成骨細(xì)胞在不同因素影響下黏附作用的研究進(jìn)展

梁文強(qiáng)，楊國清，張懷斌，謝犇，楊杜斌，王勇平，2

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030； 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院骨科，蘭州 730030)

骨缺損是目前骨科面臨的難題之一，應(yīng)用生物材料修復(fù)骨缺損是臨床和組織工程研究的熱點(diǎn)，同時(shí)生物材料需具備較強(qiáng)的促成骨能力。在成骨細(xì)胞與生物材料相互作用過程中，黏附是促進(jìn)細(xì)胞與材料相互作用的重要起始步驟。但是成骨細(xì)胞的黏附過程涉及一系列由細(xì)胞到分子水平的復(fù)雜生理過程和物理化學(xué)變化[1]。越來越多的證據(jù)表明，成骨細(xì)胞在生物材料上的黏附是將生物物理化學(xué)信號(hào)傳遞給成骨細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，從而啟動(dòng)骨整合級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與生物材料之間的相互作用[2-4]。其中生物材料的表面形態(tài)、表面涂層、復(fù)合材料、孔隙結(jié)構(gòu)等均可不同程度地促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附。成骨細(xì)胞黏附于生物材料的過程不僅是簡(jiǎn)單的物理過程，還涉及啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、遷移等重要過程。這些都是早期成骨細(xì)胞黏附的重要組成部分，導(dǎo)致成骨細(xì)胞直接附著在生物材料表面，而不需要軟組織或結(jié)締組織的干預(yù)[5]。隨著研究的逐漸深入與組織工程的發(fā)展，越來越多的研究證實(shí)生物因素、等離子體以及中醫(yī)藥在促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附方面有一定作用。諸多因素對(duì)成骨細(xì)胞黏附產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用?，F(xiàn)就成骨細(xì)胞在不同因素影響下黏附作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 生物材料表面特性對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響

不同的生物材料對(duì)成骨細(xì)胞的黏附具有一定影響，而且成骨細(xì)胞在生物材料上的黏附也受到生物材料的影響。生物材料的表面形態(tài)、表面電荷、孔徑大小和表面生物活性等物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)成骨細(xì)胞的黏附過程有重要影響，從而影響早期成骨細(xì)胞黏附。

1.1表面形態(tài) 從微米級(jí)到納米級(jí)的表面形態(tài)可以影響成骨細(xì)胞的黏附。骨組織表面的粗糙度約為32 nm，骨生物材料中的納米級(jí)粗糙度也能對(duì)成骨細(xì)胞的黏附產(chǎn)生影響。當(dāng)表面粗糙度達(dá)到納米級(jí)后成骨細(xì)胞的黏附能力顯著提升，這與納米級(jí)的波峰使局部負(fù)電荷濃度增加進(jìn)而吸附更多的纖維連接蛋白有關(guān)[6-7]。粗糙的表面增加了成骨細(xì)胞早期與材料表面的連接，更有利于細(xì)胞的黏附[8-9]。這進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，有利于細(xì)胞的長期黏附。但表面粗糙度>2.19 μm時(shí)，成骨細(xì)胞的黏附作用會(huì)受到一定抑制，其原因可能是過大的粗糙度導(dǎo)致從凸起到凹槽的距離變長，不利于成骨細(xì)胞偽足的形成[10]。Anselme等[11]研究了不同粗糙度對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響，發(fā)現(xiàn)材料表面凹槽深度加深、寬度增加可以促進(jìn)細(xì)胞黏附。Eghbali等[12]使用光纖刻蝕激光裝置對(duì)Ti-6Al-4V合金板材進(jìn)行表面改性，并與MG-63細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激光頻率為20 kHz、刻槽距離為50 μm時(shí)，改性樣品的細(xì)胞存活率較未處理樣品提高了35%，當(dāng)溝槽距離>50 μm時(shí)，最小激光頻率(20 kHz)可減小激光脈沖的重疊，提高細(xì)胞黏附性。

上述研究表明，成骨細(xì)胞黏附可能存在最佳粗糙度。適宜的表面粗糙度可為成骨細(xì)胞提供足夠的凹槽用于細(xì)胞定位和拉伸，有利于吸收更多黏附相關(guān)蛋白以促進(jìn)細(xì)胞黏附。因此，可以通過物理化學(xué)的方法增加材料的表面粗糙度，達(dá)到促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附的目的。

1.2表面涂層 將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸固定在生物材料表面，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附。Verstappen等[13]將支撐脂雙層膜進(jìn)行精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸功能化，實(shí)現(xiàn)了成骨細(xì)胞前黏附和增強(qiáng)分化。Man等[14]制備了一種功能性Ti-6Al-4V合金，并將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸與功能性Ti-6Al-4V合金結(jié)合，發(fā)現(xiàn)功能性Ti-6Al-4V合金支架更有利于成骨，這可能是由于涂層在Ti-6Al-4V合金上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽提高了成骨細(xì)胞的黏附性。通過精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽在Ti-6Al-4V合金表面共價(jià)交聯(lián)形成功能性Ti-6Al-4V合金，可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的黏附和鋪展，進(jìn)而促進(jìn)堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原基因的表達(dá)。李鶯等[15]在純鈦表面制備TiO2納米管涂層后，與Ⅰ型膠原結(jié)合發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞伸展完全，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)明顯，黏附斑蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)了成骨細(xì)胞在該材料表面的黏附，表明純鈦表面TiO2納米管結(jié)合Ⅰ型膠原可有效促進(jìn)骨細(xì)胞黏附，進(jìn)而促進(jìn)骨整合。俞斌等[16]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4多巴胺涂層修飾的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯人工韌帶材料可以明顯增加成骨細(xì)胞的黏附。Haag等[17]將牛血清白蛋白溶解到不同濃度的CaCl2溶液中制備成表面涂層，將涂層復(fù)合到聚苯乙烯中，研究其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣修飾的牛血清白蛋白可改善MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的整體黏附，但過高濃度的鈣會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。Xu等[18]為了提高鈦的抗污性和生物活性，采用兩性離子聚2-(甲基丙烯酰氧基)乙基膽堿磷酸酯[zwitter ionic poly 2-(methacryloyloxy)ethyl choline phosphate，PMCP]通過表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合對(duì)鈦表面進(jìn)行改性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ti-PMCP表面具有兩性離子防污性能，降低了血清白蛋白和纖維蛋白原的吸附性，Ti-PMCP參與鈦表面PMCP和細(xì)胞膜上磷酸膽堿的相互作用。因此，Ti-PMCP表面可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的黏附和增殖。

材料表面增加涂層是促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附的一種較為常用的方法，性狀優(yōu)良的表面涂層不僅可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞在材料表面的黏附，還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。不同的表面涂層可使不同的黏附相關(guān)蛋白表達(dá)增加，激活信號(hào)通路，但這一過程中涉及的分子機(jī)制研究較少。

1.3復(fù)合材料 利用各種材料的不同特點(diǎn)制作的復(fù)合材料能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，使材料具有更好的細(xì)胞黏附性、細(xì)胞增殖以及生物相容性。Zhang等[19]制備了一種多孔聚醚酰亞胺支架，該支架的相對(duì)細(xì)胞黏附能力和細(xì)胞形態(tài)均優(yōu)于聚醚酰亞胺和Ti-6Al-4V。Szewczyk等[20]開發(fā)了聚偏二氟乙烯薄膜，以獲得表面仿生細(xì)胞外基質(zhì)，在成骨細(xì)胞黏附和增殖的細(xì)胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)表面粗糙的薄膜能明顯提高成骨細(xì)胞的黏附力[18]。Ghezzi等[21]提出了3-巰丙基三甲氧基硅烷對(duì)碳化硅納米顆粒的功能化處理，功能化納米線的黏附性優(yōu)于裸露納米顆粒，細(xì)胞骨架顯示蛋白分布更均勻，同時(shí)基因表達(dá)分析顯示，堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原的表達(dá)水平較高。廖健等[22]將大鼠成骨細(xì)胞接種于煅燒骨/殼聚糖復(fù)合材料上，培養(yǎng)3 d后成骨細(xì)胞緊密黏附于煅燒骨與殼聚糖質(zhì)量比為1/2、1/1、2/1的復(fù)合材料表面，伸展完全，胞體豐滿并伸出偽足嵌入材料內(nèi)部；培養(yǎng)7 d后細(xì)胞鋪滿材料表面，其中煅燒骨/殼聚糖質(zhì)量比為2/1的復(fù)合材料表面的細(xì)胞最密集，表明煅燒骨/殼聚糖復(fù)合材料可增加成骨細(xì)胞的黏附與增殖。殼聚糖與成骨細(xì)胞具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附，脫細(xì)胞骨基質(zhì)也有良好的生物相容性且能起到骨傳導(dǎo)與誘導(dǎo)的作用，因此聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子制備成復(fù)合支架：堿性成纖維細(xì)胞生長因子/脫細(xì)胞骨基質(zhì)/殼聚糖支架，復(fù)合支架有利于成骨細(xì)胞的黏附，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的移植與成骨基因的表達(dá)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，將人成骨樣SAOS-2細(xì)胞接種于糖交聯(lián)膠原-羥基磷灰石顆粒支架材料表面，人成骨樣SAOS-2細(xì)胞能夠伸展偽足遷移入支架材料內(nèi)部黏附生長[24]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在富含SiO2的生物玻璃材料中加入MgO可以產(chǎn)生良好的化學(xué)環(huán)境，誘導(dǎo)吸附在表面的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)參與細(xì)胞黏附蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的黏附行為產(chǎn)生積極影響[25]。Liu等[26]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物為載體，制備了成骨誘導(dǎo)劑緩釋系統(tǒng)，并將其包覆在鈦表面，與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，PLGA+成骨誘導(dǎo)劑組的成骨細(xì)胞呈典型的紡錘形，數(shù)量較多，提示PLGA+成骨誘導(dǎo)劑可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和增殖。

復(fù)合材料的優(yōu)點(diǎn)在于能將不同材料的優(yōu)良性狀相結(jié)合，由于不同材料的理化性質(zhì)存在差異，復(fù)合材料的制備過程較為復(fù)雜，但優(yōu)良的復(fù)合材料可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和增殖。

1.4孔隙結(jié)構(gòu) 研究發(fā)現(xiàn)多孔鉭有利于成骨細(xì)胞在其表面及孔隙內(nèi)黏附，整合素β1及纖維粘連蛋白在成骨初期鉭-骨界面表達(dá)增高，可能對(duì)早期成骨起促進(jìn)作用，而在骨成熟期則表達(dá)降低，有利于成骨細(xì)胞黏附及改建[27]。Wang等[28]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著材料表面孔徑的增大，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白和堿性磷酸酶顯著增加，成骨相關(guān)基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨鈣蛋白、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2重組蛋白和堿性磷酸酶顯著上調(diào)，表明類松質(zhì)多孔結(jié)構(gòu)可以有效降低金屬材料的彈性模量，從而避免應(yīng)力集中，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和增殖。O′Brien等[29]研究生產(chǎn)了一系列具有不同孔徑和細(xì)胞附著比表面積的支架，細(xì)胞附著與支架比表面積之間存在線性關(guān)系，表明在所研究的孔徑范圍內(nèi)(95.9～150.5 μm)，MC3T3-E1細(xì)胞的短期活性取決于可結(jié)合的比表面積?？紫兜闹睆綄?duì)成骨細(xì)胞的黏附過程有一定影響，材料的直徑對(duì)于成骨細(xì)胞黏附同樣具有一定促進(jìn)作用，徐玲和于衛(wèi)強(qiáng)[30]研究了不同的TiO2納米管對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與直徑為80 μm的納米管相比，直徑為30 μm的納米管成骨細(xì)胞能更好地黏附在50 μm的納米管上，說明成骨細(xì)胞的黏附受納米管直徑的影響。材料表面搭載一定的藥物涂層對(duì)成骨細(xì)胞的黏附同樣具有影響。

隨著人們對(duì)成骨細(xì)胞黏附認(rèn)識(shí)的深入，成骨細(xì)胞黏附不再局限于細(xì)胞在生物材料表面的物理黏附，而是一個(gè)復(fù)雜的生理過程。成骨細(xì)胞黏附除了能將成骨細(xì)胞物理附著在生物材料表面外，還能激活信號(hào)通路，控制細(xì)胞的存活、增殖、遷移和分化等一系列重要的活動(dòng)。成骨細(xì)胞黏附的調(diào)控不應(yīng)僅局限于物理黏附，也應(yīng)關(guān)注其涉及的信號(hào)通路，將生物材料表面產(chǎn)生的生物物理化學(xué)信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)早期骨整合。研究不同生物材料的表面性質(zhì)對(duì)黏附相關(guān)蛋白的影響具有重要意義，但對(duì)于材料激活的黏附相關(guān)信號(hào)通路與早期骨整合之間的關(guān)系仍不明確，忽視黏附在介導(dǎo)下游信號(hào)通路中的重要作用可能會(huì)導(dǎo)致早期骨整合的失敗。未來應(yīng)關(guān)注生物材料的物理附著和介導(dǎo)的信號(hào)通路，以促進(jìn)早期骨整合。

2 生物因素對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響

在生物材料表面改性的研究中生物因子被廣泛用于支架表面改性，其原因是生物因素本身具有促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附的作用。李娜和章非敏[31]分別在多巴胺改性、多巴胺復(fù)合Ⅰ型膠原改性的玻片和空白玻片上培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于空白玻片組，MC3T3-E1 細(xì)胞在多巴胺以及多巴胺復(fù)合Ⅰ型膠原組中鋪展、黏附形態(tài)更好，表明多巴胺及多巴胺復(fù)合Ⅰ型膠原可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附作用。宋婷婷[32]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附與遷移。有研究指出，重組人甲狀旁腺激素對(duì)成骨細(xì)胞的黏附具有促進(jìn)作用[33]。

3 等離子體對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響

等離子體是一種通過電離產(chǎn)生的離子化氣體狀物質(zhì)，分為熱等離子體和低溫等離子體兩大類，通常用于材料表面改性和組織再生領(lǐng)域。Gonzalez-Blanco等[34]在鈦片上添加硅涂層并進(jìn)行酸化處理后，用氬等離子體處理材料，與人成骨MG-63細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)氬等離子體處理的鈦片相比，經(jīng)氬等離子體處理的鈦片上培養(yǎng)的細(xì)胞黏附和增殖水平更高、線粒體損傷更小、平均細(xì)胞面積更大。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無機(jī)牛骨通過氬氣+5%氧氣產(chǎn)生的低溫氬氧等離子體進(jìn)行表面活化細(xì)胞鋪展較為充分，細(xì)胞表現(xiàn)出較好的黏附性[35]。Ghezzi等[36]設(shè)計(jì)了碳化硅和核殼碳化硅/二氧化硅納米顆粒并研究其對(duì)小鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞的影響，經(jīng)過氫等離子體處理后，碳化硅納米顆粒的親水性增加，碳化硅納米顆粒表面潤濕性的改善使接種后24 h的細(xì)胞黏附性更好，細(xì)胞呈扁平狀和星狀，親水性的增強(qiáng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附的增加。等離子體通過改變材料表面的不同性狀增加了細(xì)胞黏附的能力。

4 中藥對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響

近年基于中醫(yī)藥的研究不斷深入，中藥材對(duì)于成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為具有一定影響。林煜等[37]研究了健骨顆粒含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著含藥血清干預(yù)時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞表達(dá)及分泌的纖維粘連蛋白、Ⅰ型膠原、玻連蛋白、黏著斑激酶信使RNA及蛋白水平逐漸升高，提示健骨顆粒能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附，原因在于其激活了介導(dǎo)成骨細(xì)胞黏附的黏著斑激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各相關(guān)因子，使成骨細(xì)胞進(jìn)入“分泌增加→黏附增加→功能增強(qiáng)、分裂增殖→分泌增加”的良性循環(huán)，對(duì)成骨細(xì)胞的成骨效應(yīng)起正性調(diào)節(jié)作用。有研究表明，淫羊藿苷去蛋白無機(jī)牛骨復(fù)合材料表面能使成骨細(xì)胞黏附增多、分布更加均勻[38]。宋立成等[39]分析淫羊藿苷對(duì)高重力加載后細(xì)胞黏附和細(xì)胞骨架的影響發(fā)現(xiàn)，一定條件下的重力和淫羊藿苷干預(yù)均可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附。

5 小 結(jié)

近年有關(guān)成骨細(xì)胞黏附的研究較多，許多研究結(jié)果顯示成骨細(xì)胞的黏附是一個(gè)復(fù)雜的過程，生物材料的各種性質(zhì)、生物因素、等離子體和中醫(yī)藥均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定影響。良好的骨生物材料應(yīng)具備良好的生物相容性、細(xì)胞附著性、細(xì)胞增殖性等。材料的表面特性如表面形態(tài)、表面涂層、孔徑的大小以及復(fù)合材料均可能對(duì)成骨細(xì)胞的黏附產(chǎn)生一定影響。但成骨細(xì)胞在生物材料上黏附過程的調(diào)節(jié)和所涉及的信號(hào)通路可能更為復(fù)雜。促進(jìn)成骨細(xì)胞在骨生物材料上的黏附還需要更多的體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。隨著對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附的進(jìn)一步研究，可以為臨床實(shí)踐中骨缺損患者的治療提供理論與實(shí)踐依據(jù)。