酶法聯(lián)合超聲波提取亞麻籽膠

姚 玥，孫凱楊，孫豐梅，3

(1.河北北方學(xué)院 食品科學(xué)系，河北 張家口 075000； 2.河北北方學(xué)院 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，河北 張家口 075000； 3.河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

亞麻(LinumustitatissimumL.)又稱胡麻，是我國最古老的作物之一。亞麻籽是亞麻的種子，主要是由種皮、胚乳和子葉三部分組成，富含多種營養(yǎng)成分，如脂肪、蛋白質(zhì)、亞麻籽膠、膳食纖維和木酚素等，具有調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝、降低血糖血脂水平、改善心腦血管疾病及預(yù)防癌癥等作用[1-4]。亞麻籽餅(粕)是亞麻籽經(jīng)過機(jī)械壓榨或溶劑浸提后的副產(chǎn)物，含有亞麻籽蛋白、亞麻籽膠、木酚素等功能性成分[5-6]。亞麻籽膠又稱富蘭克膠，由酸性多糖和中性多糖組成，以酸性多糖為主，酸性多糖由鼠李糖、巖藻糖、半乳糖醛酸組成，中性多糖主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖組成[7-8]。在食品工業(yè)中亞麻籽膠可以替代果膠、瓊脂、阿拉伯膠、海藻膠等用作增稠劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和發(fā)泡劑，被廣泛用于乳制品、肉制品、面制品、冰激凌和果凍制品中[9-14]。我國亞麻籽餅(粕)資源豐富，但大部分被作為動物飼料，或直接作為廢棄物處理，造成資源浪費(fèi)[15]。因此，開展亞麻籽膠的提取研究，對于亞麻籽餅(粕)的合理利用具有重要意義。

亞麻籽膠的提取大多選用亞麻籽殼作為原料，提取方法主要有干法和濕法兩種。干法提取亞麻籽膠工藝簡單、設(shè)備投資少，但膠產(chǎn)品中水不溶物含量高、膠純度低、黏度較低、質(zhì)量較差，使用領(lǐng)域有限。濕法提取亞麻籽膠質(zhì)量好、附加值較高，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，缺點(diǎn)是工藝相對復(fù)雜、設(shè)備投資較大、生產(chǎn)成本較高[16-19]。

目前，以水為溶劑，利用攪拌[20]、微波[21]、超聲波[22]、加無機(jī)鹽[23]等方法輔助提取亞麻籽膠的研究較多，但這些方法都具有提取時間長、效率低等缺點(diǎn)。酶具有高效性、專一性等特點(diǎn)，并且作用條件比較溫和[24]，利用酶對細(xì)胞壁的破壞作用，可以促進(jìn)亞麻籽膠的釋放，提高提取效率，縮短提取時間。本試驗(yàn)以脫脂亞麻籽粕為原料，選用α-淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶，在各自最適條件下進(jìn)行酶解，以亞麻籽膠得率為指標(biāo)，篩選最適合提取亞麻籽膠的酶制劑；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶法聯(lián)合超聲波提取亞麻籽膠的工藝條件，并對制得的亞麻籽膠中單糖組成及含量進(jìn)行測定，采用紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為亞麻籽膠的進(jìn)一步開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脫脂亞麻籽粕，康保明光糧油有限公司,外觀整齊，無霉變；果膠酶(10 000 U/g)、亞麻籽膠，浙江一諾生物科技有限公司；纖維素酶(10 000 U/g)，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；植酸酶(5 000 U/g)，上海赫鵬新生物科技有限公司；α-淀粉酶(≥3 700 U/g)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸(分析純)、無水乙醇(分析純)，天津新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)科茂化學(xué)試劑有限公司。

Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)、iD5 ART紅外光譜儀，賽默飛世爾(中國)科技有限公司；ZEISS Gemini SEM 500發(fā)射掃描電子顯微鏡、Aztec 50x能譜儀，英國牛津儀器；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；IKA rH basic 2磁力加熱攪拌器，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；DFD-700恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽膠的提取

首先將脫脂亞麻籽粕粉碎、過0.425 mm(40目)篩后，取10 g亞麻籽粕粉于250 mL圓底燒瓶中，按一定料液比(脫脂亞麻籽粕與水的質(zhì)量體積比)加入水，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH，酶處理與超聲波輔助提取同時在可控溫的超聲波清洗器中進(jìn)行，控制攪拌速度為300 r/min，完成后，沸水浴滅酶5 min。隨后，離心至固液分離后減壓濃縮上清液至原體積的50%～60%，冷卻后邊加無水乙醇邊攪拌，至一定醇沉濃度(75%)，4℃下靜置1 h，離心分離沉淀，經(jīng)冷凍干燥制得亞麻籽膠。

1.2.2 亞麻籽膠得率的計算及相關(guān)指標(biāo)分析

亞麻籽膠得率為亞麻籽膠粉質(zhì)量占亞麻籽粕質(zhì)量的比例。

單糖組分測定：委托青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司測定亞麻籽膠單糖組成及含量。

紅外光譜分析：分別取酶法聯(lián)合超聲波提取的亞麻籽膠及商品亞麻籽膠樣品1～2 mg，溴化鉀150 mg左右，研磨后壓片，于紅外光譜儀上進(jìn)行分析，掃描次數(shù)16。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶制劑的篩選(見圖1)

選用α-淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶按1.2.1方法(無超聲)提取亞麻籽膠，料液比1∶25，使酶活力達(dá)到2 000 U，在各自最適pH及溫度條件下酶解2 h(4種酶的最適條件見表1)。以亞麻籽膠得率為指標(biāo)，篩選出最適合酶解脫脂亞麻籽粕的酶。不同酶制劑對亞麻籽膠得率的影響見圖1。

表1 各種酶的反應(yīng)條件

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著。

由圖1可知，亞麻籽膠得率從高到低依次為果膠酶(31.47%)>植酸酶(24.57%)>α-淀粉酶(20.60%)>空白組(19.40%)>纖維素酶(19.27%)。果膠酶水解底物為果膠物質(zhì)，亞麻籽膠是多糖混合物，多糖主要以酸性多糖為主，酸性多糖由于分子體積小，類似于果膠物質(zhì)。亞麻籽粕經(jīng)過果膠酶處理后，促進(jìn)了亞麻籽膠的釋放。除此之外，果膠酶還具有一定的澄清作用，用果膠酶提取后的溶液較其他3種酶提取后的溶液更為清澈。因此，選擇果膠酶作為提取酶制劑。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對亞麻籽膠得率的影響

控制提取溫度40℃、提取時間20 min、料液比1∶25、超聲功率400 W，設(shè)置酶添加量分別為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%，探討酶添加量對亞麻籽膠得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶添加量對亞麻籽膠得率的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增加，亞麻籽膠得率不斷增加，在酶添加量為1.50%時亞麻籽膠得率達(dá)到最大值，但在酶添加量超過1.00%之后增加果膠酶添加量對亞麻籽膠得率影響甚微。因此，最適酶添加量為1.00%。

2.2.2 提取溫度對亞麻籽膠得率的影響

控制酶添加量1.00%、提取時間20 min、料液比1∶25、超聲功率400 W，設(shè)置提取溫度分別為30、35、40、45、50℃，探討提取溫度對亞麻籽膠得率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取溫度低于40℃時，亞麻籽膠得率隨著提取溫度的升高呈明顯上升趨勢。在提取溫度為40℃時得率達(dá)到最大值，為29.40%，當(dāng)提取溫度高于40℃后，得率緩慢降低。因此，最適提取溫度為40℃。

圖3 提取溫度對亞麻籽膠得率的影響

2.2.3 提取時間對亞麻籽膠得率的影響

控制酶添加量1.00%、提取溫度40℃、料液比1∶25、超聲功率400 W，設(shè)置提取時間分別為10、15、20、25、30 min，探討提取時間對亞麻籽膠得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對亞麻籽膠得率的影響

由圖4可知，亞麻籽膠得率隨著提取時間的延長而增加，在20 min后得率趨于平緩。前期由于提取時間較短，亞麻籽膠沒有完全溶出；隨著提取時間的延長，亞麻籽膠逐漸溶出，在20 min時基本完全溶出。因此，最適提取時間為20 min。

2.2.4 料液比對亞麻籽膠得率的影響

控制酶添加量1.00%、提取溫度40℃、提取時間20 min、超聲功率400 W，設(shè)置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，探討料液比對亞麻籽膠得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對亞麻籽膠得率的影響

由圖5可知，料液比低于1∶25時，亞麻籽膠得率隨著料液比的增加而顯著提高。當(dāng)料液比大于1∶25時，得率升高的趨勢變緩，可能是由于料液比為1∶25時亞麻籽膠基本完全溶出。因此，最適料液比為1∶25。

2.2.5 超聲功率對亞麻籽膠得率的影響

控制酶添加量1.00%、提取時間20 min、提取溫度40℃、料液比1∶25，設(shè)置超聲功率分別為100、200、300、400、500 W，探討超聲功率對亞麻籽膠得率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 超聲功率對亞麻籽膠得率的影響

由圖6可知，隨著超聲功率的增大，亞麻籽膠得率呈緩慢上升趨勢，當(dāng)超聲功率超過400 W后，得率出現(xiàn)輕微下降趨勢，可能因?yàn)槌暪β蔬^高對亞麻籽膠中的多糖物質(zhì)有破壞作用。因此，最適超聲功率為400 W。

2.3 正交試驗(yàn)

選擇果膠酶為最佳酶制劑，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率為400 W，以酶添加量(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、料液比(D)為因素，以亞麻籽膠得率為指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

由表3可知，影響亞麻籽膠得率的因素主次順序依次為B>A>D>C，即提取溫度的影響最大，最優(yōu)組合為A3B2C3D3。由表4可知，酶添加量和提取溫度對亞麻籽膠得率有極顯著影響(P<0.01)，料液比對亞麻籽膠得率有顯著影響(P<0.05)。4個因素對得率影響的大小順序B>A>D>C，與表3中的極差分析結(jié)果一致。由于試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合A3B2C3D3未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)的9組方案中，因此對最優(yōu)組合和正交試驗(yàn)方案中亞麻籽膠得率最高的A3B2C1D3組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析

通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到組合A3B2C3D3的亞麻籽膠得率為33.41%，大于組合A3B2C1D3的亞麻籽膠得率(31.09%)。因此，選擇A3B2C3D3為酶法聯(lián)合超聲波提取亞麻籽膠的最佳工藝，即酶添加量1.25%、提取溫度40℃、提取時間30 min、料液比1∶30、超聲功率400 W。在最佳工藝條件下，亞麻籽膠得率為33.41%。

2.4 亞麻籽膠中單糖含量的測定

將本方法與張?zhí)m[25]水提法提取亞麻籽膠中的單糖組成及含量進(jìn)行對比分析，結(jié)果如表5所示。

表5 亞麻籽膠中單糖組成及含量 %

由表5可知，本方法提取的亞麻籽膠中單糖種類更為豐富，如半乳糖醛酸。Bushra等[26]提取的亞麻籽膠由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、木糖、半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸組成。本方法中氨基葡萄糖未檢出。原因一方面可能是國內(nèi)檢測亞麻籽膠組成時很少用氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，另一方面可能是提取亞麻籽膠的原料品種、種植及后期處理方式等原因造成的。

2.5 紅外光譜分析(見圖7)

圖7 不同來源亞麻籽膠的紅外光譜圖

由圖7可知，在 3 280 cm-1處的特征峰為羥基的伸縮振動，在2 920 cm-1處的特征峰為甲基、亞甲基或次甲基中C—H的伸縮振動，1 409 cm-1處的特征峰為C—H的變角振動，這3組峰為多糖的典型特征吸收峰，這一結(jié)果與李小鳳等[27]對亞麻籽膠的紅外光譜分析結(jié)果一致。在超聲過程中，羰基可能參與了氫鍵的形成，導(dǎo)致其吸收峰向低波數(shù)移動，即在1 587 cm-1處出現(xiàn)特征峰，1 038 cm-1處的特征峰為常見的吡喃型糖環(huán)中C—O—C的伸縮振動。以上結(jié)果表明，通過酶法聯(lián)合超聲波提取的亞麻籽膠屬于多糖類物質(zhì)，且酶沒有改變亞麻籽膠的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

篩選出提取亞麻籽膠的最優(yōu)酶制劑為果膠酶，果膠酶聯(lián)合超聲波提取亞麻籽膠的最佳工藝條件為：果膠酶添加量1.25%，提取溫度40℃，提取時間30 min，料液比1∶30和超聲功率400 W。在最佳工藝條件下，亞麻籽膠得率為33.41%。

亞麻籽膠中單糖的組成及含量為甘露糖0.97%、鼠李糖14.05%、葡萄糖醛酸0.16%、半乳糖醛酸22.17%、葡萄糖3.76%、半乳糖17.44%、木糖23.53%、阿拉伯糖10.30%、巖藻糖7.62%。

雖然果膠酶本身具有一定澄清作用，冷凍干燥后的亞麻籽膠粉呈乳白色，但仍沒有達(dá)到商品亞麻籽膠粉純白色的效果。在今后的試驗(yàn)中可對亞麻籽膠的脫色工藝進(jìn)行深入研究。