應用梯度擴散薄膜技術評價天然富硒土壤中硒的生物有效性

吳超， 孫彬彬*， 陳海杰， 成曉夢， 賀靈， 曾道明

(1.自然資源部地球化學探測重點實驗室， 中國地質(zhì)科學院地球物理地球化學勘查研究所， 河北 廊坊 065000；2.聯(lián)合國教科文組織全球尺度地球化學國際研究中心， 河北 廊坊 065000)

富硒土地資源調(diào)查評價、天然富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)已成為中國地質(zhì)調(diào)查工作服務于脫貧攻堅、新農(nóng)村建設、生態(tài)文明建設的切入點，成為提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益、增加農(nóng)民收入、促進農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展的重要舉措[1]。土壤是作物硒的主要來源，土壤-作物系統(tǒng)硒吸收、運移、累積是富硒土地資源利用與富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)的核心問題。多數(shù)情況下作物與土壤硒含量具有較好的正消長關系，但在部分富硒土地開發(fā)利用中發(fā)現(xiàn)農(nóng)作物富硒比例存在較大變化。土壤富硒但農(nóng)作物不富硒是常態(tài)，個別地區(qū)土壤硒含量介于0.20～0.40μg/g的耕地也存在高比例的富硒農(nóng)作物[2]。研究發(fā)現(xiàn)土壤-作物系統(tǒng)中硒含量情況受到采集樣品代表性、分析測試誤差以及作物品種等眾多因素的干擾和影響，但土壤硒生物有效性起決定性作用，作物硒吸收量直接取決于土壤硒有效量的高低。科學評價土壤硒生物有效性，對于富硒土壤資源的圈定、開發(fā)利用和保護及發(fā)展富硒特色農(nóng)業(yè)有著重要的指導意義。

有效、可靠的土壤有效硒分析測試實驗技術是富硒土地資源評價研究的重要技術支撐，基于不同原理的土壤有效硒測試方法可分為化學提取法、土壤溶液法和梯度擴散薄膜(DGT)技術?；瘜W提取法是目前檢測土壤硒生物有效量的常用方法，包括單步提取和連續(xù)提取[3]。其中單步提取法采用特定提取劑活化釋放出土壤中的活動態(tài)或潛在活動態(tài)硒，按提取劑種類可分為水、鹽溶液、稀酸、絡合劑等[4]。連續(xù)提取法則是通過各種提取劑的組合應用，進一步增強提取的針對性?；瘜W提取法雖然應用廣泛但有明顯的局限性。單步提取法在評價不同地區(qū)不同物理化學性質(zhì)土壤硒生物有效量時缺乏普遍適用的提取劑類型[5]，基于不同固液比、提取時間和提取劑濃度得到的結果缺乏可比性[6]。連續(xù)提取法則不可避免地受到各級提取過程中不同種類元素殘留和重疊的影響，并且可能發(fā)生一些吸附和再吸收現(xiàn)象[7]。土壤溶液法是一種傳統(tǒng)的有效態(tài)測定方法，土壤溶液雖能反映出土壤中可以被植物吸收的部分，但由于可被植物吸收利用的Se離子只是土壤溶液中的一部分，其中還含有不能被植物利用的惰性形態(tài)[8]，因此可能會高估硒的生物有效性。此外，由于土壤溶液的分離需要在高轉速下離心，這會破壞元素在土壤固相與土壤溶液間的原始平衡而影響測定結果[9]。梯度擴散薄膜技術(DGT)是近年來廣泛應用于土壤、水體、沉積物等多種環(huán)境介質(zhì)中磷和金屬(類金屬)生物有效性研究的一種仿生原位取樣技術。與基于分配平衡原理的有效性評估方法不同，DGT技術是一種基于解離、擴散動力學的方法，該技術測定的有效態(tài)濃度包括溶液中的離子態(tài)物質(zhì)、絡合態(tài)物質(zhì)中的可解離部分以及固相向液相的補給部分，該濃度反映了環(huán)境介質(zhì)對目標元素的再補給能力以及對補給過程有所貢獻的形態(tài)[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，DGT 技術與其他傳統(tǒng)的生物有效量評價技術相比，能更好地反映植物對磷和金屬(類金屬)的吸收[11]。Luo等[9]首次證實了DGT技術可以用來評價已知濃度的溶液中砷、硒、氟和銻等陰離子的有效性。隨后也有一些學者將DGT技術應用于土壤中硒的生物有效性評價，并且都較好地反映了作物的硒含量水平[12-14]。然而，現(xiàn)有的研究案例均以外源添加硒的土壤為研究對象，其元素形態(tài)和有效性與天然富硒土壤有顯著差異，目前DGT技術是否適用于天然富硒土壤中硒生物有效性評價尚不明確。

為探明DGT技術應用于評價天然富硒土壤中硒生物有效性的可行性，本文在土地質(zhì)量地球化學調(diào)查基礎上分別選取浙江省安吉縣上墅鄉(xiāng)和淳安縣汾口鎮(zhèn)作為研究區(qū)，均為典型的天然富硒土壤區(qū)。以區(qū)內(nèi)主要糧食作物——水稻及其對應根系土為研究對象，分析硒在土壤-作物系統(tǒng)中的遷移富集特征，并分別試驗應用化學提取法、土壤溶液法、DGT技術(包括Zr-oxide DGT和Fe-oxide DGT)三種方法開展土壤硒生物有效性評價研究，結合DGT技術特點分析研究區(qū)土壤動力學特征，探討DGT技術相較于化學提取法和土壤溶液法的優(yōu)缺點。以期明確DGT技術應用于評價天然富硒土壤中硒生物有效性的可行性，擴展土壤有效硒分析測試實驗技術方法。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)分別位于浙江省安吉縣上墅鄉(xiāng)和淳安縣汾口鎮(zhèn)，屬于亞熱帶南緣季風氣候，年平均氣溫約17℃，日照充足，雨量充沛，地貌以丘陵、平原為主。研究區(qū)富硒土壤主要由黑色巖系風化成土形成，為典型的天然富硒土壤區(qū)，區(qū)內(nèi)富硒土地資源開發(fā)成熟，富硒水稻、富硒蔬菜及富硒茶等產(chǎn)品暢銷省內(nèi)外。上墅研究區(qū)富硒土壤的成因主要與區(qū)內(nèi)分布的黑色頁巖有關，汾口研究區(qū)富硒土壤的成因主要與區(qū)內(nèi)分布的黑色碳酸鹽巖有關。其中上墅研究區(qū)黑色頁巖發(fā)育于寒武系下統(tǒng)荷塘組，該組為一套含煤硅質(zhì)巖建造，主要巖性是深灰、灰黑色薄層碳質(zhì)硅質(zhì)巖、泥質(zhì)硅質(zhì)巖、硅質(zhì)泥巖，底部為0.5～1.5m厚的石煤層；汾口研究區(qū)黑色碳酸鹽巖發(fā)育于寒武系中統(tǒng)楊柳崗組，該組主要巖性為深灰、灰色中厚層狀透鏡狀灰?guī)r夾泥質(zhì)灰?guī)r、白云質(zhì)灰?guī)r[15-16]。兩地區(qū)農(nóng)田土壤質(zhì)地均為黏壤土，土壤呈酸性(pH<7.0)，區(qū)內(nèi)無發(fā)達工業(yè)，未見顯著的區(qū)域性人為污染，成土母質(zhì)帶來的地質(zhì)高背景是土壤富硒的主要成因。

2 實驗部分

2.1 樣品采集與預處理

樣品的采集和加工嚴格按照《土地質(zhì)量地球化學評價規(guī)范》(DZ/T 0295—2016)的要求進行。在水稻收獲期采集水稻和對應的根系土樣品，在選定的田塊內(nèi)布設3個以上采樣小區(qū)，每個小區(qū)采集水稻穗10～20株，組合成一件水稻籽實樣品，每件水稻樣品質(zhì)量大于0.5kg。在采集水稻樣品的根系處，對應采集耕層土壤(0～20cm)，等量組合成一件土壤樣品，每件土壤樣品原始質(zhì)量大于1kg。共計采集土壤-農(nóng)作物樣品45套。采集的土壤樣品懸掛于室內(nèi)自然陰干，陰干后用木錘碾細，過10目(孔徑為2mm)的尼龍篩，全部過篩后的土樣混合均勻。留取100g土壤樣品用于DGT方法測定，剩余樣品裝入聚乙烯樣品瓶中送至實驗室。實驗室進一步將土壤樣品用無污染碾磨設備將樣品粉碎至60目、100目和200目，分別用于土壤有效硒(單步提取法)、硒形態(tài)(七步法)和硒全量分析。

采集的水稻穗樣品，曬干后送至實驗室，實驗室將水稻穗脫粒，用純凈水清洗干凈后，烘干脫殼去皮，粉碎至40目，用于測定硒全量。

2.2 土壤有效硒提取實驗

2.2.1化學提取法

參照《土壤有效硒的測定 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法》(NY/T 3420—2019)，稱取預處理好的土樣1g(精確至0.001g)于15mL離心管中，加入0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液10mL，于恒溫混勻儀30℃、1500r/min條件下振蕩80min，離心機3000r/min離心15min，取上清液5mL于消解罐中，加入硝酸7mL和雙氧水1mL進行消解。試樣消解完畢后，取下消解罐，在電熱板上160℃加熱至近干，冷卻后加入6mol/L鹽酸5mL，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色伴有白煙出現(xiàn)，冷卻，轉移至10mL容量瓶中，加入100g/L鐵氰化鉀溶液1mL，用鹽酸定容，同時做空白試驗。

在兩個研究區(qū)內(nèi)各隨機抽取10件土壤樣品用連續(xù)提取法分析Se的形態(tài)分布特征。土壤Se形態(tài)測試參照《生態(tài)地球化學評價樣品分析技術要求》(DD2005-03)采用“七步法”順序提取水溶態(tài)、離子交換態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)、腐植酸結合態(tài)、鐵錳氧化物結合態(tài)、強有機結合態(tài)和殘渣態(tài)。

2.2.2DGT技術

DGT裝置由濾膜、擴散膜、吸附膜以及固定三層膜的塑料外套組合而成。濾膜主要是保護外界對擴散膜的機械破壞和污染，擴散膜主要是控制待測離子到固定膜的擴散通量，吸附膜則是用來吸收富集目標離子。其中吸附膜是DGT裝置的核心組成部分，決定了DGT裝置可檢測的目標離子類型和應用條件，需要根據(jù)待測離子類型選擇相應的吸附材料。由于Se屬于氧化性陰離子，應用DGT評價土壤Se生物有效性時需要選擇特異性吸附氧化性陰離子材料。本次實驗選擇目前發(fā)展較為成熟的氧化性陰離子固定材料水鐵礦(Fe-oxide DGT)[9]和水合氫氧化鋯(Zr-oxide DGT)[17]。

DGT裝置規(guī)格參數(shù)詳見表1。

表1DGT裝置規(guī)格參數(shù)

Table 1 Specifications of DGT equipment

DGT參數(shù)Fe-oxide DGTZr-oxide DGT吸附膜厚度0.6mm厚度0.4mm應用條件pH:3.0～7.0pH:3～10;離子強度:10-5～0.75mol/L硝酸鈉溶液擴散膜聚丙烯酰胺:厚度0.8mm聚丙烯酰胺:厚度0.8mm濾膜PES(聚醚砜):厚度0.14mm,孔徑0.45μmPES(聚醚砜):厚度0.14mm,孔徑0.45μm采樣面積3.14cm22.54cm2D0(擴散系數(shù))7.44(E-6cm2/s)7.44(E-6cm2/s)

具體的操作步驟參照Luo 等[9]的方法，稱取60g土樣放入塑料燒杯中，按照其WHC(田間持水量)的60%加去離子水攪拌均勻，于20±2℃下放置48h。然后繼續(xù)添加去離子水至WHC的100%，直至土壤表面有均勻的光澤且攪拌不費力，再于20±2℃下放置24h。取適量培養(yǎng)后的土壤填入兩個玻璃培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿中土壤的量應保證DGT放入后采樣窗口表面(白色濾膜處)至培養(yǎng)皿底部有至少1cm的空間。分別將Fe-oxide和Zr-oxide DGT輕壓至土壤，使濾膜與土壤完全緊密接觸，蓋上蓋子(需留縫隙)于25℃下靜置，準確記錄時間。

24h后取出裝置，先用去離子水沖洗表面直至清潔，拆開DGT裝置，用潔凈的塑料鑷子將濾膜和擴散膜移除后，取出底部的吸附膜，放入PCR離心管中并加入洗脫液于25℃下洗脫24h，然后用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HG-AFS)測定洗脫液中Se含量。其中Fe-oxide吸附膜采用的洗脫液為1mL 1mol/L硝酸(針對Se的洗脫效率fe為0.8)；Zr-oxide吸附膜采用的洗脫液為10mL 0.5mol/L氫氧化鈉溶液(針對Se的洗脫效率fe為1)。由于Fe-oxide采用的洗脫液硝酸會對HG-AFS 的測定造成干擾，因此需將硝酸除盡?？紤]到洗脫液中的Se含量很低(10-6級)，為防止Se在消解過程中揮發(fā)損失，在消解過程中參考陳海杰等[18]的方法加入Ca2+以抑制Se的揮發(fā)。

2.2.3土壤溶液法

DGT法是在模擬土壤WHC的100%基礎上進行測試，其測試后的黏漿土壤被廣泛用于離心獲取相應含水量的土壤溶液[8]。待DGT實驗結束后將培養(yǎng)皿中剩余的土壤全部轉移到50mL離心管中，在3000r/min下離心30min，將上清液用0.45μm聚醚砜濾膜過濾。

2.3 硒含量分析測試

水稻Se含量、化學提取法提取的有效Se及Se七步形態(tài)的分析測試工作由河南省巖石礦物測試中心完成。水稻樣品中的Se含量采用iCAP-RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國ThermoFisher公司)測定。其余類型樣品的Se含量采用BAF-2000型氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀(北京寶德儀器有限公司)測定。

DGT提取有效Se和土壤溶液提取有效Se的分析測試工作由中國地質(zhì)科學院地球物理地球化學勘查研究所完成，采用XGY-1011A型氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀(河北廊坊開元高技術開發(fā)公司)測定。

分析質(zhì)量控制嚴格執(zhí)行《土地質(zhì)量地球化學評價規(guī)范》(DZ/T 0295—2016)和《多目標區(qū)域地球化學調(diào)查規(guī)范》(DZ/T 0258—2014)。樣品分析過程中，按照規(guī)范插入國家一級標準物質(zhì)(GBW07401a～GBW07408a、GBW10010、GBW10011和GBW07442～GBW07445)用于檢測分析測試的準確度和精密度。分析檢出限、準確度和精密度均達到或優(yōu)于《多目標區(qū)域地球化學調(diào)查規(guī)范》(DZ/T 0258—2014)的要求，分析數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

2.4 數(shù)據(jù)處理

(1)CDGT

DGT技術以菲克(Fick)擴散第一定律為理論基礎，通過對特定時間內(nèi)穿過特定厚度擴散膜的目標元素進行定量化測量計算，從而獲得準確的目標元素濃度值，其測定結果CDGT[9]所表達的濃度是測量期間內(nèi)目標元素在DGT與土壤界面的平均濃度。

式中：M為DGT裝置放置時間段吸附膜對Se的累積量(ng)；Δg為擴散層厚度(cm)；Dd為Se的擴散系數(shù)(cm2/s)；A為DGT裝置暴露窗口面積(cm2)；T為DGT裝置放置時間(s)。

(2)R值

R值即CDGT與土壤溶液總濃度(Csoln)之間的比值，可以用來描述當土壤溶液中的Se被消耗時土壤顆粒向土壤溶液補充Se的能力。R值介于0和1之間。R值越接近0表明土壤顆粒向土壤溶液中補給Se的速率越慢；越接近1表明土壤顆粒能迅速釋放補充溶液中被消耗的Se[19]。

(3)活動系數(shù)(MF)

通常認為水溶態(tài)(F1)、離子交換態(tài)(F2)和碳酸鹽結合態(tài)(F3)是生物有效組分，可被植物利用。生物有效組分占全部形態(tài)的相對比例即為活動系數(shù)(mobility factor，MF)[20]，可以反映土壤中Se的活動性強弱。

(4)生物富集因子(BAF)

生物富集因子(bioaccumulation factors，BAF)可以定量分析作物對某元素的生物富集效應[21]，反映Se在土壤-作物系統(tǒng)中的遷移富集情況。計算公式如下：

式中：Cplant為作物中Se的含量，本研究為水稻籽實中Se的含量；Csoil為土壤中Se的含量。BAF值越大，表明Se在土壤-作物系統(tǒng)中的遷移富集能力越強。

(5)Kd

Kd為元素在土壤固相與液相之間的分配系數(shù)，可以反映元素在土壤環(huán)境中的遷移能力[3]。計算公式如下：

式中：Csoil為土壤中Se的含量；Csoln土壤溶液中Se的含量。

本研究中用SPSS20.0和Excel2013進行描述統(tǒng)計和相關性分析；用CorelDRAW X8進行圖形處理。整個研究中所有的相關性分析結果均以Pearson相關系數(shù)表示。

圖1 不同方法測得的土壤有效Se與作物Se含量之間相關關系Fig.1 Correlation between available Se in soil by different methods and Se concentration in plant

3 結果與討論

3.1 土壤硒生物有效性評價方法對比

在土壤-作物系統(tǒng)中，土壤有效Se是植物吸收的主體，土壤中有效Se含量與作物體內(nèi)Se含量之間是否存在良好的線性相關性是篩選生物有效性評價方法優(yōu)劣的主要檢測手段[22]。本研究分別應用了水鐵礦型DGT(Fe-oxide DGT)、水合氫氧化鋯型DGT(Zr-oxide DGT)、單步提取法、連續(xù)提取法和土壤溶液法測定了土壤中有效Se含量，測定結果分別記為CDGT-Se、Csoln-Se、CKH2PO4-Se、C(F1+F2+F3)-Se。各方法測定有效Se與水稻籽實Se含量(Cplant-Se)Pearson相關系數(shù)見表2。上墅地區(qū)Cplant-Se與CDGT(Fe-oxide)-Se、Csoln-Se與C(F1+F2+F3)-Se呈顯著正相關；汾口地區(qū)Cplant-Se與CDGT(Fe-oxide)-Se、Csoln-Se與CKH2PO4-Se呈顯著正相關，CDGT(Zr-oxide)-Se與兩個地區(qū)均無顯著相關性。以有效Se為自變量，水稻籽實中Se含量為因變量進行一元線性回歸，結果見圖1。上墅地區(qū)Cplant-Se與有效Se回歸方程的決定系數(shù)(R2)大小順序為：C(F1+F2+F3)-Se>CDGT(Fe-oxide)-Se>Csoln-Se>CDGT(Zr-oxide)-Se>CKH2PO4-Se；汾口地區(qū)Cplant-Se與有效Se回歸方程的決定系數(shù)(R2)大小順序為：CDGT(Fe-oxide)-Se>CKH2PO4-Se>Csoln-Se>C(F1+F2+F3)-Se>CDGT(Zr-oxide)-Se。

表2不同方法測得土壤有效Se與作物Se含量相關系數(shù)

Table 2 Correlation coefficent between available Se in soil by different methods and Se concentration in plants

參數(shù)上墅汾口全部CDGT(Fe-oxide)-Se0.757??0.790??0.705??CDGT(Zr-oxide)-Se0.1440.3240.263Csoln-Se0.556?0.556??0.369?CKH2PO4-Se0.1300.638??0.565??C(F1+F2+F3)-Se0.787??0.5030.465?

注： “*”表示在0.05水平(雙側)上顯著相關；“**”表示在0.01水平(雙側)上顯著相關。

3.1.1化學提取法

對于化學提取法，CKH2PO4-Se和C(F1+F2+F3)-Se與全部水稻籽實樣品的相關性僅次于CDGT(Fe-oxide)-Se。但針對不同地區(qū)進行Se有效性評價時顯示出較大差異性，CKH2PO4-Se僅與汾口地區(qū)水稻籽實呈顯著相關(圖1a)，C(F1+F2+F3)-Se則僅與上墅地區(qū)水稻籽實呈顯著相關(圖1b)，本實驗結果佐證了化學提取法缺乏普遍適用提取劑的問題。KH2PO4是目前應用較普遍的有效Se提取劑之一，吳雄平等[23]研究表明KH2PO4適用于石灰性土壤有效Se提取；耿建梅等[24]研究認為KH2PO4適用于海南稻田土壤有效Se的提??；謝薇等[25]研究表明KH2PO4適用于果園和菜地土壤有效硒的提取。然而張艷玲等[26]的研究成果表明KH2PO4不適用于長江沉積物發(fā)育的低Se砂土；Dhillon等[27]通過使用熱水、KH2PO4、KCl、AB-DTPA與有機絡合劑提取印度天然富硒土壤中有效Se，得出熱水提取的有效Se與Cplant-Se相關性最強。由本次實驗結果和前人研究成果可見，化學提取結果之間的差異與土壤理化性質(zhì)有密切關系，化學提取法不具備普遍適用性[28]。

3.1.2土壤溶液法

土壤溶液法測得的Csoln-Se與全部水稻籽實樣品的相關性低于Fe-oxide DGT和化學提取法，但其評價不同地區(qū)土壤Se生物有效性時效果比較穩(wěn)定，Csoln-Se與上墅和汾口地區(qū)水稻籽實樣品均呈顯著正相關(圖1c)，表明土壤溶液法的普適性要強于化學提取法。作為一種傳統(tǒng)方法，土壤溶液法雖然可以反映出土壤中可被植物吸收的部分，但卻無法反映土壤固相向液相動力學補給過程[29]。而且由于可被植物吸收利用的Se離子只是土壤溶液中的一部分，其中還含有不能被植物利用的惰性形態(tài)[8]，可能會高估Se的生物有效性。此外，由于土壤溶液的分離需要在高速下進行離心，這會破壞元素在土壤固相與土壤溶液間的原始平衡而影響測定結果[9]。因此，土壤溶液法也不能視為一種合適的方法。

3.1.3DGT技術

本研究分別應用水鐵礦型DGT(Fe-oxide DGT)和水合氫氧化鋯型DGT(Zr-oxide DGT)評價土壤中Se的生物有效性。CDGT(Zr-oxide)-Se與兩個地區(qū)水稻籽實均無顯著相關性(圖1d)，這可能與Zr-oxide吸附膜對Se4+的專性吸附有關。彭琴[30]研究發(fā)現(xiàn)Zr-oxide吸附膜對亞硒酸鹽(Se4+)的吸附效率為99%，但對硒酸鹽(Se6+)的吸附效率僅為4.4%?，F(xiàn)有的研究結果一致表明土壤中亞硒酸鹽的有效性顯著低于硒酸鹽，這是由于亞硒酸鹽溶解度低，且易與鐵氧化物、黏土礦物結合[1,31]。Cartes等[32]研究了黑麥草幼苗對硒酸鹽和亞硒酸鹽吸收量的差異，發(fā)現(xiàn)黑麥草對硒酸鹽的吸收能力是亞硒酸鹽的20～60倍。Zhao等[33]對云薹屬植物和Pezzarossa等[34]對萵苣的研究也得到了一致結果。由于Zr-oxide DGT測定的有效Se主要來源于亞硒酸鹽，并不是植物吸收利用的主要部分，因此Zr-oxide DGT無法用于土壤中Se的生物有效性評價。CDGT(Fe-oxide)-Se與水稻籽實的相關性達到0.705，大于化學提取法和土壤溶液法，且針對不同地區(qū)進行Se有效性評價時均表現(xiàn)出較好的相關性水平(圖1e)。Wang等[28]和Mason等[35]的研究成果也表明DGT測定的有效As和有效P與植物相應元素含量的相關性高于化學提取法。對于金屬元素，如Cu、Cd、Pb和Zn等也有類似報道[7,36]。DGT法可識別待測元素在土壤微環(huán)境中的變化，測定的有效態(tài)濃度包括土壤溶液中的離子態(tài)物質(zhì)、絡合態(tài)物質(zhì)中的可解離部分以及固相向液相的補給部分，其吸收待測物質(zhì)的過程機理與植物吸收消耗作用引起的目標物質(zhì)從環(huán)境介質(zhì)到植物體表面的動力學過程機理類似，并且多因子分析結果顯示，DGT方法不受土壤基本理化性質(zhì)(如pH、水溶性有機物含量、CEC、土壤質(zhì)地等)的影響[37]。因此，對于評價天然富硒土壤中Se生物有效性而言，DGT方法優(yōu)于傳統(tǒng)的化學提取法和土壤溶液法，其能夠從動力學角度探討土壤中Se的釋放過程，從而可以更好地研究Se的生物有效性。

3.2 研究區(qū)土壤硒含量及賦存形態(tài)特征

土壤中Se的含量特征是判別富硒土壤的主要依據(jù)，上墅研究區(qū)土壤Se含量范圍為0.33～1.47mg/kg，平均含量為0.75±0.28mg/kg，變異系數(shù)為37%，其中95%的土壤樣品符合富硒土壤標準(0.4～3mg/kg)；汾口研究區(qū)土壤Se含量范圍為0.15～2.16mg/kg，平均含量為0.65±0.42mg/kg，變異系數(shù)為65%，其中72%的土壤樣品符合富硒土壤標準。兩個研究區(qū)土壤Se的含量水平差異不大，均顯著高于浙江省表層土壤Se平均含量(0.32mg/kg)[38]，是典型的地質(zhì)高背景區(qū)域。變異系數(shù)(CV)的大小可以反映元素在土壤中的均勻性和變異性，CV值小于15%為輕度變異，CV值在15%～35%為中度變異，CV值大于35%為高度變異[39]。兩個研究區(qū)均位于山地丘陵區(qū)地勢差異較大，可能受基巖風化過程中Se的相對富集和地形等因素的影響，土壤中Se均為高度變異。

土壤中Se的賦存形態(tài)可為研究其生物有效性提供重要信息，通過對土壤樣品進行連續(xù)化學提取分析，獲得Se的7種賦存形態(tài)，其中水溶態(tài)(F1)、離子交換態(tài)(F2)和碳酸鹽結合態(tài)(F3)被認為是生物有效組分，可被植物利用；腐植酸結合態(tài)(F4)、鐵錳氧化物結合態(tài)(F5)和強有機結合態(tài)(F6)被認為是潛在生物有效組分；殘渣態(tài)(F7)亦稱為穩(wěn)定態(tài)，存在于礦物晶格中，難以釋放不能被植物利用。結果顯示，上墅研究區(qū)土壤Se中F1至F7各形態(tài)比例變化范圍依次為：0.7%～2.3%、0.9%～2.9%、1.5%～3.8%、10.9%～17.8%、0.7%～1.5%、41.4%～67.4%、15.1%～30.5%，各形態(tài)Se含量平均比例排序依次為：F6-Se(57.0%)>F7-Se(22.1%)>F4-Se(14.5%)>F3-Se(2.3%)>F2-Se(1.7%)>F1-Se(1.5%)>F5-Se(1.1%)。汾口研究區(qū)土壤Se中F1至F7各形態(tài)比例變化范圍依次為：0.5%～2.6%、1.2%～3.0%、1.8%～4.0%、13.1%～21.7%、0.7%～1.4%、39.1%～58.2%、19.4%～37.5，各形態(tài)Se含量平均比例排序依次為：F6-Se(47.1%)>F7-Se(27.7%)>F4-Se(17.9%)>F3-Se(2.7%)>F2-Se(2.0%)>F1-Se(1.6%)>F5-Se(1.1%)。

活動系數(shù)(MF)可以定量反映土壤中Se的生物有效性，上墅和汾口研究區(qū)MF平均值分別為5.5±1.1%和6.3±1.9%。本次研究結果與安徽廬江地區(qū)[40]和青陽地區(qū)[41]天然富硒土壤中Se形態(tài)分析結果相似，MF值均在5%左右。樊俊等[42]研究發(fā)現(xiàn)將自然土壤按1mg/kg分別添加Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)處理后，土壤中水溶態(tài)Se和離子交換態(tài)Se比例均有大幅提升(圖2)。土壤Se的BCR浸提分析表明，地質(zhì)成因來源的埃及尼羅河泛濫平原土壤中的Se以殘渣態(tài)為主，而人為來源的德國武佩爾河泛濫平原土壤Se則以可氧化態(tài)硒為主，武佩爾河土壤中潛在活動態(tài)(酸溶態(tài)+可還原態(tài)+可氧化態(tài))Se含量高于尼羅河土壤[43]?？梢娞烊桓晃寥篮腿藶閬碓吹耐寥佬螒B(tài)組成有顯著差異，人為來源土壤中Se的活動性組分占比高，但研究發(fā)現(xiàn)外源Se進入土壤后在土壤組分間進行重分配，通常很快與有機質(zhì)結合而失去活性，可溶態(tài)與離子交換態(tài)Se隨時間的增加而下降[44-45]。在天然富硒土壤中Se主要以相對穩(wěn)定的狀態(tài)存在，可被植物吸收利用的有效Se僅占總量的一小部分，但相較于人為來源土壤，其形態(tài)組成比較穩(wěn)定。

其他數(shù)據(jù)來源于文獻[40-42]，Se(Ⅵ)指土壤按1mg/kg添加Se(Ⅵ)處理，Se(Ⅳ)指土壤按1mg/kg添加Se(Ⅳ)處理。圖2 天然與外源添加土壤Se活動態(tài)分布特征對比Fig.2 Comparison of selenium activity fractions between natural and external added soil

3.3 研究區(qū)作物硒含量特征

富硒土壤區(qū)內(nèi)作物的Se含量特征是衡量富硒土壤開發(fā)潛力的重要指標，其中上墅研究區(qū)水稻籽實Se含量為0.028～0.068mg/kg，平均含量為0.046±0.018mg/kg，中值為0.046mg/kg；汾口研究區(qū)水稻籽實Se含量為0.026～0.1mg/kg，平均含量為0.05±0.02mg/kg，中值為0.046mg/kg。根據(jù)《富硒稻谷》(GB/T 22499—2008)中對大米中Se含量的規(guī)定(0.04～0.30mg/kg)，兩個研究區(qū)水稻籽實樣品達到富硒標準的比例分別為65%和60%。而在3.2節(jié)提到上墅研究區(qū)按土壤Se全量劃分出的富硒土壤比例高達95%，與其區(qū)域內(nèi)生長的水稻的富硒比例顯示出較大差異性。這說明只根據(jù)土壤Se含量而不考慮其生物有效性來劃分富硒土壤是不科學的，需要對依據(jù)全量標準圈定的富硒土壤中硒的生物有效性進行研判，或進一步直接測定硒有效量，才能科學評價富硒土壤的可利用性。

BAF是一個無量綱的數(shù)值，可以定量分析作物對土壤中Se的生物富集效應，BAF值越大，表明作物對Se的吸收累積程度高。上墅研究區(qū)水稻籽實Se的BAF值變化范圍為0.040～0.14，中值為0.058，平均值為0.065；汾口研究區(qū)水稻籽實Se的BAF值變化范圍為0.030～0.19，中值為0.091，平均值為0.090。兩個研究區(qū)水稻籽實中Se的平均含量相差不大，但汾口研究區(qū)的BAF平均值相較于上墅研究區(qū)高出38%。這與土壤中Se的形態(tài)分析結果一致，汾口研究區(qū)土壤Se的活動系數(shù)(MF)高于上墅研究區(qū)，表明在Se含量相同情況下，土壤中具有遷移能力和生物可利用性的部分占比更高，因此對應作物中Se的吸收累積程度也越高。

表3DGT測定土壤有效Se含量結果

Table 3 Analytical results of available Se in soil with DGT measurement method

DGT類型研究區(qū)CDGT(μg/L)R(CDGT/Csoln)最小值最大值平均值中位數(shù)最小值最大值平均值中位數(shù)上墅0.0890.410.180.160.0200.0870.0490.041Fe-oxideDGT汾口0.0510.340.150.140.0240.130.0560.055全部0.0510.410.170.150.0200.130.0530.050上墅0.0500.550.190.140.00960.230.0580.034Zr-oxideDGT汾口0.0660.560.210.170.0160.270.0850.073全部0.0500.560.200.160.00960.270.0720.049

3.4 基于DGT的土壤動力學特征分析

3.4.1DGT測定結果

本研究分別應用水鐵礦型DGT(Fe-oxide DGT)和水合氫氧化鋯型DGT(Zr-oxide DGT)測定土壤中有效Se含量，具體結果見表3。DGT方法測得的土壤有效Se濃度(CDGT)含量很低，其中Fe-oxide DGT測得的CDGT平均含量為0.17±0.076μg/L，Zr-oxide DGT測得的平均含量為0.20±0.13μg/L。Zr-oxide DGT測得有效Se含量高于Fe-oxide DGT，這歸因于Zr-oxide固定劑對氧化性陰離子的親和力更強、測定容量大，當同步測定Se、Cr、Mo、Sb、Se、V、W和P等8種陰離子時，其容量是Fe-oxide的7.5～232倍[17]，因此可以吸附更多的Se離子。通過多元回歸分析建立了以Se各形態(tài)含量為自變量、CDGT為因變量的回歸方程，F(xiàn)e-oxide DGT測得的CDGT值主要來自于離子交換態(tài)Se(F2)和碳酸鹽結合態(tài)Se(F3)及一小部分水溶態(tài)Se(F1)，而腐植酸結合態(tài)Se(F4)、鐵錳氧化物結合態(tài)Se(F5)、強有機結合態(tài)(F6)和殘渣態(tài)Se(F7)對CDGT值沒有影響[CDGT(Fe-oxide)=-0.17+0.11F1+17.62F2+18.87F3-0.52F4-3.26F5-0.023F6-0.044F7，R2=0.89]。Zr-oxide DGT測得的CDGT主要來自于水溶態(tài)Se(F1)和碳酸鹽結合態(tài)Se(F3)，但相關性較弱[CDGT(Zr-oxide)=0.36+12.96F1-37.61F2+30.00F3-3.95F4-30.53F5-0.18F6+1.83F7，R2=0.28]。Wang等[28]和Peng等[46]的研究結果也表明水溶態(tài)Se和可交換態(tài)Se是DGT裝置固定Se的主要來源，由此可見DGT測得的有效Se主要來自于Se形態(tài)組成中的生物有效組分。

3.4.2土壤動力學特征分析

DGT技術基于解離、擴散動力學方法，其吸收待測物質(zhì)的過程機理，與植物吸收消耗作用引起的目標物質(zhì)從環(huán)境介質(zhì)到植物體表面的動力學過程機理類似，因此可以反映一定的土壤動力學信息。當DGT技術應用土壤中有效態(tài)溶度分析時，其綜合考慮了土壤溶液中目標物質(zhì)的交換與擴散過程，以及目標物質(zhì)從土壤固相向液相補給的動態(tài)平衡[47]。DGT在測定無機物時，通常認為只有自由離子能被吸附層吸附[48]。DGT裝置放置于土壤后，臨近DGT暴露窗口區(qū)域的土壤溶液中Se離子濃度開始降低，土壤顆粒與土壤溶液原有的平衡被打破，進而引起土壤固相和液相之間Se的動態(tài)交換，同時與有機物等配體絡合的Se會發(fā)生解離，以維持土壤溶液中的原有Se濃度[49-50]，這兩種方式供給Se離子的能力取決于土壤的解離和解吸速率。通過計算CDGT與土壤溶液總濃度(Csoln)之間的比值(R)，可以評估土壤固相向土壤溶液補給Se離子的能力。Fe-oxide DGT測得R的均值為0.053，Zr-oxide DGT測得R的均值為0.072。R值越接近0表明土壤顆粒向土壤溶液中補給Se離子的速率越慢，本實驗R值的結果與Wang等[12]的研究結果一致，在自然土壤中土壤固相向液相補給Se離子的速率較慢。由于Se離子釋放的速率很慢，DGT界面附近的Se離子濃度會隨時間逐漸降低，進而改變了土壤系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，促使化學平衡向解離或解吸出自由離子的方向移動。

土壤溶液是土壤-作物系統(tǒng)進行物質(zhì)交換的主要場所，也是DGT吸附有效Se的載體介質(zhì)。上墅和汾口研究區(qū)土壤溶液的平均含量分別為4.31±2.27μg/L和2.86±1.12μg/L。土壤溶液中的Se含量(Csoln)是DGT測得有效Se(CDGT)的20～30倍，這主要因為土壤溶液不僅包括了DGT可直接吸附的Se離子，還包括可溶的有機配合物、無機配合物、礦物膠體等形式存在的Se。對比兩個研究區(qū)土壤溶液結果，上墅地區(qū)土壤溶液中Se含量顯著高于汾口地區(qū)，對應土壤固液分配系數(shù)Kd小于汾口地區(qū)，說明上墅地區(qū)土壤中Se具有更強的遷移性。然而進一步對比兩個研究區(qū)的R值發(fā)現(xiàn)，上墅地區(qū)的R值小于汾口地區(qū)(圖3)。這表明雖然上墅地區(qū)相較于汾口地區(qū)土壤中Se具有更強的遷移性，但其土壤固相向土壤溶液補充Se離子的速率小于汾口地區(qū)。由3.3節(jié)可知汾口地區(qū)水稻籽實的BAF值相較于上墅地區(qū)高出38%，可見土壤顆粒對Se離子的持續(xù)補給在土壤-作物系統(tǒng)遷移轉化過程中占有重要地位。汾口地區(qū)土壤對Se離子的相對高補給能力可能與其形態(tài)組成有關。本研究的多元回歸分析結果表明DGT測定的有效Se來源于水溶態(tài)、離子交換態(tài)和碳酸鹽結合態(tài)。Wang等[28]和Peng等[46]研究也表明水溶態(tài)Se和可交換態(tài)Se是DGT裝置固定的Se來源。汾口地區(qū)土壤中水溶態(tài)Se和可交換態(tài)Se及碳酸鹽結合態(tài)Se含量均高于上墅地區(qū)，反映了其可向DGT測定的有效Se提供更多的來源。

圖3 DGT技術測得的R值和Kd值Fig.3 R value and Kd value by DGT measurement

4 結論

本文以浙江省上墅鄉(xiāng)和汾口鎮(zhèn)分布的天然富硒土壤為研究對象，實驗應用化學提取法、Fe-oxide DGT(水鐵礦型)、Zr-oxide DGT(水合氫氧化鋯型)和土壤溶液法評價土壤中硒的生物有效性。結果表明：①Zr-oxide DGT對Se(Ⅳ)具有專性吸附特征，導致Zr-oxide DGT無法有效反映植物體內(nèi)硒含量水平，因此對于檢測土壤硒生物有效量，F(xiàn)e-oxide DGT要優(yōu)于Zr-oxide DGT；②對比不同土壤硒生物有效性評價方法，DGT技術在測試性能上優(yōu)于化學提取法和土壤溶液法；③基于DGT技術計算得出的R值(土壤顆粒向土壤溶液補充硒的能力)和Kd值(土壤固相與液相之間的分配系數(shù))，表明上墅研究區(qū)相較于汾口研究區(qū)土壤中硒具有更強的遷移性，但其土壤固相向土壤溶液補充硒離子的速率小于汾口研究區(qū)。DGT技術相較于化學提取法和土壤溶液法在反映土壤動力學過程信息方面具有優(yōu)勢。

本研究明確了梯度擴散薄膜(DGT)技術可以有效評價天然富硒土壤中硒生物有效性，該技術相較于傳統(tǒng)的化學提取法和土壤溶液法，在測試性能和反映土壤動力學過程信息方面更具優(yōu)勢。