菊花菌核病病原菌鑒定、抗性篩選與防治

楊順超 劉 曄 蔣甲福 陳素梅 陳發(fā)棣 管志勇 房偉民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計重點實驗室/ 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)，多年生草本植物，原產(chǎn)于我國，與月季、香石竹和唐菖蒲并稱四大切花，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值[1]。隨著菊花生產(chǎn)規(guī)模的擴大，優(yōu)異種質(zhì)資源篩選不足、育種技術(shù)滯后、病蟲害現(xiàn)象增多等問題逐漸凸顯，嚴(yán)重制約著菊花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

目前有研究報道，造成植物菌核病的病原菌為子囊菌亞門核盤屬真菌[3]。該屬真菌能造成多種植物病害，寄主廣泛，在我國的寄主多達兩百余種，其中以十字花科、菊科、豆科等植物為主，如大白菜菌核病[4]、大豆菌核病[5]、向日葵菌核病[6]及桑葚肥大性菌核病[7]等。2003年有研究報道菊花菌核病是由核盤菌引起[8]。2011年，在菊花上發(fā)現(xiàn)另一種疑似核盤菌引起的病害，經(jīng)研究確定為齊整小核菌，也稱羅爾夫式菌核菌，同樣會引起菊花的莖葉浸水狀腐爛或枯萎[9]。由核盤菌引起的菊花菌核病，常發(fā)生在季節(jié)交替的高濕環(huán)境下，其適應(yīng)極強、傳播范圍廣，能隨著水流、空氣、昆蟲和人類衣物被帶到各處，防控難度大，造成巨大的經(jīng)濟損失[10]。有植株受到感染后，若處理不當(dāng)，病情會迅速擴展，同時病原菌會產(chǎn)生草酸等次生代謝產(chǎn)物，造成危害[11]。我國關(guān)于核盤菌引起菊花菌核病的報道相對較少，防治也以加強田間管理與使用廣譜型殺菌劑為主，存在一定的局限性。

種質(zhì)資源抗病性是植物育種工作的基礎(chǔ)，對于推動新品種選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義[12]。此外，越來越多的新型殺菌劑被研究報道，相比傳統(tǒng)殺菌劑效果更好、毒性更小、成本更低，如植物源類殺菌劑[13]、酰胺類殺菌劑[14]和吡咯類殺菌劑[15]。但是這些新型殺菌劑對菊花菌核病的應(yīng)用濃度和防控效果均未知，與傳統(tǒng)殺菌劑的差異也鮮有研究。因此，本研究通過病原菌的分離提取、形態(tài)學(xué)觀察以及核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-Internal transcribed space, rDNA-ITS)測序等方法對該病害進行鑒定，并對病原菌的生物學(xué)特性進行初步觀察，對33份菊花品種進行抗病性篩選，選取7種不同殺菌劑進行防治試驗，以期為菊花病害診斷、防治和抗病機制等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試病樣及植株：發(fā)病植株(品種為神馬)采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湖熟基地菊花資源保存中心，分離獲得菌株Cm-H。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；查彼培養(yǎng)基(Czapek)：MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO441 g、KCl 0.5 g、NaNO30.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、 蔗糖25 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimal medium, MM)：K2HPO41.74 g、KH2PO41.36 g、(NH4)2SO40.53 g、NaCl 0.15 g、 MgSO4·7H2O 0.49 g、CaCl2·2H2O 0.07 g、FeSO41.368 mg、葡萄糖1.8 g、瓊脂20 g、蒸餾水100 mL；酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose, YEPD)：蛋白胨10 g、酵母粉3 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；瓊脂水培養(yǎng)基(agar water, AW)：瓊脂200 g、蒸餾水1 000 mL。

殺菌劑：75%百菌清粉劑，浙江利民化工有限公司；8%寧南霉素藥劑，黑龍江德強生物有限公司；3%甲霜靈藥劑，河北中保綠農(nóng)有限公司；嘧菌酯藥劑，先正達(中國)有限公司；42.4%氟酰胺藥劑，德國巴斯夫歐洲公司；43%肟菌酯藥劑，德國拜耳股份公司；10%苯醚甲環(huán)唑粉劑，先正達(中國)有限公司。

試劑：真菌DNA快速提取試劑盒由美國OMEGA BIOTEK公司提供；試驗中使用的試劑藥品等由南京壽德生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離 參照董漢松[16]的組織分離法略作修改。將保存的病株進行表面清理，除去雜質(zhì)和泥土等，在超凈工作臺中，從菊花莖部病健交界處切取直徑約5 mm小組織塊，在75%乙醇溶液中浸泡30 s，再用10%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，然后用滅菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干后接種到PDA培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)。長出菌落后，挑取菌落邊緣少許菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基中，挑取單菌落進行菌株的純化培養(yǎng)，得到純化后的菌株放置于4℃冰箱作為菌種保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上，3～10 d后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的大小與形態(tài)特征，1個月后于體式顯微鏡下觀察形成的菌核；將菌核在4℃低溫保存2～3個月后取出放置于無菌脫脂棉或無菌細(xì)砂上，于25℃培養(yǎng)10～20 d，觀察菌核萌發(fā)狀態(tài)。

分子鑒定：培養(yǎng)7 d后，收集菌絲，按照真菌提取試劑盒提取病原菌DNA后，在PCR儀(艾本德中國有限公司，上海)中進行18S rDNA-ITS PCR序列擴增，引物序列為ITS1-F：5′-C TTGGTCATT T AGAGGAAGT AA-3′，ITS4: 5′-TCCTCCGC TT ATTGAT ATGC-3′[17]。PCR反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA 1 μL，引物ITS1-F/ITS4 [10 μmol·L-1，通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司]各2 μL， dNTP [10 mmol·L-1，通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司] 2 μL，10× Buffer [含Mg2+，通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司] 8 μL，Taq DNA polymerase [5 U·μL-1， 普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司] 0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min[18]。后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將回收產(chǎn)物送南京思普金生物科技有限公司測序。得到序列后在NCBI的Genbank中進行BLAST比對，從對比結(jié)果中選取相關(guān)菌株的序列，用MEGA7.0采用鄰接法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。得到序列后在NCBI中進行Blastn比對，從對比結(jié)果中選取相關(guān)菌株的序列，用MEGA7.0采用鄰接法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 病原菌致病力測定 將分離的病原菌培養(yǎng)在馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(potato dertrose agar, PPW)培養(yǎng)基中于25℃搖床搖菌5 d后，用1 mL移液槍吸取0.5 mL菌絲懸浮液于無菌培養(yǎng)皿中，用毛筆或鑷子挑出培養(yǎng)皿中的菌絲，接種到供試菊花葉片上(接種葉片為從菊花頂端向下第4或第5片大小形態(tài)相一致的真葉)，重復(fù)3次，每次3株，接種后套袋2 d，觀察統(tǒng)計發(fā)病情況，PDW培養(yǎng)基作對照。

待植株發(fā)病后，觀察發(fā)病癥狀，并重新提取發(fā)病植株的病原菌，進行分離純化，鑒定方法同第一次。確定是否與最初分離到的病原菌一致，若一致，則表明該病原菌是該病害的致病菌；若不一致，再重復(fù)1～2次，仍不一致則確定不是同一種致病菌或致病菌分離錯誤。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性測定 不同培養(yǎng)基對該病原菌生長的影響：用直徑5 mm打孔器取培養(yǎng)5 d的菌落邊緣菌塊，分別轉(zhuǎn)接到PDA、MM、YEPD和Czapek培養(yǎng)基上，以AW培養(yǎng)基做對照，28℃培養(yǎng)3 d后，用十字交叉法測量菌落直徑(以下菌落直徑測量方法相同)。

不同溫度對病原菌生長的影響：將菌塊接種在PDA培養(yǎng)基上后，置于恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱的溫度分別為5、15、20、25、30、35和40℃，培養(yǎng)3 d，測量菌落直徑。

不同pH值對病原菌菌絲生長的影響：用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)成5、6、7、8、9和10共6個梯度，轉(zhuǎn)接菌塊培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)3 d后，測量菌落直徑。

不同氮源和碳源對菌絲生長的影響：用蔗糖、果糖或乳糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，用氯化銨、硝酸鈉、蛋白胨或甘氨酸替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硫酸銨，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照，28℃培養(yǎng)3 d后，測量菌落直徑。

1.2.5 不同菊花材料抗性鑒定 活體接種：選取長勢一致無病蟲害的菊花材料進行試驗。將培養(yǎng)好的菌絲懸浮液取出(菌絲懸浮液培養(yǎng)方法同致病力測定)，吸取0.5 mL于干凈的培養(yǎng)皿中，用毛筆或鑷子等將菌絲聚集成團，置于葉片靠中間部位，避開主脈以防接觸不均勻。將大小適中的自封袋套住菊花葉片置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(若恒溫培養(yǎng)箱可以控制濕度在80%以上則無需套用自封袋)，白天溫度設(shè)置為25℃，夜間溫度設(shè)置為22℃，光周期設(shè)置為16 h光照，8 h黑暗，相對濕度保持在70%～80%。

離體接種：準(zhǔn)備干凈的培養(yǎng)皿，其中鋪平一層脫脂棉，再蓋一層濾紙，加適量無菌水使培養(yǎng)皿處于濕潤狀態(tài)。取菊花相同部位葉片洗凈放置于培養(yǎng)皿中。菌絲接種方法同上，接種后將培養(yǎng)皿放置于恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置同上。

病情統(tǒng)計方法：以葉片感染程度分為0～4級統(tǒng)計發(fā)病情況。病級：0級：葉片健康，無病癥；1級：葉片病斑面積占比0～1/4；2級：葉片病斑面積占比1/4～1/2； 3級：葉片病斑面積占比1/2～3/4；4級：葉片病斑面積占比3/4～整片葉。病情指數(shù)(disease severity index, DSI)的計算公式如下:

DSI=[∑(病級×病級數(shù)值)/(接種苗數(shù)×最高病級數(shù)值)]×100%

(1)。

抗性水平：抗病(resistant R)：DSI≤25%；中抗(moderately resistant MR)：25%

1.2.6 不同殺菌劑毒力測定與病害防治 選取7個殺菌劑分別配置成5個濃度梯度的PDA培養(yǎng)基平板：1 000、500、250、125和50 mg·L-1，無菌水作為對照。用直徑5 mm打孔器，取培養(yǎng)5 d病原菌菌塊，轉(zhuǎn)移到含殺菌劑的培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 d后利用十字交叉法測定不同處理的菌落直徑，每個處理3組，每組5個重復(fù)。

病原菌抑制率=(對照組平均菌落直徑-處理組平均菌落直徑)/對照組平均菌落直徑×100%

(2)

將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果輸入SPSS分析軟件，利用Probit模型分析得到毒力方程，查表得到半數(shù)效應(yīng)濃度EC50與相關(guān)系數(shù)R2值。

選用神馬品種進行殺菌劑防治試驗，采用活體接種，方法同上。在病害接種后24 h分別噴施7種殺菌劑，濃度為100 mg·L-1，每個處理3組，每組5株，利用十字交叉法統(tǒng)計病斑直徑。按照公式計算病害防治效果：

病害防治效果=(對照組平均病斑直徑-處理組平均病斑直徑)/對照組平均病斑直徑×100%

(3)

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2010、MEGA 7.0和SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理，應(yīng)用鄧肯氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花菌核病田間病害特征

在田間自然條件下，菊花植株的根、莖、葉、花都有可能受到感染。菊花感染菌核病后，感染部位會出現(xiàn)水漬狀病斑，在適宜的溫濕度條件下，病斑迅速擴展，潮濕環(huán)境下則會出現(xiàn)白色霉層，病部軟腐霉?fàn)€，菌絲聚集成團，逐漸變?yōu)榛野咨?，后期可形成鼠糞狀黑色菌核，整株枯萎腐爛(圖1)。菊花的整個生長期內(nèi)都有可能發(fā)生菌核病，其中春秋季為發(fā)病高峰期，菊花栽培密度過大時極易出現(xiàn)成片感染。

2.2 菊花菌核病病原菌的致病力測定

將分離得到的菌株Cm-H進行回接，接種24 h后，葉片接種部位腐爛變褐，向外圈擴展，48～72 h后出現(xiàn)白色霉層聚集，葉片腐爛，病斑向其他部位擴展，與自然條件下的癥狀相同。未接種的葉片無明顯癥狀。再次分離鑒定接種后的病株，得到的病原菌與原菌株Cm-H 相同(圖2)。由科赫法則可以證明，分離得到的病原菌Cm-H可以侵染菊花造成病害，是菊花菌核病的致病菌。

注：a：莖感染癥狀；b：花感染癥狀；c：全株感染癥狀。Note：a: Symptoms of stem infection. b: Symptoms of flower infection. c: Symptoms of whole plant infection.圖1 菊花菌核病癥狀Fig.1 Symptoms of chrysanthemum S. sclerotiorum

注：a：菊花接種菌核病病原菌后72 h癥狀；b：對照。Note：a: Symptoms of chrysanthemum inoculated with S. sclerotiorum pathogen for 72 hours. b: Control.圖2 菊花菌核病致病性測定Fig.2 Determination of pathogenicity of chrysanthemum S. sclerotiorum

2.3 菊花菌核病病原菌形態(tài)學(xué)特征

注：a：菌落反面形態(tài)；b：菌落正面形態(tài)；c：孢子；d：孢子梗；e：菌核；f：菌核萌發(fā)。Note：a: Colony morphology aTThe contrary side. b: Colony morphology aTThe positive side. c: Spore. d: Sporophore. e: Sclerotium. f: Sclerotium germination.圖3 菊花菌核病病原菌的形態(tài)特征Fig.3 The morphological characteristics of the pathogen of chrysanthemum S. sclerotiorum

由菊花病株分離得到菌株Cm-H，在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)后，菌落呈圓形擴展，生長迅速。初期菌落呈現(xiàn)白色，中心區(qū)域較稀疏，邊緣較密集，3～5 d后菌絲開始變成灰白色，7 d后菌落變成灰褐色，中間和邊緣出現(xiàn)菌絲聚集，15～20 d后形成大小不一的黑色菌核。菌絲體寬3～8 μm，近無色透明，交錯生長。菌核褐色或黑色，直徑(0.5～1.0)×(4.0～5.0) cm，萌發(fā)時長出多個子囊盤，最長可至5～7 cm；孢子(5～8)×(2～4) μm，橢圓形或近圓形(圖3)。根據(jù)該病原菌的形態(tài)學(xué)特征初步將其鑒定為核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)。

2.4 菊花菌核病分子學(xué)鑒定

對分離得到的病原菌Cm-H進行DNA提取后，采用18S rDNA ITS PCR進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條550 bp左右的清晰亮帶(圖4-a)。將得到的序列結(jié)果與NCBI中的核酸序列進行Blastn比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，該病原菌序列與核盤菌WB15(MH201315.1)的同源性達到了98%(圖4-b)。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征、病害癥狀、ITS序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育樹，最終將該病原菌鑒定為子囊菌亞門核盤菌屬核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)。

2.5 菊花菌核病病原菌的生物學(xué)特性

菌株Cm-H在供試的5種培養(yǎng)基上均可生長，但差異顯著(圖5-A)。在完全培養(yǎng)基YEPD上菌株生長最快，菌落直徑79.33 mm；半完全培養(yǎng)基PDA次之，菌落直徑達到63.50 mm；菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基MM上與對照相比差異不顯著；Czapek上菌株生長最慢，為6.50 mm。由此表明，YEPD培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基更適合菌株Cm-H的生長。

注：a：ITS目的基因片段PCR檢測結(jié)果；M：Maker 2000；1：病原菌H；2：病原菌H的重復(fù)； b：基于18S rDNA-ITS PCR序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。Note：a: PCR detection results of ITS targeTGene. M: Maker 2000. 1: Pathogen H. 2: Duplication of pathogen H. b: Phylogenetic tree based on 18S rDNA-ITS PCR sequences.圖4 菊花菌核病病原菌分子鑒定Fig.4 Molecular identification of the pathogen of Chrysanthemum S. sclerotiorum

菌株Cm-H在5～40℃之間均可生長(圖5-B)。在20～30℃下生長較快，菌落直徑達到53.80～59.15 mm；15和35℃時生長減緩，分別為34.50和22.70 mm；5和40℃時菌落生受到顯著抑制，菌落直徑6.21和4.35 mm，但無致死作用。表明菌株Cm-H的最適生長溫度范圍為20～30℃，溫度過高或過低都會抑制該病原菌的生長。

注：不同小寫字母表示在P<0.05水平上有顯著性差異。Note: Different lowercase letters indicate the significant difference at 0.05 level, respectively.圖5 培養(yǎng)基(A)、溫度(B)、pH(C)、碳源(D)和氮源(E)對核盤菌菌落生長的影響Fig.5 Effect of medium(A), temperature(B), pH(C), carbon source(D) and nitrogen source(E) on colony growth of S. sclerotiorum

在值pH 5～10的范圍內(nèi)，菌株Cm-H都能生長(圖5-C)。在pH值5～7時，菌落直徑無顯著差異，菌落直徑為47.50～48.17 mm；pH值小于4時培養(yǎng)基不凝固，無法測量；pH值為8～10時，菌絲生長受到抑制，菌落直徑最低，為30.12 mm，顯著低于pH 5.0～7.0。表明菌株Cm-H適宜在中性及偏酸性環(huán)境條件下生長，pH過高會顯著抑制菌絲的生長。

菌株Cm-H在供試5種不同碳源培養(yǎng)基中均可生長，且生長差異不顯著(圖5-D)。生長最快的是以果糖為碳源的培養(yǎng)基，菌落直徑達24.13 mm；生長最慢的以葡萄糖為碳源的MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菌落直徑達到20.50 mm。表明該菌株生長對碳源的要求不嚴(yán)格。

菌株Cm-H在供試5種不同氮源培養(yǎng)基中亦可以正常生長(圖5-E)。以蛋白胨為氮源時生長最好，菌落直徑達到19.70 mm；甘氨酸為氮源時生長最差，菌落直徑為16.00 mm，表明該菌株在以有機氮為主的蛋白胨培養(yǎng)基下較適宜生長。

2.6 33份菊花材料的抗性篩選

選取33個切花菊品種分別進行活體與離體的接種試驗，用以對比離體條件下進行品種的大量抗性篩選時的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選的33個切花菊品種中，有6個品種(占比18.18%)表現(xiàn)為中抗，病情指數(shù)從小到大排名前三位的是南農(nóng)金鸝、南農(nóng)芝士和南農(nóng)錦衣，病情指數(shù)分別為26.86、27.93和43.96；13個切花菊品種(占比39.39%)為中感，其中病情指數(shù)最高的為南農(nóng)霧松，最低的為南農(nóng)冰潔，病情指數(shù)分別為73.74和50.59；14個切花菊品種表現(xiàn)為感病(占比42.43%)，病情指數(shù)最高的3個品種為南農(nóng)粉鶯、南農(nóng)紅雀和南農(nóng)思綠，病情指數(shù)分別為86.48、90.20和90.68(表1)。此外，利用SPSS分析離體與活體接種

表1 33個切花菊品種活體與離體抗性篩選結(jié)果Table 1 Results of disease resistance screening of 33 cuTChrysanthemum in vitro and vivo

圖6 3種不同抗性切花菊品種的離體與活體接種癥狀Fig.6 Inoculation symptoms of three different resistanTCuTChrysanthemum in vivo and vitro

表2 離體與活體接種相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of inoculation in vitro and in vivo

試驗的相關(guān)性達到了0.823，在0.01水平(雙側(cè))差異性顯著(表2)，說明在需要進行大量品種的抗病性篩選時，可以通過離體接種代替活體接種以減少工作時間和工作量。

2.7 不同殺菌劑對核盤菌的毒力測定

通過設(shè)置不同濃度的殺菌劑進行核盤菌的抑制試驗，分析得到每種殺菌劑的毒力方程和EC50，EC50越小表明其毒力越大(表3)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟酰胺和肟菌酯的抑制效果最好，EC50分別為0.09 mg·L-1和0.65 mg·L-1；嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑次之，EC50分別為4.71 mg·L-1和26.40 mg·L-1；然后是百菌清，EC50為109.61 mg·L-1；寧南霉素和甲霜靈的效果最差，EC50分別為231.32 mg·L-1和209.54 mg·L-1。由此可見氟酰胺和肟菌酯的抑菌效果遠好于其他殺菌劑。

2.8 不同殺菌劑對菊花菌核病的防治效果

在接種核盤菌24 h后噴施7種殺菌劑，分別進行2次生物學(xué)重復(fù)。由表4可知，氟酰胺和肟菌酯的效果最好，均顯著高于其他殺菌劑，平均防治效果分別達到98.26%和90.93%；嘧菌酯次之，防治效果達到74.31%；然后是苯醚甲環(huán)唑和百菌清，防治效果分別達到58.59%和52.88%，顯著高于甲霜靈和寧南霉素；甲霜靈和寧南霉素的效果最差，僅有24.37%和20.04%，顯著低于其他處理。由此可見，在菊花活體植株的核盤菌接種后防治上，氟酰胺和肟菌酯依然具有良好的效果，與核盤菌的抑制試驗和毒力方程表現(xiàn)出一致性，為氟酰胺和肟菌酯用于菊花菌核病的防治奠定了理論基礎(chǔ)。

表3 七種殺菌劑的毒力測定Table 3 Toxicity determination of seven fungicides

表4 7種殺菌劑對菊花菌核病的防治效果Table 4 Control effect of seven fungicides on chrysanthemum S. sclerotiorum

圖7 7種殺菌劑的防控效果對比Fig.7 Comparison of control effect of seven fungicides

3 討論

菌核病寄主廣泛，致病菌種類較多[19]。包立軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)桑椹菌核病，除了核盤菌外，桑實杯盤菌等核盤菌屬真菌也能導(dǎo)致菌核病。確定菊花菌核病的致病病原菌是開展抗性鑒定等后續(xù)研究工作的關(guān)鍵。核盤菌以接觸、氣流和水流傳播為主，以菌核形態(tài)在植株殘體和土壤中越冬，在發(fā)生期為10月至次年5月并處于高濕條件下的病情更為嚴(yán)重，具有極大的隱匿性和感染性[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)核盤菌致病時會產(chǎn)生草酸，形成酸性環(huán)境并對植株產(chǎn)生毒害作用[23-24]，與本研究發(fā)現(xiàn)核盤菌適宜在偏酸性條件下生長相一致。但是目前國內(nèi)有關(guān)菊花菌核病的研究還相對較少，致病機理等尚需進一步明確。

形態(tài)學(xué)鑒定是鑒定病原菌最基礎(chǔ)也是最直觀的方法[25]，但易受外界環(huán)境的干擾而導(dǎo)致結(jié)果不可信，因此多種鑒定方法結(jié)合更為準(zhǔn)確[26]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于真菌鑒定，有研究表明rDNA-ITS序列在不同真菌的種間雖然存在豐富的變異性，但是種內(nèi)不同菌株間卻相對高度保守[27]。真菌rDNA-ITS序列包含18S rDNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(介于18S與5.8S之間)、5.8S rDNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(介于5.8S與28S之間)和28S rDNA，此類序列片段的長度適中，進化速率比較快(高等真菌一般小于1 000 bp)，可以被用于鑒定真菌種類[28]。分子生物學(xué)可以為研究真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類提供有效的技術(shù)支持。本研究運用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性，再結(jié)合DNA序列分析技術(shù)對核盤菌進行鑒定，鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確?？共⌒院Y選鑒定是植物育種與資源評價工作的重要環(huán)節(jié)。同一時間、同一條件下批量進行品種資源的抗性篩選，得到的結(jié)果更具有可比性和實際意義。為此，需要建立可靠的抗性鑒定方法，進行菊花材料的抗病性篩選。目前對于抗性鑒定的研究報道較多，如冉毅等[29]運用花期牙簽莖桿接種法篩選出12份油菜菌核病的高抗材料，何烈干等[30]通過改進該方法又篩選出2份高抗材料。本研究通過離體與活體對比試驗進行抗性鑒定，結(jié)果更加可靠。同時本試驗發(fā)現(xiàn)離體接種周期更短，操作更簡易，有助于進行大批量抗性篩選鑒定。不同科屬植物的基因不同，生理生化特性不同，對菌核病的抗性也不同，導(dǎo)致高抗品種的篩選存在不確定性，但依然可以通過鑒定篩選結(jié)果對品種材料的抗性作出初步評價。高崇等[31]對延邊煙草菌核病的抗性鑒定結(jié)果為：材料以感病品種為主，未篩選到高抗品種。同樣，本研究在篩選的33份材料中沒有發(fā)現(xiàn)高抗品種，中抗品種的占比只有18.18%，可以看出切花菊對菌核病的抗性相對較弱，但也存在篩選群體不足的原因，因此抗性鑒定與抗病品種選育工作仍需進一步拓展。

生物科技的發(fā)展和致病機理的研究使得新型殺菌劑的發(fā)明越來越多，氟酰胺和肟菌酯就是其中的兩種高效低毒殺菌劑。氟酰胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，肟菌酯屬于甲氧基酸酯類殺菌劑，具有良好的內(nèi)吸性[32-33]。黃文楓等[34]研究發(fā)現(xiàn)氟酰胺的辣椒白斑病防控效果達到75.01%，而苯醚甲環(huán)唑的防效僅有27.51%，張偉等[35]研究發(fā)現(xiàn)肟菌酯在小麥白粉病的防治中防效達到70%以上。此外，楊明方等[36]研究發(fā)現(xiàn)戊唑醇與吡唑醚菌酯混合懸浮劑對桑椹菌核病的防治效果最好，校正防效可達100%。張海洋等[37]通過室內(nèi)毒力測定和田間試驗研究發(fā)現(xiàn)，50%啶酰菌胺對向日葵的防治效果最好，達89.68%。但是目前對于新型殺菌劑用于菊花菌核病的防治研究相對較少。本研究通過不同殺菌劑在菊花上的對比試驗發(fā)現(xiàn)，供試殺菌劑中氟酰胺和肟菌酯的防治效果最好，均能有效抑制病原菌達到90%以上，而傳統(tǒng)廣譜性殺菌劑的防效僅有52.88%。氟酰胺和肟菌酯防治菊花菌核病的效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)殺菌劑，可為菊花生產(chǎn)提供有效保障，也為菌核病的致病和抗病機理研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從菊花發(fā)病植株中分離出菌核病病原菌并鑒定為核盤菌，發(fā)現(xiàn)其具有生長溫度范圍廣、酸堿性適應(yīng)強的特性，并在此基礎(chǔ)上通過人工接種對33個切花菊品種進行了抗性鑒定和防治藥劑篩選。篩選得到了6份中抗品種、13份中感品種和14份感病品種，鑒定結(jié)果表現(xiàn)出多層次的抗性差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)氟酰胺和肟菌酯兩種療效達90%的殺菌劑，可作為現(xiàn)用傳統(tǒng)農(nóng)藥的替代品,用于菊花種植生產(chǎn)中。