羽毛降解菌的篩選及其降解特性研究

楊可心 劉國(guó)華 郭寶珠 鄭愛娟 陳志敏 常文環(huán) 王澤棟 蔡輝益

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,農(nóng)業(yè)部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

羽毛是養(yǎng)殖業(yè)屠宰固廢的重要組成部分，我國(guó)每年肉雞和蛋雞總出欄量可超100億羽，以羽毛占體重比5%～7%計(jì)算，可產(chǎn)生數(shù)百萬噸羽毛。其中，水禽羽毛可加工為附加值較高的羽絨制品，而雞羽毛常因附加值較低被廢棄。雞羽毛具有75%以上的粗蛋白質(zhì)含量，主要由一種“硬蛋白”——羽毛角蛋白構(gòu)成，這種蛋白由氫鍵、二硫鍵和其他交聯(lián)作用共聚形成復(fù)雜穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)[1]，從而具有強(qiáng)大的抗張性[2]、柔韌性和機(jī)械強(qiáng)度，難以被常見蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)消化[3]，因此也很難被動(dòng)物直接利用。羽毛的氨基酸、礦物質(zhì)微量元素和維生素種類豐富，將其抗性物質(zhì)破壞，則能發(fā)揮極高的飼用價(jià)值。20世紀(jì)末，以高溫高壓水解法、膨化法、酸解堿解法等傳統(tǒng)方法進(jìn)行羽毛資源飼料化加工，有效解決了羽毛處理問題。但高溫高壓法導(dǎo)致羽毛中熱敏氨基酸的損失[4]，酸解堿解法導(dǎo)致氨基酸的破壞[5]，使產(chǎn)物品質(zhì)下降。同時(shí)，能耗高、廢棄產(chǎn)物多等的特點(diǎn)是傳統(tǒng)加工方式引起環(huán)境問題的最主要原因，導(dǎo)致羽毛飼料化面臨新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。微生物發(fā)酵技術(shù)兼具改善飼料原料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值結(jié)構(gòu)和環(huán)境友好的特點(diǎn)。本研究擬篩選可高效降解羽毛的微生物，對(duì)羽毛進(jìn)行微生物發(fā)酵技術(shù)處理，改善羽毛營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前已有研究表明，可分離出不同種屬微生物對(duì)羽毛具有降解效果，如尖孢鐮刀菌[6]、絲狀真菌[7]、地衣芽孢桿菌[8-10]、枯草芽孢桿菌[11]、蠟樣芽孢桿菌[12-13]、弗氏鏈霉菌[14]等。本研究通過分離得到的羽毛降解菌進(jìn)行羽毛微生物發(fā)酵，可有效改善羽毛的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值結(jié)構(gòu)，提升羽毛利用率和可溶性蛋白及氨基酸含量，為開發(fā)動(dòng)物廢棄物資源提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

牛、羊瘤胃富集菌種，保藏于實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 羽毛采集及處理

羽毛采集于北京昌平南口試驗(yàn)基地；新鮮廢棄的42日齡白羽肉雞羽毛。羽毛處理：剔除羽毛中雞肉殘?jiān)?、血塊、腳皮等雜質(zhì)，用水反復(fù)沖洗至潔凈狀態(tài)，暴曬晾干。為保證羽毛底物均勻性和穩(wěn)定性，剔除粗大成羽，粉碎后過18目篩，取篩上物作為羽毛培養(yǎng)基底物。

1.1.3 培養(yǎng)基

1)LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

2)LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂15 g/L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

3)酪蛋白培養(yǎng)基：干酪素(酪蛋白)10 g/L、牛肉浸粉 3 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO42 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

4)羽毛培養(yǎng)基1：完整羽毛1根、營(yíng)養(yǎng)鹽溶液10 mL(NaCl 0.5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.7 g/L、MgSO40.1 g/L)，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

5)羽毛培養(yǎng)基2：羽毛粉1%(m/v)、營(yíng)養(yǎng)鹽溶液100 mL(NaCl 0.5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.7 g/L、MgSO40.1 g/L)，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種初篩

將活化的菌液點(diǎn)圖于酪蛋白培養(yǎng)基，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量降解圈直徑和菌落直徑，計(jì)算降解圈直徑/菌落直徑的比值。選擇比值大、透明度高的菌株作為復(fù)篩菌株。

1.2.2 菌種復(fù)篩

將活化的菌液以2%(v/v)的接種量分別接種于羽毛培養(yǎng)基1和2中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。分別設(shè)置無菌空白對(duì)照組。觀察記錄羽毛培養(yǎng)基1中完整羽毛降解情況。試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定羽毛培養(yǎng)基2的降解液可溶性蛋白含量。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 菌落和細(xì)菌形態(tài)觀察

用平板畫線法將菌株NLG1接種在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落形狀、顏色、表面質(zhì)地和菌落邊緣等形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色制片觀察。

1.2.3.2 細(xì)菌生物學(xué)鑒定

菌株NLG1經(jīng)多次純化傳代后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA基因測(cè)序。將測(cè)得序列結(jié)果在NCBI的BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫已測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)。采用MEGA 4構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將菌株NLG1接種在LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)24 h，每小時(shí)取樣1次，在600 nm下測(cè)定菌液吸光度(OD )并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

活化菌液于無菌離心管中4 000 r/min離心10 min，棄上清液，留沉淀，無菌生理鹽水反復(fù)洗滌重懸2次，制成體積為1 mL、活菌數(shù)為107CFU/mL的菌種重懸液。將菌種重懸液轉(zhuǎn)接于羽毛培養(yǎng)基2中，搖床180 r/min、37 ℃培養(yǎng)3 d。改變溫度(25、27、29、31、33、35、37、41、43 ℃)、初始pH(5、6、7、8、9、10、11、12)、活菌數(shù)(106、107、108、109CFU/mL)、底物濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、外加2%碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉)和發(fā)酵時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6、7、8 d)，研究發(fā)酵條件對(duì)菌株NLG1羽毛降解的影響，測(cè)定發(fā)酵液可溶性蛋白含量。

1.2.6 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G250法[15]測(cè)定羽毛發(fā)酵液中可溶性蛋白含量。

1.2.7 上清液氨基酸成分分析

以優(yōu)化后條件進(jìn)行羽毛發(fā)酵，取培養(yǎng)0(當(dāng)天)和3 d的發(fā)酵液，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液并過濾膜過濾。參照QB/T 18246—2000，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立L-8900，日本)測(cè)定氨基酸總量。取一定量樣品上清液與磺基水楊酸均勻混合，于4 ℃靜置60 min后采用低溫離心機(jī)12 000 r/min離心20 min，除去樣液中多肽或小肽后采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定游離氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0中one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

通過酪蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，共得到16株降解酪蛋白、產(chǎn)生透明圈的菌株。根據(jù)透明圈直徑/菌落直徑的比值大小進(jìn)行比較，留取50%株菌作為后續(xù)試驗(yàn)用菌。初篩結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 不同菌株酪蛋白平板培養(yǎng)基產(chǎn)圈情況

圖1 初篩菌株產(chǎn)圈能力

2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

分別接種8株初篩菌株的羽毛培養(yǎng)基1、2的降解情況、降解液可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果分別見圖2、圖3。為保證結(jié)果可靠性，選擇羽毛發(fā)育程度、形態(tài)、質(zhì)量相同的單根完整羽毛制作羽毛培養(yǎng)基1。圖2所示，以空白(無菌)培養(yǎng)基為對(duì)照，經(jīng)3 d培養(yǎng)后，除接種NLG2和NLG6的羽毛降解不明顯外，其余菌株均能將培養(yǎng)基羽毛不同程度降解，其中NLG1和S2-2可將其降解為細(xì)碎粉狀，S1-1、LY、S1-2和S2-1則將其降解為羽毛段或僅剩羽干。研究發(fā)現(xiàn)在羽毛降解中，菌株NLG1和S2-2降解羽毛速度快、降解完整性更高。

羽毛培養(yǎng)基2的降解液可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果如圖3所示。所有接種菌液的培養(yǎng)基，其降解液可溶性蛋白含量均較空白對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。其中接種NLG1的羽毛降解液可溶性蛋白含量最高，為(9.21±0.06) μg/mL。

結(jié)合羽毛培養(yǎng)基1、2的結(jié)果，菌株NLG1可快速降解羽毛、可溶性蛋白含量高，確定其為目標(biāo)菌株。

圖中對(duì)應(yīng)各菌株接種順序從左到右依次為：空白(無菌)、NLG1、NLG2、NLG6、S1-1、S1-2、S2-1、S2-2、LY。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 菌落形態(tài)和染色結(jié)果

將菌株NLG1接種于LB固體培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼觀察結(jié)果，如圖4所示，培養(yǎng)初期，菌落形態(tài)接近圓形、顏色淺黃且不透明，表面光滑邊緣整齊；培養(yǎng)后期，菌落顏色呈白色或乳白色，表面粗糙不規(guī)則、有皺褶，中間有突起或凹陷，邊緣不整齊，四周云霧狀擴(kuò)散。將該菌進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖4所示，染色后顏色呈紫色，形態(tài)為桿狀，有芽孢，故該菌株為革蘭氏陽性(G+)芽孢桿菌。

A：菌株NLG1在LB固體培養(yǎng)基的菌落形態(tài)；B：菌株NLG1細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果(100×)。

2.3.2 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

經(jīng)總DNA的提取、擴(kuò)增，送至生工基因測(cè)序后得到的結(jié)果在NCBI的BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫已測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果如圖5所示，菌株NLG1的16S rDNA基因序列與貝萊斯芽孢桿菌NR 075005.2 (BacillusvelezensisNR 075005.2)具有同源性，長(zhǎng)度約1 484 bp，GenBank保守序列登錄號(hào)為MZ 959415。綜合形態(tài)學(xué)和分子鑒定的結(jié)果，初步判定并命名為貝萊斯芽孢桿菌NLG1(BacillusvelezensisNLG1)。

2.4 菌株NLG1生長(zhǎng)曲線

由圖6可知，菌株NLG1在0～3 h進(jìn)入發(fā)育遲緩期；在3～5 h迅速繁殖進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；隨后生長(zhǎng)速度變緩，在13～15 h進(jìn)入穩(wěn)定期；培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)超過15 h后進(jìn)入衰亡期。

Bacillus subtilis:枯草芽孢桿菌;Bacillus velezensis:貝萊斯芽孢桿菌;Bacillus vietnamensis:越南芽孢桿菌;Bacillus sporothermodurans:耐熱芽孢桿菌。

圖6 菌株NLG1的生長(zhǎng)曲線

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 溫度對(duì)菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響

由圖7可知，27 ℃為其降解羽毛的最適溫度，測(cè)得可溶性蛋白含量最高，為(23.73±0.07) μg/mL，較其他溫度條件均差異顯著(P<0.05)。

2.5.2 初始pH對(duì)菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響

由圖8可知，發(fā)酵初始pH由5增加至10時(shí)，羽毛降解液中可溶性蛋白含量線性增加，并達(dá)到最高值(34.20±0.57) μg/mL；當(dāng)初始pH增加至11、12時(shí)，降解液中可溶性蛋白含量迅速降低后再次增加，且與初始pH為10時(shí)可溶性蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

圖7 溫度對(duì)菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)

圖8 初始pH對(duì)菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)

2.5.3 底物濃度對(duì)菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響

由圖9可知，底物濃度由0.5%增加至3.0%，降解液中可溶性蛋白含量呈先增加后降低，并在底物濃度為2.5%，可溶性蛋白含量抵達(dá)峰值為(38.56±2.21) μg/mL，且相對(duì)其他底物濃度可溶性蛋白含量均差異顯著(P<0.05)。因此，2.5%的底物濃度更利于菌株NLG1降解羽毛。

圖9 底物濃度對(duì)菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)

2.5.4 活菌數(shù)對(duì)菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響

由圖10可知，接種活菌數(shù)由106CFU/mL增加至109CFU/mL時(shí)，降解液中可溶性蛋白含量隨接種活菌數(shù)濃度增加呈線性增加趨勢(shì)。以此說明，在時(shí)間及其他各條件不變的情況下，接入活菌數(shù)越多對(duì)羽毛降解和可溶性蛋白產(chǎn)生越有利。

圖10 活菌數(shù)對(duì)菌株NLG1降解羽毛產(chǎn)

2.5.5 外加碳源對(duì)菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響

由圖11可知，不添加任何外加碳源的對(duì)照組降解液中可溶性蛋白含量較添加任意外加碳源組均差異顯著(P<0.05)；可溶性淀粉組與麥芽糖組降解液可溶性蛋白含量之間差異不顯著(P>0.05)，與其他外加碳源組均差異顯著(P<0.05)。因此，其他條件穩(wěn)定不變的條件下，在菌株NLG1降解羽毛過程中額外補(bǔ)充可溶性淀粉更利于羽毛快速降解、釋放可溶性蛋白。

圖11 外加碳源對(duì)菌株NLG1降解羽毛

2.5.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株NLG1羽毛發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白含量的影響

由圖12可知，降解液中可溶性蛋白含量呈增加、平穩(wěn)、降低、再平穩(wěn)的趨勢(shì)。在發(fā)酵的第3天，可溶性蛋白含量迅速增加到(32.76±0.07) μg/mL；在發(fā)酵的第3～5天維持不變，自第6天起可溶性蛋白含量降低且平穩(wěn)。

圖13為菌株NLG1在0～8 d內(nèi)羽毛降解變化圖。瓶中羽毛隨時(shí)間推移，羽干、羽枝逐漸被降解，降解液顏色變深、液體變渾濁。

2.6 上清液氨基酸成分分析結(jié)果

2.6.1 羽毛降解液中氨基酸總量測(cè)定結(jié)果

由表2可知，在第0天的羽毛發(fā)酵液中雖然能檢測(cè)出17種氨基酸，但各個(gè)氨基酸的檢出量極低，氨基酸總量也僅為27.41 mg/g；在第3天的羽毛發(fā)酵液中檢測(cè)出的氨基酸種類保持不變，但各個(gè)氨基酸的檢出量和總氨基酸含量均有所增加。除組氨酸、蛋氨酸含量增加較少外，其余各個(gè)氨基酸含量都有較大幅度提高，尤其半胱氨酸含量增加了14.24 mg/g。

圖12 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株NLG1降解羽毛

圖13 菌株NLG1羽毛降解過程

2.6.2 羽毛降解液中游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

在NLG1降解的第0天，從上清液中檢測(cè)到包括基礎(chǔ)游離氨基酸及其他游離氨基酸在內(nèi)的游離氨基酸共計(jì)23種。除此之外檢測(cè)出尿素、?；撬岷图‰?，但未檢測(cè)出胱氨酸和苯丙氨酸這2種基礎(chǔ)游離氨基酸。降解第3天在羽毛降解上清液中可檢測(cè)出18種基礎(chǔ)氨基酸及其另外10種游離氨基酸衍生物、尿素、?；撬岷图‰?。經(jīng)3 d降解后的上清液中除甘氨酸、鳥氨酸和羥脯氨酸含量分別降低了0.012 2、0.000 5和0.561 0 mg/g外，其余游離氨基酸、衍生物等均有較大程度的增加。基礎(chǔ)氨基酸中纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸谷氨酸和丙氨酸含量增加明顯。而其他氨基酸中β-丙氨酸含量有大幅增加，羥脯氨酸和鳥氨酸含量降低；通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尿素、?；撬岷图‰暮恳灿性黾?。

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)羽毛降解的影響

溫度、初始pH、底物濃度、活菌數(shù)和發(fā)酵時(shí)間以及適合的碳源是影響羽毛降解的必要條件，更是影響微生物生長(zhǎng)及代謝的重要因素。尹靜等[16]從腐爛藍(lán)藻中分離的粘質(zhì)沙雷氏菌SYBC YH(SerratiamarcescensSYBC YH)降解羽毛產(chǎn)可溶性蛋白最適溫度為40 ℃，最適pH為7。本研究所采用的菌株產(chǎn)可溶性蛋白的發(fā)酵溫度、初始pH作用范圍更廣，溫度可為25.0～43.0 ℃，最適溫度為27.0 ℃；初始pH可為5～12，最適pH為10。通過調(diào)節(jié)溫度以及初始pH發(fā)現(xiàn)，該菌的羽毛降解能力在接近室溫、初始pH為堿性時(shí)更強(qiáng)。傅偉[9]在研究中證明，用0.1% Ca(OH)2處理3 h對(duì)微生物降解羽毛具有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，初始pH 10～12出現(xiàn)折線趨勢(shì)可能也是這一原因引起。羽毛作為唯一碳、氮源底物，濃度低時(shí)微生物最大限度利用羽毛、釋放可溶性蛋白，底物消耗殆盡后，可溶性蛋白可充當(dāng)二次底物導(dǎo)致消耗現(xiàn)象；底物過剩，導(dǎo)致培養(yǎng)基密集度和黏度增加，致使通氧量不足，引發(fā)微生物的底物消耗能力受限，影響可溶性蛋白含量[17]。當(dāng)微生物降解羽毛的作用時(shí)間以及底物濃度一定時(shí)，添加的活菌越多羽毛降解速度越快、可溶性蛋白產(chǎn)量越多。額外添加的碳源及時(shí)緩解了羽毛底物碳源匱乏問題，同時(shí)也能誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生誘導(dǎo)型羽毛降解酶[18]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加可溶性淀粉與添加麥芽糖的可溶性蛋白含量差異不顯著，而結(jié)果優(yōu)于添加麥芽糖組，可能是可溶性淀粉水解過程中產(chǎn)生多種類碳源均能進(jìn)一步促進(jìn)菌株生長(zhǎng)、作用，且可溶性淀粉取材廉價(jià)，更適作為試驗(yàn)研究的優(yōu)選外加碳源。發(fā)酵是微生物降解羽毛保持動(dòng)態(tài)平衡的過程。郭剛等[19]所采用的地衣芽孢桿菌在發(fā)酵第3天時(shí)可溶性蛋白含量增長(zhǎng)至最高后迅速降低。本研究所采用菌株發(fā)酵3～5 d亦使可溶性蛋白含量維持穩(wěn)定狀態(tài)，羽毛分解更徹底。

表2 羽毛上清液中總氨基酸組成及含量變化

表3 羽毛上清液中游離氨基酸組成及含量變化

續(xù)表3項(xiàng)目 Items第0天 Day 0 第3天 Day 3 增加量 Increasing content脯氨酸 Pro0.121 31.254 41.133 1天冬酰胺 Asn0.293 40.293 4瓜氨酸 Citn0.099 51.115 01.015 5鳥氨酸 Orn0.045 60.045 1-0.000 5磷酸絲氨酸 Pser0.273 20.965 10.692 0?；撬?Taurine0.136 40.151 50.015 1尿素 Urea0.097 40.965 90.868 5α-氨基已二酸 AAD0.012 40.079 80.067 4α-氨基丁酸 AABA0.244 70.244 7β-丙氨酸 β-Ala5.493 45.493 4β-氨基異丁酸 IUPAC0.517 60.517 6γ-氨基丁酸 GABA0.025 80.061 80.036 1肌肽 CAR0.101 50.180 20.078 7羥脯氨酸 HYP0.690 70.129 7-0.561 0合計(jì) Total3.969 566.327 062.357 4

3.2 羽毛上清液氨基酸成分及含量變化的分析

羽毛是由多種氨基酸組成的復(fù)雜蛋白質(zhì)，羽毛降解菌將其分解成小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、多肽類、游離氨基酸及其他物質(zhì)。本試驗(yàn)測(cè)定發(fā)酵前后的氨基酸組分，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵條件和微生物可影響羽毛降解液的氨基酸種類[13,20-21]。發(fā)酵后上清液中氨基酸含量增加，其中半胱氨酸含量最多；除色氨酸未檢出外，其余7種必需氨基酸占氨基酸總含量的34.83%。半胱氨酸的產(chǎn)生意味著存在大量二硫鍵的羽毛結(jié)構(gòu)被打開，通過微生物降解將其還原成胱氨酸，推測(cè)本研究采用的菌株NLG1具有二硫鍵還原作用，同樣在涂國(guó)全等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)羽毛降解液中存在大量二硫鍵還原酶。色氨酸在羽毛降解過程中可能被微生物作為二次底物消耗轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。在游離氨基酸檢測(cè)中，除檢測(cè)出了大量的尿素外還檢測(cè)出β-丙氨酸等氨基酸衍生物，因此說明，氨基酸總量降低、游離氨基酸含量增加，是由于微生物降解羽毛過程中發(fā)生了大量的轉(zhuǎn)氨基、脫氨基作用。發(fā)酵后羽毛上清液中檢測(cè)出必需游離氨基酸總量占總檢出量的85.07%，如纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸等。纈氨酸是一種支鏈氨基酸，也是動(dòng)物必需氨基酸之一，是動(dòng)物體蛋白質(zhì)的重要組成成分[22]，也是蛋白質(zhì)合成代謝中的重要參與者[23]，能促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)[24]、能量供給[25]、增強(qiáng)免疫[26]及改善畜產(chǎn)品品質(zhì)[27]。苯丙氨酸既屬于芳香族氨基酸又屬于必需氨基酸，是藥物的中間體和原料，同時(shí)也應(yīng)用于化工和食品領(lǐng)域生產(chǎn)護(hù)膚品和添加劑阿斯巴甜的原料[28]?？梢?，羽毛降解液是一種氨基酸來源，也是必需氨酸的非常重要來源，為后期應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)篩選出1株可降解羽毛的天然微生物菌株，鑒定并命名為貝萊斯芽孢桿菌NLG1。

② 基于羽毛培養(yǎng)基，貝萊斯芽孢桿菌降解羽毛培養(yǎng)條件優(yōu)化為：溫度27 ℃，初始pH 10，接種活菌數(shù)109CFU/mL，底物濃度2.5%，外加碳源為可溶性淀粉，培養(yǎng)時(shí)間3 d。

③ 貝萊斯芽孢桿菌可降解羽毛，羽毛發(fā)酵液上清液中可溶性蛋白含量為(32.76±0.07) μg/mL，水解氨基酸總量提高了87.67 mg/g，游離氨基酸及衍生物總量提高了62.36 mg/g，改善了羽毛的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和氨基酸組成結(jié)構(gòu)。