大蔥伴生甜瓜栽培對(duì)根際土壤酶活性和細(xì)菌群落的影響

倪 棟 陳應(yīng)素 李 爽 湯雨凡 劉翔毓 殷 樂 周艷麗,*

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)教研基地管理處，吉林 長(zhǎng)春 130118； 3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；4 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

甜瓜(CucumismelonL.)是一種高營養(yǎng)價(jià)值、高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，近年來成為吉林省夏季日光溫室和塑料大棚主栽經(jīng)濟(jì)作物之一，然而栽培地未經(jīng)科學(xué)規(guī)劃、過度利用以及濫用農(nóng)藥、肥料等[1]，導(dǎo)致甜瓜根際土壤的微生態(tài)環(huán)境惡化，嚴(yán)重影響了甜瓜的生長(zhǎng)發(fā)育，使甜瓜品質(zhì)下降并且大幅減產(chǎn)。因此，當(dāng)務(wù)之急是解決甜瓜生產(chǎn)困境。目前，基于綠色、可持續(xù)發(fā)展的理念，在生產(chǎn)上常利用化感作用進(jìn)行不同植物間栽培，以期達(dá)到綠色有機(jī)生產(chǎn)的目的。伴生栽培是在園藝生產(chǎn)中常見的一種以收獲主栽作物為目的的特殊間作模式。

伴生栽培是將2種或2種以上生長(zhǎng)季節(jié)相近或相似的作物按一定比例分行或分帶種植在同一田地上的一種精耕細(xì)作、集約化種植的傳統(tǒng)技術(shù)[2-3]。夏秀波等[4]研究證明大蔥伴生能夠促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)，延緩葉片衰老；有研究證明分蘗洋蔥伴生能夠提高番茄根際土壤微生物的多樣性，并且能夠增強(qiáng)植株的抗病能力[5-6]。蔥蒜類蔬菜因具有獨(dú)特的抑菌特性和田間土壤生態(tài)環(huán)境改良效應(yīng)，現(xiàn)已受到越來越多的重視，目前對(duì)蔥蒜類蔬菜的開發(fā)和利用也逐漸走向多元化。通過近年針對(duì)大蒜(AlliumsativumL.)[7-8]、分蘗洋蔥(AlliumcepaL.)[9-10]和大蔥(AlliumfistulosumL.)[4]緩解土壤連作障礙的研究發(fā)現(xiàn)，主栽作物分別與這3種作物輪作、間作、套作、伴生、填閑等栽培方式，不僅可以增加地上部的物種多樣性[11]，而且可以通過根系分泌物對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境起到調(diào)控作用，進(jìn)而抑制病原微生物的生長(zhǎng)[12]，促進(jìn)幼苗植株生長(zhǎng)。

土壤微生態(tài)環(huán)境的變化情況直觀反映了伴生栽培的作用。微生物能對(duì)土壤中的生物殘?bào)w[13]及有機(jī)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、水解，同時(shí)對(duì)土壤養(yǎng)分的增加有促進(jìn)作用，是土壤中最活躍的部分之一[14]。研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)的組成是反映土壤中物質(zhì)代謝旺盛程度的重要指標(biāo)之一[15]。細(xì)菌是構(gòu)成土壤微生物的主要生物量之一，占整個(gè)土壤微生物群落的70%～90%，并且在維護(hù)土壤健康、拮抗土傳病害等方面做出了積極貢獻(xiàn)[16]。細(xì)菌在土壤中發(fā)揮的重要作用直接體現(xiàn)在土壤的肥力狀況上[17]，并最終影響植物的生長(zhǎng)[18]。土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)[19]等方面的初期研究大多采用的較早的生物技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳(pcr-denaturinGGradienTGel electrophoresis，PCR-DGGE)技術(shù)[19]、Biology技術(shù)[20]，僅能檢測(cè)土壤微生物的優(yōu)勢(shì)菌落，而無法檢出組成占比低的微生物。隨著現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)的推廣及應(yīng)用，土壤微生物中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種及部分未知物種都可以被檢測(cè)出來[21]。為此，本試驗(yàn)基于土壤農(nóng)化性質(zhì)測(cè)定、土壤酶測(cè)定、高通量測(cè)序方法，分析大蔥伴生栽培對(duì)甜瓜根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)階段變化的影響，綜合評(píng)價(jià)根際土壤農(nóng)化、酶活性與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的互作效應(yīng)，并通過后期對(duì)甜瓜果實(shí)進(jìn)行測(cè)產(chǎn)來驗(yàn)證伴生栽培的效果，以期為建立適合甜瓜持續(xù)適效的栽培模式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

供試材料薄皮甜瓜品種為景路甜蜜王，大蔥品種為普威長(zhǎng)夏，均購自吉林省長(zhǎng)春市種子市場(chǎng)。試驗(yàn)于2020年6月至12月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地(125°27′E，43°46′N)進(jìn)行，栽培土壤類型是黑壤土，其養(yǎng)分性狀：pH值7.02，有機(jī)質(zhì)58.35 g·kg-1，堿解氮99.47 mg·kg-1，速效磷201.24 mg·kg-1， 速效鉀701.25 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別記作DZ1、BS1、DZ3、BS3，詳見表1。于2020年6月18日，將溫室原土和商品雞糞按9∶1的比例攪拌均勻裝盆，然后將5株株高20 cm的蔥沿著26 cm×21 cm營養(yǎng)缽的邊緣均勻地移栽到盆中。6月20日直播甜瓜種子于營養(yǎng)缽的中心位置，每盆3粒。營養(yǎng)缽按照45 cm×90 cm的株行距半埋在溫室內(nèi)。在甜瓜兩葉一心時(shí)進(jìn)行間苗，選留一株健壯秧苗，5～6片真葉時(shí)去掉主蔓生長(zhǎng)點(diǎn)，選留兩條長(zhǎng)勢(shì)一致的子蔓，抹掉孫蔓側(cè)芽，吊蔓栽培，分別在第7和第15節(jié)留瓜，每條子蔓留兩瓜，每株四瓜，待子蔓生長(zhǎng)至20片葉時(shí)摘心，常規(guī)田間管理。栽培期間追肥一次，在果膨大期隨水施入磷鉀復(fù)合肥，施入量為每盆12 g。本試驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)置30盆，4個(gè)處理共120盆。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 TesTTreatment

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)測(cè)定 在2020年9月18日(播種90 d后)采收甜瓜果實(shí)。甜瓜果實(shí)硬度采用FT-327水果硬度計(jì)(北京金科利達(dá)電子科技有限公司)測(cè)定；可溶性固形物采用MHY-22747手持式糖量計(jì)(北京美華儀科技有限公司)測(cè)定；根據(jù)平均單果重、單株結(jié)瓜數(shù)和栽培密度統(tǒng)計(jì)單株產(chǎn)量和畝產(chǎn)。

1.3.2 土壤性質(zhì)測(cè)定 分別于2020年7月30日(播種40 d后)和2020年9月8日(播種80 d后)采用抖根法[22]采集土樣，每個(gè)處理隨機(jī)選取5盆，取土壤表層下15 cm的土樣，約200 g。樣品采集后仔細(xì)去除新鮮土樣中可見的植物殘?bào)w及其他雜質(zhì)，將其中部分土放入無菌離心管中，置于液氮內(nèi)速凍，然后置于-80℃ 超低溫冰箱中保存，用于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析；另一部分土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干后過100目篩，用作測(cè)定土壤農(nóng)化理化及土壤酶活性。

土壤農(nóng)化性質(zhì)測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》[23]。土壤pH值采用F-74酸度計(jì)(日本HORIBA)測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀消煮容量法測(cè)定；土壤堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；土壤速效磷含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤速效鉀含量采用火焰光度法測(cè)定。

土壤酶活性測(cè)定參照《土壤酶及其研究法》[24]。土壤脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定；土壤酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定；土壤過氧化氫酶活性采用比色法測(cè)定。土壤漆酶活性采用活性光度法測(cè)定[25]。

土壤細(xì)菌群落檢測(cè)土樣送于諾禾生物科技有限公司并基于高通量測(cè)序技術(shù)完成細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。利用諾禾生物科技公司提供的Novomagic云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行根際土壤細(xì)菌多樣性分析，構(gòu)建物種組成群落圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)的多重比較使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 伴生對(duì)甜瓜果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)的影響

伴生對(duì)甜瓜果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的影響見表2。伴生處理與單作處理的甜瓜果實(shí)可溶性固形物含量、果實(shí)硬度均無顯著差異；伴生處理的單果重、單株產(chǎn)量以及畝產(chǎn)均顯著高于單作處理，伴生處理單果重和畝產(chǎn)分別較單作增加13.1%和12.7%。整體來看，伴生栽培可以促進(jìn)甜瓜生長(zhǎng)，進(jìn)而增加單果重及產(chǎn)量。

表2 伴生對(duì)甜瓜果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of companion on fruit quality and yield of muskmelon

2.2 伴生對(duì)根際土壤農(nóng)化性質(zhì)及土壤酶活性的影響

由表3可知，播種40 d后，伴生處理土壤的pH值、有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量、速效鉀含量均低于單作處理，速效磷含量高于單作處理；另外，伴生處理的土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、漆酶活性均高于單作處理，其中脲酶和漆酶活性差異達(dá)顯著水平。播種80 d后，伴生處理的土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、速效磷含量高于單作處理，其中速效磷含量顯著高于單作處理，而堿解氮、速效鉀含量則顯著低于單作處理；此外，伴生處理的土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、漆酶活性均顯著高于單作處理。

表3 不同處理的土壤農(nóng)化性質(zhì)和土壤酶活性Table 3 Soil agrochemical properties and soil enzyme activities of the soil treated with different ways

2.3 伴生對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 根際土壤細(xì)菌多樣性分析 伴生對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響見表4。隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)，伴生處理土壤細(xì)菌的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)整體呈降低趨勢(shì)。播種80 d后伴生處理的Shannon指數(shù)顯著小于播種40 d后的單作和伴生處理，表明大蔥伴生顯著減少了根際土壤細(xì)菌的數(shù)量，另外播種80 d后伴生處理的Simpson指數(shù)在所有處理中最低，表明伴生后期土壤細(xì)菌多樣性增加。本次測(cè)序各樣本文庫的覆蓋率均達(dá)98%以上，結(jié)果可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

表4 伴生處理根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)分析Table 4 Analysis of microbial diversity index in the soil samples with differenTCoverinGTreatments

花瓣圖主要用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的可操作性分類單元(operational taxonanic units，OTU)數(shù)量。由圖1可知，播種40 d后伴生處理和單作處理根際土壤中特有的細(xì)菌OUT數(shù)量是593、656，總OUT數(shù)量是3 724、3 787；播種80 d后伴生處理、單作處理特有的細(xì)菌OUT數(shù)量是432、454，總OUT數(shù)量是3 563、3 585。 共有的細(xì)菌OUT數(shù)量為3 131。

圖1 細(xì)菌OTU分類水平花瓣圖Fig.1 Diagram of Venn on OTU level of bacteria in different seedlings

2.3.2 根際土壤細(xì)菌OTU水平的主成分分析 圖2是從測(cè)序結(jié)果中提取出主成分(最主要的元素和結(jié)構(gòu))，通過一系列特征值和特征向量排序進(jìn)行的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)。樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。由圖2可知，第一主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)率為36.63%，第二主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)率為24.51%。每個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)相似度較高，樣品傾向于聚集在一起，播種80 d后伴生處理的土壤樣本與其他樣本菌落組成結(jié)構(gòu)差異最大，且其細(xì)菌菌落組成結(jié)構(gòu)差異最小。因此，播種80 d后伴生處理對(duì)土壤細(xì)菌群落組成有顯著正相關(guān)影響。

2.3.3 根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)分析 圖3展示了4個(gè)根際土壤樣本中門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，4個(gè)根際土壤樣本中共有的主要細(xì)菌門有12個(gè)，其中變形菌門(Proteobacteria)占比最高，分別是33.07%、34.25%、32.31%、35.73%，而且播種40和80 d后單作處理土壤樣本的變形菌門、未名菌門(unidentified_Bacteria)、酸桿菌門(Acidobacterio)相對(duì)豐度均大于10%，播種40和80 d后伴生處理土壤樣本中只有變形菌門和未名菌門的相對(duì)豐度大于10%。

圖2 細(xì)菌OTU水平下PCoA圖Fig.2 The PCoA map of bacterial OTU level

圖4展示了4個(gè)根際土壤樣本中屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，4個(gè)根際土壤樣本中共有的主要細(xì)菌屬有11個(gè)，包括鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、拉爾斯頓菌屬(Ralstonia)、RB41、MND1、芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、桿菌屬(Bryobacter)、類固醇桿菌(Steroidobacter)、蓋埃拉菌屬(Gaiella)、黃桿菌屬(Flavisolibacter)、哈良草菌屬(Haliangium)，而且播種80 d后伴生處理的土壤樣本中鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)的占比達(dá)到11.90%，高于其他3個(gè)土壤樣本。

圖3 細(xì)菌門分類水平結(jié)構(gòu)分布圖Fig.3 The bacterial structure distribution aTThe phylum level

圖4 細(xì)菌屬分類水平結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 The bacterial structure distribution aTThe genus level

2.3.4 根際土壤細(xì)菌菌落與土壤農(nóng)化性質(zhì)、土壤酶活性的相關(guān)關(guān)系 由圖5可知，鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)與漆酶和脲酶活性呈顯著正相關(guān)，與速效鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；拉爾斯頓菌屬(Ralstonia)和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)；RB41與漆酶、脲酶、蔗糖酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；芽孢桿菌屬(Bacillus)和速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)；芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和速效鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)、桿菌屬(Bryobacter)與pH值、速效鉀含量呈顯著正相關(guān)；類固醇桿菌(Steroidobacter)和速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)；蓋埃拉菌屬(Gaiella)和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。

注：AK：速效鉀含量；AP：速效磷含量；AN：堿解氮含量；OM：有機(jī)質(zhì)含量；L：漆酶活性；CAT：過氧化氫酶活性；ACP：酸性磷酸 酶活性；UE：脲酶活性；SC：蔗糖酶活性。Note: AK: Available K content. AP: Available P content. AN: Hydrolyzable N content. OM: Organic matter content. L: Laccase activity. CAT: Catalase activity. ACP: Acid phosphatase activity. UE: Urease activity. SC: Invertase activity.圖5 根際土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性Fig.5 Correlation heat map of soil bacterial community and environmental factors

3 討論

與單作處理相比，伴生后根際土壤中有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效鉀含量均呈降低趨勢(shì)，且隨著伴生時(shí)間的延長(zhǎng)，降低程度變緩，降低的原因可能是伴生大蔥與甜瓜競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分，后期出現(xiàn)變緩趨勢(shì)可能是通過伴生促進(jìn)了土壤中原有養(yǎng)分的釋放，使土壤中的養(yǎng)分達(dá)到平衡狀態(tài)，這與趙曉翠[3]在甘藍(lán)伴生黃瓜研究中的結(jié)論相似。另外，在本研究中，接種80 d后伴生處理土壤中脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶和漆酶活性總體顯著高于單作，表明伴生栽培后顯著提高了土壤酶活性，原因可能是通過伴生栽培造成了微生物互作，繼而活化了根際微生物的生命活動(dòng)，進(jìn)而提高了土壤酶活性，改變了土壤的養(yǎng)分含量，這與孟亞利等[26]在棉麥共生研究中的結(jié)果大致相符。但關(guān)于根際土壤中各項(xiàng)理化指標(biāo)和各類酶活性與植物體內(nèi)的養(yǎng)分傳送和轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生理生化狀況的具體關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性在維持生態(tài)系統(tǒng)功能上有著重要作用[27]。本研究結(jié)果表明，大蔥伴生栽培后減少甜瓜根際土壤細(xì)菌數(shù)量，這與夏秀波等[28]在大蔥伴生黃瓜上的研究結(jié)果相似；另外伴生栽培后增加了土壤細(xì)菌多樣性，改變了甜瓜根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在細(xì)菌門水平上，變形菌門占比最高，并且伴生處理變形菌門的相對(duì)豐度高于單作處理。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)變形菌門與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，這與本研究結(jié)果趨勢(shì)大致相符，伴生栽培后期由于變形菌門豐度增加促進(jìn)了土壤有機(jī)質(zhì)含量的少量增加。酸桿菌門具有嗜酸性，其豐度受pH值影響[30]，土壤pH值降低有利于其生長(zhǎng)[31]，因此伴生栽培后酸桿菌門豐度增加。在細(xì)菌屬水平上，鞘脂單胞菌屬為4個(gè)根際土壤樣本的共同優(yōu)勢(shì)菌群。鞘脂單胞菌屬是一類豐富的新型細(xì)菌資源，可用于芳香化合物的生物降解[32]，進(jìn)一步研究表明該菌屬在農(nóng)業(yè)中也有廣泛應(yīng)用[33]，對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯、五氯苯酚和除蟲菊酯[34]等三類農(nóng)藥具有較好的降解能力，同時(shí)對(duì)其他一些農(nóng)藥的降解也有良好效果[35]。鞘脂單胞菌屬作為一種有益菌屬，在解決甜瓜栽培地農(nóng)藥殘留方面起到了積極作用。另有研究發(fā)現(xiàn)旱地中有機(jī)磷微生物主要是芽孢桿菌屬[36]。本研究中伴生栽培后增加了芽孢桿菌屬豐度，從而使根際土壤中速效磷含量提高，這與林啟美等[37]研究結(jié)果相符。正是由于這些有益菌屬的豐度增加改良了土壤生態(tài)環(huán)境。

通過對(duì)甜瓜測(cè)產(chǎn)得出伴生栽培后甜瓜單果重比單作栽培增加13.10%，推算得出畝產(chǎn)增加12.70%。這與前人研究結(jié)果一致，徐蕾[38]發(fā)現(xiàn)大蔥套作白菜的白菜鮮重較單作增加了35.71%；夏秀波等[4]在大蔥伴生番茄栽培試驗(yàn)中，大蔥伴生番茄處理較番茄單作增產(chǎn)8.30%；李培穎等[39]在小麥伴生栽培黃瓜中，伴生處理產(chǎn)量比單作提高了4.7%。伴生處理后，甜瓜產(chǎn)量增加可以佐證大蔥伴生栽培甜瓜模式是有效的、可供推廣的栽培模式。

4 結(jié)論

本研究以大蔥伴生栽培甜瓜后，對(duì)伴生栽培土壤的農(nóng)化性質(zhì)、土壤酶活性和高通量測(cè)序結(jié)果分析，得出伴生后土壤農(nóng)化性質(zhì)改變、土壤酶活性增加、土壤中有益菌豐度增加，進(jìn)而增加甜瓜產(chǎn)量。接種80 d后大蔥伴生栽培土壤的pH值、有機(jī)質(zhì)含量高于單作，速效磷含量顯著高于單作；脲酶、蔗糖酶、漆酶等土壤酶活性均顯著高于單作；在門水平上變形菌門(Proteobacteria)等有益細(xì)菌門相對(duì)豐度增加；在屬水平上鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等有益菌屬相對(duì)豐度增加；相關(guān)性分析表明，土壤細(xì)菌與土壤脲酶、土壤漆酶活性、pH值、速效鉀含量有顯著相關(guān)性。表明大蔥伴生栽培甜瓜模式為解決甜瓜根際土壤的微生態(tài)環(huán)境惡化導(dǎo)致的大幅減產(chǎn)問題提供了參考。