致腐病原物之一[2]，其侵染后不僅會造成重大的經(jīng)濟損失，同時其作為病原物產(chǎn)生的毒素等代謝產(chǎn)物還會引起食品安全隱患[3-4]。深入了解A.alternata與果實的互作機制，對開發(fā)有效的病害防控措施具有至關重要的意義。病原真菌通過感知和響應宿主表面疏水性和表皮蠟質(zhì)組分等物化信號進而啟動侵染，并在侵染過程中形成侵染結構，在病原菌識別外界信號的過程中，涉及眾多細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，如cAMP(cyclic adenosine monophosphate)、MAPK(mitogen-activated protein kinase)及Ca2+途徑等[5]。其中，cAMP-PKA(cAMP-protein kinase A)信號傳導途徑在真菌致病調(diào)控中至關重要，該途徑通過調(diào)節(jié)cAMP的細胞內(nèi)水平來調(diào)節(jié)真菌病原體的形態(tài)發(fā)生和發(fā)病機制[6-7]。細胞內(nèi)cAMP的水平取決于其合成和降解相關酶的活性和基因表達，其中磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)可通過降解cAMP進而維持胞內(nèi)cAMP平衡。PDE共有11個家族，其家族催化域的氨基酸序列僅有25%～35%的相似性，但都具有共同的結構特征。如PDE所有催化域包含3個最多由16個螺旋組成的亞結構，這些螺旋中的活性位點由高度保守的氨基酸殘基組成[8]。其次，與金屬鋅結合的位點包含2個組氨酸和2個天冬氨酸殘基，這些殘基屬于磷酸二酯酶超家族HD結構的一部分，在目前已知的PDE中是絕對保守的[9]。在真菌中，PDE被劃分為低親和力磷酸二酯酶PDEL和高親和力磷酸二酯酶PDEH，盡管不同真菌之間的序列相似性較低，但均具有保守特征序列[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)[13]和柑橘褐斑病菌(Alternariaalternata)[14]中，PDEH和PDEL均具有典型的Ⅰ型和Ⅱ型催化結構域，但兩種酶在致病性調(diào)控方面存在相反的結果。因此，了解AaPDE基因結構的特異性對闡明其調(diào)控機制具有重要意義。

PDE的主要功能是特異性催化cAMP/cGMP 3′,5′環(huán)磷酸的3′環(huán)磷酸鍵水解，進而調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP的水平。PDEH在真菌、哺乳動物等多種生物中均有表達并表現(xiàn)出重要的調(diào)控作用[15]。相比之下，對PDEL的研究仍不夠系統(tǒng)，但已在多種生物，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[15]、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)[16]、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)[17]和新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)中發(fā)現(xiàn)PDEL[18]。在S.cerevisiae中，ScPDEH在調(diào)節(jié)營養(yǎng)感知、假菌絲分化、細胞周期進程和應激信號傳導中起重要作用[19]，ScPDEL并不直接調(diào)控cAMP水平，只在葡萄糖存在的條件下負責調(diào)控cAMP水平[20]。在黃曲霉(Aspergillusflavus)中，AfPDEH對黃曲霉菌的生長和毒素合成具有重要調(diào)控作用，而AfPDEL對其作用較弱[21]。在模式真菌稻瘟病菌中，MoPDEH在產(chǎn)孢量、致病性和細胞內(nèi)cAMP水平調(diào)節(jié)中均起主要作用，而MoPDEL無明顯作用[22]。在人類病原體白色念珠菌(Candidaalbicans)中，CaPDEH通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP水平來控制發(fā)育和毒性[23]?？梢奝DE的功能因病原物而異，具體調(diào)控機制尚需全面系統(tǒng)揭示。

本研究前期通過藥理學研究發(fā)現(xiàn)cAMP-PKA信號途徑與梨果表皮物化信號誘導A.alternata侵染結構分化有關[24]，并對該途徑的催化亞基AaPKAc進行了功能研究，進一步證實了cAMP-PKA信號途徑調(diào)控A.alternata菌絲生長、生物量、致病性和毒素產(chǎn)生[25]。為進一步探究梨果黑斑病菌cAMP-PKA途徑中對cAMP水平具有重要調(diào)控作用的PDE的生物功能，本研究克隆PDEL和PDEH基因，利用生物信息學的方法對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結構特征及分子進化等方面進行預測分析。此外，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術研究PDEL和PDEH在梨果黑斑病菌侵染結構分化過程中的表達特性，以期為進一步從分子水平揭示其調(diào)控機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

梨果黑斑病病菌A.alternata菌株(KY397985.1)分離自梨果的黑斑病部，經(jīng)過分離純化后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 梨果黑斑病菌A.alternata基因組DNA及RNA的提取 取培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)中5 d(28℃)的A.alternata新鮮菌絲0.1 g于研缽中，液氮研磨后使用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?HP Fungal DNA Kit(Omega，美國)提取，具體步驟參照產(chǎn)品說明書。提取A.alternata總RNA時，將121℃高壓滅菌后的研缽用液氮冰浴，再將上述取得的新鮮菌絲或孢子持續(xù)利用液氮冰預研磨，將研磨好的樣品用TRNzol試劑提取，操作過程中將提取物始終保持在4℃以下，具體操作參考使用說明書。將所得的RNA用Biospecnano型核算定量儀(島津，日本)測定濃度，并檢測OD260/OD280等指標后置于-80℃冷凍保存。將部分提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Code.RR047B)試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)進行基因組gDNA消化以及第一鏈cDNA合成。

1.2.2 梨果黑斑病菌AaPDEL和AaPDEH基因克隆 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載A.alternata的磷酸二酯酶PDEL和PDEH的基因序列，利用DNAMAN 6.0設計AaPDEL和AaPDEH的擴增引物(表1)，以梨果黑斑病菌A.alternata的cDNA為模板進行擴增，20 μL PCR反應體系：20 ng·μL-1cDNA 1 μL，10 μmol·L-1引物F、R各0.5 μL，2×PhantaMaxMasterMix高保真酶10 μL，ddH2O 8 μL。 擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳(1%瓊脂糖)觀察條帶大小，使用全式金瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Bio-Rad,美國)對符合預期大小的目的條帶切膠回收。連接PTOPO-Blunt載體并送往北京擎科測序。

表1 擴增目的基因引物序列Table 1 Primers used for amplication of target gene

1.2.3AaPDEL和AaPDEH基因序列和編碼蛋白的生物信息學分析 利用GENEDOC軟件進行同源序列比對。采用MEGA7軟件中的MUSCLE程序進行與其他真菌物種中PDE蛋白的多重序列比對，使用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹，運行參數(shù)如下：Bootstrap值為1 000，其余參數(shù)設置為默認值。利用在線網(wǎng)址進行目的基因及其編碼產(chǎn)物的生物信息學分析，預測網(wǎng)址如表2所示：

表2 在線預測網(wǎng)址Table 2 Online website

1.2.4 qRT-PCR分析 用無菌水從培養(yǎng)5 d的A.alternata菌落中收集孢子，經(jīng)過4層紗布過濾得到孢子懸浮液，并利用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水稀釋孢子懸浮液濃度至5×105spores·mL-1。將疏水Gelbond膜(接觸角為74.63°)剪切至蓋玻片大小(5 cm×2 cm)放置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中后在膜上滴加20 μLA.alternata的孢子懸浮液，在28℃的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)2、4、6、8 h。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法檢測A.alternata中AaPDEL和AaPDEH基因分別在孢子萌發(fā)(2 h)、芽管伸長(4 h)、附著胞形成(6 h)、侵染菌絲形成(8 h)階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)為內(nèi)參基因，PCR反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃ 40 s (收集熒光)，40個循環(huán)。以誘導2 h為對照，設置3次重復?；蛳鄬Ρ磉_量計算采用2-ΔΔCT算法。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 全部試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析，用Origin9.0繪制圖表，用Duncan’s法進行差異顯著性分析和標準偏差計算。

2 結果與分析

2.1 AaPDEL和AaPDEH基因克隆

以梨果黑斑病菌A.alternata(KY397 985.1)cDNA為模板，利用特異性引物AaPDEH-F/R和AaPDEL-F/R對其進行PCR擴增，得到大小分別為2 800 bp左右和3 100 bp左右的擴增產(chǎn)物AaPDEH和AaPDEL(圖1)。

圖1 AaPDEH和AaPDEL基因的克隆Fig.1 Cloning of AaPDEH and AaPDEL genes

2.2 AaPDEL和AaPDEH蛋白的生物信息學分析

2.2.1 基因結構及蛋白理化性質(zhì)分析 基因結構及序列信息分析結果表明，AaPDEL基因全長為4 923 bp，包含4個內(nèi)含子和5個外顯子(圖2)，共含38個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其蛋白編碼區(qū)(coding sequence, CDS)長度為3 132 bp，共編碼1 043個氨基酸；AaPDEH基因全長為3 138 bp，包含5個內(nèi)含子和6個外顯子(圖2)，共含22個ORF，其CDS區(qū)長度為 2 886 bp， 共編碼961個氨基酸。對其編碼蛋白的理化性質(zhì)預測表明，AaPDEL分子量為114.38 kDa，化學式為C5069H7849N1397O1573S19，理論等電點為5.72，負電荷殘基數(shù)均大于正電荷殘基數(shù)，屬于酸性蛋白；AaPDEH分子量為105.99 kDa，C4621H7387N1339O1452S33，其等電點為8.16，負電荷殘基數(shù)均小于正電荷殘基數(shù)，屬于堿性蛋白；AaPDEL和AaPDEH總平均親水性均小于0，脂肪系數(shù)均低于100，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明AaPDEL和AaPDEH均屬于親水性不穩(wěn)定蛋白。

圖2 AaPDEL和AaPDEH基因結構Fig.2 Genetic structures of AaPDEL and AaPDEH

2.2.2 同源序列比對和結構域分析 通過GENEDOC軟件進行氨基酸同源序列比對分析發(fā)現(xiàn)，AaPDEL和AaPDEH分別具有Class Ⅱ PDE保守催化結構域H-x-H-L-D-H-[LIVM]-x-[GS]-[LIVMA]-[LIVM](2)-x-S-[AP]和Class Ⅰ PDE保守催化結構域H-D-[LIVMFY]-x-H-x-[AG]-x(2)-[NQ]-x-[LIVMFY](圖3)。此外，通過SMART網(wǎng)站在線分析其氨基酸序列的結構域，并通過IBS1.0軟件繪制AaPDEL和AaPDEL蛋白結構域，結果顯示，AaPDEL在位于第251～第357氨基酸范圍內(nèi)具有翻譯延長因子EF1G保守基序，AaPDEH在位于第358～第548氨基酸范圍內(nèi)含有一個保守的金屬依賴性磷酸二酯酶“HD”基序(圖4)。

圖3 AaPDEL和AaPDEL同源序列比對Fig.3 Alignment of AaPDEL and AaPDEH homologous sequences

圖4 AaPDEL和AaPDEL的結構域分析Fig.4 Domain analysis of AaPDEL and AaPDEH

2.2.3 系統(tǒng)進化樹分析 利用NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線工具檢索AaPDEL和AaPDEH蛋白的同源序列，構建系統(tǒng)進化樹(圖5)。結果表明，AaPDEL和AaPDEH分別與小麥褐斑病菌(Pyrenophoratritici-repentis)和番茄匍柄霉(Stemphyliumlycopersici)基因聚于同一分支，親緣關系最近，同源性分別高達79.25%和88.80%。

圖5 AaPDEL和AaPDEH的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of AaPDEL and AaPDEH

2.2.4 跨膜結構域、信號肽和親/疏水性分析 利用TMHMM Serverv.2.0預測AaPDEL和AaPDEH的跨膜區(qū)域，結果顯示，AaPDEL和AaPDEH均無跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白(圖6-A、B)。利用SignalP 4.1 Server預測AaPDEL和AaPDEH為信號肽的可能性，其值為0.146 7和0.050 1，因此兩個蛋白無信號肽，屬于非分泌蛋白(圖6-C、D)。利用ProtScale預測AaPDEL和AaPDEH的親疏水性，發(fā)現(xiàn)整體上親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且平均分值大于疏水性氨基酸，初步推測AaPDEL和AaPDEH均為親水性蛋白(圖6-E、F)。

圖6 AaPDEL和AaPDEH蛋白的跨膜結構域(A、B)，信號肽(C、D)和親疏水性(E、F)預測Fig.6 Prediction of transmembrane domains (A, B), signal peptides (C, D), and hydrophobicity predictions (E, F) of AaPDEL and AaPDEH proteins

2.2.5 二、三級結構預測 采用SOPMA軟件預測AaPDEL和AaPDEH蛋白二級結構，如圖7-A所示。AaPDEL和AaPDEH蛋白二級結構均由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，其中α-螺旋結構和無規(guī)則卷曲均是出現(xiàn)最多的結構，而β-折疊和延伸鏈出現(xiàn)比例均較小。利用在線工具SWISS-MODEL對AaPDEL和AaPDEH蛋白進行同源建模，得到三級結構圖(圖7-B)。

注：A和B分別是AaPDEL和AaPDEH的二、三級結構。Note: A and B are the secondary and tertiary structures of AaPDEL and AaPDEH, respectively.圖7 AaPDEL和AaPDEH基因編碼產(chǎn)物的二、三級結構Fig.7 AaPDEL and AaPDEH genes coding products of secondary and tertiary structure

2.2.6 亞細胞定位 成熟蛋白質(zhì)僅在特定的細胞器里發(fā)揮穩(wěn)定的生物學功能，因此，分析蛋白質(zhì)的亞細胞定位有助于了解蛋白質(zhì)的生物學功能。利用Softberry預測結果表明，AaPDEL主要定位于線粒體上，AaPDEH主要定位于細胞核上(表3)。

表3 AaPDEL和AaPDEH亞細胞定位預測Table 3 Prediction of AaPDEL and AaPDEH subcellular localization

2.2.7 磷酸化位點分析 利用NetPhos3.1 Server在線分析工具預測AaPDEL和AaPDEH中的磷酸化位點，結果發(fā)現(xiàn)，AaPDEL蛋白存在58個Ser磷酸化位點，32個Thr磷酸化位點和15個Tys磷酸化位點(圖8-A)；AaPDEH蛋白存在80個Ser磷酸化位點，36個Thr磷酸化位點和7個Tys磷酸化位點(圖8-B)。

注：Ser：絲氨酸；Thr：蘇氨酸；Tys：酪氨酸。Note: Ser:Serine. Thr:Threonine. Tys:Tyrosine.圖8 AaPDEL(A)和AaPDEH(B)蛋白的磷酸位點分析Fig.8 Protein phosphorylation sites analysis of AaPDEL(A) and AaPDEH(B) proteins

2.3 AaPDEL和AaPDEH在疏水性誘導侵染分化中的表達分析

通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)AaPDEL和AaPDEH在A.alternata侵染結構分化過程中表達量存在差異(圖9)。以萌發(fā)初級階段(2 h)作為對照，AaPDEL表達量在芽管伸長階段(4 h)低于對照，隨后在附著胞形成階段(6 h)，以及侵染菌絲形成后期(8 h)均顯著上調(diào)。AaPDEH表達量在侵染結構形成階段持續(xù)顯著上調(diào)。AaPDEL和AaPDEH基因在附著胞形成階段(6 h)表達均出現(xiàn)了高峰，表達量較萌發(fā)初級階段(2 h)分別上調(diào)了1.19和1.97倍。由此表明，AaPDEL和AaPDEH協(xié)同調(diào)控疏水誘導A.alternata附著胞和侵染菌絲的形成，以AaPDEH作用更為明顯。

注：不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。Note: Different letters indicating significant differences at 0.05 level.圖9 AaPDEL和AaPDEH基因在侵染結構分化中的表達量Fig.9 Expression of AaPDEL and AaPDEH genes in infection structure differentiation.

3 討論

本研究通過蛋白結構域分析表明，AaPDEH具有典型的Class I PDE保守催化結構域和金屬依賴性磷酸二酯酶“HD”基序；AaPDEL具有典型的Class Ⅱ PDE保守催化結構域，這與M.oryzae[26]、S.turcica[27]和柑橘褐斑病菌(A.alternata)[28]等的磷酸二酯酶分析結果類似。保守結構域是基因的核心，在生物進化或者一個蛋白家族中具有不變或相同的結構域，具有重要的功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，存在于具有金屬依賴性磷酸水解酶超家族中的HD結構域是調(diào)節(jié)磷酸二酯酶活性所必需的[29]。在M.oryzae中，高親和力磷酸二酯酶的HD結構域能夠修復MoPDEH缺失突變株在產(chǎn)孢量、孢子形態(tài)、親水表面附著胞形成、毒力和胞內(nèi)cAMP水平上的缺陷[30]，這表明AaPDEH結構的保守性可能與功能之間存在必然聯(lián)系。與ScPDEL[31]相比，AaPDEL多一個EF1G結構域，因此該蛋白在梨果黑斑病菌A.alternata中可能具有更復雜的生物學功能。

PDE作為G蛋白信號通路中重要的效應酶，一般在細胞內(nèi)發(fā)揮作用。本研究通過生物學軟件分析發(fā)現(xiàn)，梨果黑斑病菌中AaPDEL和AaPDEH在亞細胞定位上存在一定差異，分別位于線粒體和細胞核中。Ramanujam等[22]通過融合報告基因定位法發(fā)現(xiàn)定位于不同位置的MoPDEH和MoPDEL對調(diào)控cAMP水平以及致病性發(fā)揮不同的調(diào)控作用。因此，AaPDEL和AaPDEH的具體調(diào)控作用還需進一步驗證。

宿主表面蠟質(zhì)和疏水性是誘導部分植物病原真菌中侵染結構形成的重要刺激信號[32-33]。在小麥白粉菌(Blumeriagraminis)中，噴蠟的載玻片上需要有高疏水性表面才能誘導B.graminis孢子萌發(fā)和附著胞形成[34]。在玉米黑粉病菌(Ustilagomaydis)中疏水性表面能夠誘導菌絲的擴展和附著胞形成[35]。本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，A.alternata在梨果表皮上的侵染過程為孢子萌發(fā)形成芽管，芽管伸長、頂端膨大形成附著胞，部分附著胞進一步分化形成侵染菌絲，進而通過皮孔或表皮傷口侵入果實，而果實表皮疏水性與誘導A.alternata附著胞的形成呈正相關[36]。前人研究表明，許多植物病原真菌中附著胞的形成是成功侵入寄主的關鍵[37]。本研究利用人造疏水性表面誘導梨果黑斑病菌侵染結構分化發(fā)現(xiàn)，AaPDEL和AaPDEH基因均在附著胞形成階段(6 h)上調(diào)表達，表明AaPDEL和AaPDEH參與了疏水介質(zhì)誘導A.alternata附著胞形成的調(diào)控作用，這與申珅等[13]研究S.turcica中StL-PDE主要參與分生孢子發(fā)育，StH-PDE在附著胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的結果不一致，表明磷酸二酯酶PDEL和PDEH在不同真菌中的調(diào)控作用具有物種特異性。同時本研究發(fā)現(xiàn)在附著胞形成階段，AaPDEH表達量高于AaPDEL，表明AaPDEH在附著孢形成階段發(fā)揮更重要的調(diào)控作用，該結果與前人研究一致[38]，在B.cinerea中，高親和力磷酸二酯酶BcPDEH在生長、分化和毒力等方面的調(diào)控作用要比低親和力磷酸二酯酶BcPDEL更明顯。在M.oryzae中，MoPDEH在分生孢子萌發(fā)、附著胞和侵染菌絲形成階段均上調(diào)表達，在調(diào)節(jié)cAMP水平和致病性方面起主導作用，而MoPDEL無明顯功能[16]。綜上，AaPDEL和AaPDEH均參與了疏水誘導A.alternata侵染結構分化的調(diào)控，其中AaPDEH的調(diào)控作用更明顯，但其調(diào)控的分子機制尚需進一步揭示。

4 結論

本研究從梨果黑斑病菌克隆得到AaPDEL和AaPDEH基因，利用生物信息學分析了該基因編碼蛋白保守結構域、信號肽、跨膜區(qū)結構以及亞細胞定位等。同時qRT-PCR分析表明，在疏水性誘導條件下，AaPDEL和AaPDEH在A.alternata附著胞形成時期上調(diào)表達，其中AaPDEH調(diào)控作用更為明顯，表明AaPDE參與了梨果黑斑病菌侵染結構分化的調(diào)控。該結果為進一步通過分子水平揭示PDE基因的功能及其調(diào)控梨果黑斑病菌侵染結構分化的機制提供理論依據(jù)。