常壓室溫等離子體誘變選育耐酸釀酒酵母菌株

耿海波，鄭 輝，張麗媛，郭會(huì)燦，李浩楠，張世佳，安麗平

（1.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081；2.河北中醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200）

在果酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母能將原料中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，并在揮發(fā)性代謝物的合成中起著重要的作用，其產(chǎn)生的成分包括酯類、高級醇類、揮發(fā)性酸類、萜烯類、苯衍生物和硫化合物等，是影響果酒感官特性的主要因素[1-2]。鑒于釀酒酵母在果酒生產(chǎn)中的重要性，人們一直在努力獲得優(yōu)良的釀酒酵母菌株。但是釀酒酵母工業(yè)化應(yīng)用中不可避免要面臨的問題是菌種在生產(chǎn)過程中對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力[3]。研究表明，pH值在調(diào)節(jié)微生物的生長和代謝方面應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用，低pH環(huán)境可誘導(dǎo)酵母細(xì)胞脫水、質(zhì)壁分離，甚至細(xì)胞失活，還會(huì)導(dǎo)致果酒酸澀、口感較差[4]。一般來說，釀酒酵母的最適pH值在3.8～6.0之間，部分經(jīng)選育后用于果酒發(fā)酵的菌株可以耐受pH值為3.2[5]。但是，果酒在生產(chǎn)時(shí)pH值往往低于3.0，較低的pH環(huán)境嚴(yán)重抑制了微生物的活性，可能導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長，口感變差，最終影響果酒的整體品質(zhì)[6]。因此，獲得對酸性有較強(qiáng)耐受力的釀酒酵母菌株成為優(yōu)化果酒生產(chǎn)的有效方法[7-8]。

目前，通過轉(zhuǎn)基因方法可以提高釀酒酵母對酸性環(huán)境的耐受性，但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及到生物安全性和消費(fèi)者接受度的問題，尚無法滿足果酒的工業(yè)化生產(chǎn)需求[9-10]，因此，操作簡單、成本較低、適用范圍廣的傳統(tǒng)誘變技術(shù)仍是釀酒酵母育種研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用廣泛采用的方法[11-13]。但反復(fù)采用單一誘變方法會(huì)使得菌種產(chǎn)生疲勞效應(yīng)，如導(dǎo)致生物量降低、產(chǎn)物含量減少等問題。因此，采用安全高效的誘變技術(shù)成為近年來研究的熱點(diǎn)[14]。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasmas，ARTP）誘變技術(shù)因設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單、成本低、安全性高、突變譜廣和突變率高等特點(diǎn)，近年來在工業(yè)微生物育種中發(fā)揮著重要的作用[15]。ARTP技術(shù)成功應(yīng)用的對象包括細(xì)菌、真菌和微藻等，經(jīng)過誘變后菌種的生長、生產(chǎn)能力以及耐受力等方面均得以改善[16-18]。

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母中篩選出具有耐酸基礎(chǔ)的菌株SC-62作為誘變出發(fā)菌株，通過ARTP誘變技術(shù)對其進(jìn)行誘變處理，篩選耐酸釀酒酵母高產(chǎn)正突變株，以期為釀造研究乃至工業(yè)化生產(chǎn)提供有價(jià)值的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-62：本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

所用培養(yǎng)基均按參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制：酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[19]，WL營養(yǎng)瓊脂（wallerstein laboratorynutrientagar，WL）培養(yǎng)基[20]，氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）培養(yǎng)基[21]，酸性發(fā)酵培養(yǎng)基[22]。

1.1.3 試劑

蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、乳酸、KH2PO4、KCl、CaCl2、FeCl3、MgSO4·7H2O、MnSO4、NaCl、瓊脂粉、無水乙醇、TTC：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠：上海源葉生物科技有限公司；氨芐青霉素：北京索萊寶科技有限公司。以上所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-II 型ARTP 等離子體誘變儀：北京思清源生物科技有限公司；YJ-VS-1型單人垂直超凈工作臺：無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50L型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9602型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS-2E型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：常州恒隆儀器有限公司；UV-1900i型紫外-可見分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；PAL-1型糖度儀：廣州市愛宕科學(xué)儀器有限公司；A8964型酒精計(jì)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ME204型電子分析天平、FE22型pH計(jì)：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

挑取實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母出發(fā)菌株SC-62，接種到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，再將上述菌液按2%（V/V）的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使菌株得以充分活化后，置于離心機(jī)中6 000 r/min離心10 min后收集菌體，用生理鹽水洗滌三遍，重懸浮，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度為1×108個(gè)/mL。

1.3.2 釀酒酵母菌株SC-62生長曲線的測定[21]

將活化后的上述菌懸液按5%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每組平行做3份，每隔2 h取樣測定菌液的OD600nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.3 ARTP誘變

固定ARTP等離子體誘變儀的工作條件，將誘變時(shí)間作為誘變變量對菌液進(jìn)行誘變處理。具體處理步驟為：取10 μL菌懸液于直徑5 mm的無菌不銹鋼載片上，以純度為99.999%的氦氣（He）為注入氣體，流速選擇QHe=10.0 L/min，電源功率選擇120W，處理距離2mm，處理溫度低于40℃[23-24]。出發(fā)菌株分別在ARTP儀下誘變處理0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，每次誘變結(jié)束后將不銹鋼載片置于含990 μL無菌生理鹽水的EP管中，在漩渦器上振蕩洗滌1 min，將誘變菌洗脫下來。分別對上述菌液進(jìn)行梯度稀釋至菌體濃度為103～104個(gè)/mL，吸取0.1 mL稀釋液涂布到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基平板，28 ℃于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄菌落數(shù)量，按公式計(jì)算致死率，繪制致死曲線并確定最佳誘變處理時(shí)間，在最佳誘變條件下對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行性能鑒定。菌株致死率計(jì)算公式如下：

式中：Z表示菌株的致死率，%；X1為誘變處理后的菌落數(shù)，個(gè)；A為對照組的菌落數(shù)，個(gè)。

1.3.4 菌株耐酸、產(chǎn)酒精、產(chǎn)氣性能初篩

耐酸性菌株篩選：向YPD液體培養(yǎng)基加入乳酸調(diào)節(jié)pH值至2，按5%（V/V）的接種量接入誘變菌株，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)在WL固體培養(yǎng)基表面劃線接種，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取生長較好的單菌落，接種到Y(jié)PD固體斜面培養(yǎng)[22]。

TTC顯色法篩選[25-26]：用接種環(huán)挑取上步篩選的菌株在TTC下層培養(yǎng)基表面劃線接種，于28 ℃培養(yǎng)48 h，將TTC上層培養(yǎng)基倒入TTC下層培養(yǎng)基表面，于28 ℃培養(yǎng)3 h后，觀察培養(yǎng)基顯色情況，從中篩選出產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)的菌株。

杜氏小管發(fā)酵法篩選[27]：取0.5 mL菌懸液于10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，倒置裝入杜氏小管，管口密封后于28 ℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管內(nèi)產(chǎn)氣情況，篩選出生長和發(fā)酵性能較好的菌株。

1.3.5 菌株發(fā)酵性能復(fù)篩

將出發(fā)菌株SC-62與初篩得到的菌株分別按照5%（V/V）的接種量接種到pH為2.5的酸性發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d，每24 h測定一次發(fā)酵液CO2質(zhì)量損失，發(fā)酵結(jié)束后，分別測定發(fā)酵醪液中的發(fā)酵力、總糖、酒精度、總酸、揮發(fā)酸和pH。

1.3.6 菌株耐受性能測定

乙醇耐受性測定：分別在YPD液體培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的無水乙醇，按5%（V/V）的接種量將菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后測定生長情況。

鹽耐受性能測定[29]：分別配制NaCl含量為10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L的YPD液體培養(yǎng)基，將菌株按5%（V/V）的接種量接種后培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長情況。

糖耐受性能測定[29]：分別配制葡萄糖含量為200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L的YPD培養(yǎng)基，按5%（V/V）的接種量接種后培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長情況。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，并將每代培養(yǎng)的菌株按照5%（V/V）的接種量分別接種到pH為2.5的酸性發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d，測定每代菌株的產(chǎn)酒精能力，從而驗(yàn)證菌株耐酸性和產(chǎn)酒精能力的遺傳穩(wěn)定性[22]。

1.3.8 測定方法[22，28]

發(fā)酵力：杜氏管發(fā)酵法；總糖：菲林試劑法；酒精度：密度瓶法；總酸（以酒石酸計(jì)）：氫氧化鈉溶液滴定法；揮發(fā)酸（以乙酸計(jì)）：水蒸氣蒸餾滴定法；pH值：采用pH計(jì)對發(fā)酵液的pH值進(jìn)行測定。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。每組實(shí)驗(yàn)平行三份，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定結(jié)果

菌株的生長狀態(tài)會(huì)在很大程度上影響誘變的效果，處于對數(shù)期的酵母菌形態(tài)特征、成分組成和生理特性趨于一致，對環(huán)境因素的影響較為敏感，因此選擇菌株的對數(shù)生長期進(jìn)行誘變可達(dá)到較好的誘變效果[27]。經(jīng)測定后繪制釀酒酵母出發(fā)菌株SC-62的生長曲線，由圖1可知，菌株SC-62在培養(yǎng)0～10 h時(shí)生長速度較慢，處于延滯期；在培養(yǎng)10～20 h時(shí)進(jìn)入生長對數(shù)期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，通過對生長曲線數(shù)據(jù)分析后選擇對數(shù)期的中期，即培養(yǎng)16 h時(shí)對菌株進(jìn)行誘變。

圖1 釀酒酵母菌株SC-62的生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae strain SC-62

2.2 最佳誘變時(shí)間的確定

一般而言，在誘變育種時(shí)，突變率會(huì)隨著誘變劑量的增大而增加，但是達(dá)到一定誘變劑量后，再加大劑量會(huì)導(dǎo)致死亡率過高、誘變效率下降。為了獲得最佳的誘變效果，以誘變時(shí)間作為變量，對酵母菌誘變處理后的死亡率作致死曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 誘變時(shí)間對釀酒酵母菌株SC-62致死率的影響Fig.2 Effect of mutation time on the lethality of Saccharomyces cerevisiae strain SC-62

由圖2可知，隨著誘變時(shí)間的延長，菌株致死率迅速增加，一般選擇菌株致死率在80%～90%范圍內(nèi)對菌株進(jìn)行誘變效果較好。當(dāng)誘變時(shí)間為80 s時(shí)，菌株致死率為84.0%，因此本實(shí)驗(yàn)選擇80 s為誘變處理的最佳時(shí)間。對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變（平行3次），培養(yǎng)后挑取生長較好的165個(gè)單菌落，移種到斜面培養(yǎng)并加以篩選。

2.3 菌株耐酸、產(chǎn)酒精、產(chǎn)氣性能初篩結(jié)果

2.3.1 耐酸性能的測定結(jié)果

由表1可知，165株釀酒酵母中篩選出6株耐酸性能較好的菌株，分別為菌株A-18、A-41、A-73、A-96、A-107、A-135。

表1 釀酒酵母菌株耐酸性能測定結(jié)果Table 1 Determination results of acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains

2.3.2 產(chǎn)酒精能力的測定結(jié)果

由表2可知，6株釀酒酵母菌株中產(chǎn)酒精能力相對較強(qiáng)的是菌株A-18、A-73、A-107和A-135。

表2 釀酒酵母菌株產(chǎn)酒精能力測定結(jié)果Table 2 Determination results of alcohol production capacity of Saccharomyces cerevisiae strains

2.3.3 產(chǎn)氣能力的測定結(jié)果

由表3可知，菌株A-73、A-107和A-135的產(chǎn)氣能力相對較強(qiáng)，在培養(yǎng)至24 h時(shí)杜氏小管中已充有1/2的CO2氣體，在培養(yǎng)至36 h時(shí)杜氏小管中已經(jīng)充滿CO2氣體。

表3 釀酒酵母菌株產(chǎn)氣能力測定結(jié)果Table 3 Determination results of gas production capacity of Saccharomyces cerevisiae strains

綜合菌株耐酸、產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)氣能力的測定結(jié)果，選擇菌株A-73、A-107和A-135進(jìn)行發(fā)酵性能復(fù)篩。

2.4 菌株發(fā)酵性能復(fù)篩結(jié)果

將出發(fā)菌株SC-62和初篩得到的菌株A-73、A-107和A-135在酸性發(fā)酵液中培養(yǎng)后測定其發(fā)酵參數(shù)，結(jié)果見表4。

由表4可知，3株突變菌株與出發(fā)菌株SC-62發(fā)酵后的結(jié)果相比，不論發(fā)酵力還是產(chǎn)酒精能力均出現(xiàn)了不同程度的增加，其中菌株A-107增加顯著，與出發(fā)菌株SC-62相比，其發(fā)酵力[6.21 g CO2/（100 mL·24 h）]提高了37%，酒精度（11.52%vol）提高了30%，同時(shí)總糖比其他菌株更低（3.85g/L），說明菌株A-107能高效的利用培養(yǎng)基中的糖轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物酒精，發(fā)酵后pH（2.39）較其他菌株低，對酸性發(fā)酵環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，其產(chǎn)生的揮發(fā)酸含量（0.69 g/L）也低于國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定的葡萄酒中揮發(fā)酸含量≤1.2 g/L的限值，整體發(fā)酵性能優(yōu)于其他突變株。

表4 釀酒酵母菌株發(fā)酵性能測定結(jié)果Table 4 Determination results of fermentation performance of Saccharomyces cerevisiae strains

2.5 菌株耐受性能測定結(jié)果

對出發(fā)菌株SC-62與初篩得到的菌株A-73、A-107和A-135的乙醇耐受性、NaCl耐受性和葡萄糖耐受性等指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表5 釀酒酵母菌株耐受性能測定結(jié)果Table 5 Determination results of tolerance performance of Saccharomyces cerevisiae strains

從表5可知，4株釀酒酵母均可耐受12%乙醇、100 g/L的NaCl、500 g/L的葡萄糖，其中菌株A-107對乙醇表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，可耐受16%乙醇。再綜合初篩復(fù)篩測定結(jié)果，菌株A-107在發(fā)酵性能和耐受性能等方面優(yōu)于其他菌株，故選擇此菌株進(jìn)行進(jìn)一步測定，考察其遺傳穩(wěn)定性。

2.6 菌株遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果

將篩選出的菌株A-107在酸性發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)5次傳代培養(yǎng)，測定其產(chǎn)酒精能力，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株A-107遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果Fig.3 Determination results of genetic stability of strain A-107

由圖3可知，將菌株A-107連續(xù)傳代5次后，在酸性發(fā)酵培養(yǎng)基中仍能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)的是第二代11.56%vol，最低的為第四代11.29%vol，總體而言，五代之間產(chǎn)酒精能力無明顯變化（P＞0.05），說明突變菌株的耐酸性能和產(chǎn)酒精性能遺傳穩(wěn)定性高。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的具有一定耐酸能力的釀酒酵母菌株SC-62為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變技術(shù)對菌株進(jìn)行誘變處理后獲得165株釀酒酵母菌株，通過耐酸測定、TTC顯色法、杜氏小管發(fā)酵法初篩出三株耐酸性、產(chǎn)酒精和產(chǎn)氣性能較好的菌株后，進(jìn)行發(fā)酵性能復(fù)篩，并測定其耐受性能和遺傳穩(wěn)定性。最終獲得一株正突變的釀酒酵母菌株A-107，其發(fā)酵力6.21 g CO2/（100 mL·24 h）和酒精產(chǎn)量（11.52%vol）相比出發(fā)菌株SC-62分別提高了37%和30%，可耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)16%、NaCl 100 g/L、葡萄糖500 g/L，遺傳穩(wěn)定性好，具有一定工業(yè)應(yīng)用潛力。