黃姑魚腸道上皮細胞體外分離培養(yǎng)及鑒定

王立改 曾延清,2 汪 波,3 譚 朋 陳睿毅 竺奇慧 徐冬冬*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，舟山316000；2.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，舟山316000；3.中國海洋大學(xué)，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，青島266003)

腸道不僅是魚類消化吸收的重要器官，也是其免疫系統(tǒng)的重要組成部分，直接影響魚體健康。魚類腸道由多種細胞組成，其中，腸道上皮細胞(intestinal epithelial cell，IECs)是腸道的主要功能細胞，參與腸道內(nèi)食物的消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等。因此，腸道上皮細胞是研究腸道生理功能、藥物代謝及病理變化的重要細胞模型[1]。其中，體外培養(yǎng)腸道上皮細胞是研究外源物質(zhì)(如營養(yǎng)素)對腸道上皮細胞作用及各種致病因素導(dǎo)致腸黏膜病理改變的發(fā)病機制的重要途徑[2]。因此，建立魚類腸道上皮細胞體外培養(yǎng)方法具有非常重要的意義。

目前，魚類腸道上皮細胞原代培養(yǎng)方法在多種海、淡水魚類中已有相關(guān)報道，如斑帶副鱸(Paralabraxmaculatofasciatus)[3]、鯽魚(Carassiusauratus)[1]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[4]、大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[5]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[6]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]等。尤其在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中，Kawano等[8]首次建立了呈上皮樣形態(tài)的腸道細胞系——RTgutGC細胞系，已經(jīng)成功傳代100次以上。建立腸道上皮細胞培養(yǎng)方法可為研究魚類腸道健康問題提供重要的體外試驗材料。一些學(xué)者利用體外培養(yǎng)的腸道上皮細胞分析了不同抗?fàn)I養(yǎng)因子[4,6]或植物化學(xué)成分[9]對其細胞活力、形態(tài)及功能的影響；在大西洋鱈魚中，學(xué)者們利用腸道上皮細胞研究了益生菌和海藻酸對其免疫調(diào)節(jié)作用[5,10]；Antony等[11]則利用虹鱒RTgutGC細胞系進行了魚類營養(yǎng)吸收機制的研究。因此，體外培養(yǎng)腸道上皮細胞在魚類營養(yǎng)學(xué)、免疫學(xué)及生理生化等方面的研究中具有非常重要的應(yīng)用價值。

黃姑魚(Nibeaalbiflora)隸屬于鱸形目(Perciformes)，石首魚科(Sciaenidae)，黃姑魚屬(Nibea)，是我國東南沿海重要的海水養(yǎng)殖魚類。其養(yǎng)殖規(guī)模在福建省、浙江省不斷擴大，已經(jīng)成為網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要品種。目前，在黃姑魚營養(yǎng)飼料研發(fā)中，我們發(fā)現(xiàn)高比例豆粕飼料會造成黃姑魚食源性腸道損傷[12]，此外，集約化養(yǎng)殖環(huán)境下腸道病菌性感染經(jīng)常引發(fā)黃姑魚的大量死亡，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。然而，由于缺乏黃姑魚腸道上皮細胞模型，限制了黃姑魚腸道上皮細胞的生理功能和病菌致病機制的進一步研究。盡管已經(jīng)在一些魚類上建立了腸道上皮細胞的原代培養(yǎng)方法，但是由于魚種的不同，其所用的細胞培養(yǎng)條件和方法亦有所不同，所以需要針對特定的魚種進行腸道上皮細胞分離及培養(yǎng)條件的摸索工作。因此，本研究旨在建立一種快速有效的黃姑魚腸道上皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定方法，為開展黃姑魚腸道功能和病理機制等研究提供體外腸道上皮細胞模型，并為海水魚類腸道功能及其相關(guān)發(fā)病機制的研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用黃姑魚取自浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒漁業(yè)科技島，體重為(40.5±2.5) g。取健康活潑的試驗魚飼養(yǎng)于含抗生素的水體中，禁食2 d后用于本試驗。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(371，美國Thermo公司)、倒置顯微成像系統(tǒng)(DMi8，德國Leica公司)、正置熒光顯微鏡(Eclipse C1，日本Nikon公司)、脫色搖床(TSY-B，武漢賽維爾生物科技有限公司)、分光光度計(NanoDrop 2000，美國Thermo公司)。

主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)、Penicillin-Streptomycin雙抗(美國Hyclone公司)、膠原蛋白酶(美國Worthington公司)、透明質(zhì)酸酶(美國Worthington公司)、胰蛋白酶(美國Worthington公司)、DNAase Ⅰ(日本TaKaRa公司)、青霉素G鈉鹽和硫酸鏈霉素(上海生工生物工程有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，G0002，武漢賽維爾生物科技有限公司)、破膜工作液(G1204，武漢賽維爾生物科技有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，G5001，武漢賽維爾生物科技有限公司)、一抗[兔來源細胞角蛋白-18(CK-18)，武漢賽維爾生物科技有限公司]、二抗[山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG) H&L(Alexa Fluor?488)，武漢賽維爾生物科技有限公司]、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)(G1012，武漢賽維爾生物科技有限公司)、抗熒光淬滅封皮劑(G1401，武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.3 試驗材料前處理及細胞分離

黃姑魚腸道上皮細胞分離方法參照宋增福等[1]和Zhang等[7]的方法，并經(jīng)過多次預(yù)試驗后作了一定修改。具體方法如下：1)在無菌室中，取禁食2 d后的黃姑魚于托盤中，敲打頭部致死，體表及魚體周圍用70%酒精消毒；2)取出腸道，剪除腸系膜，縱行剪開腸壁，浸沒在含有Penicillin-Streptomycin雙抗的PBS溶液中沖洗數(shù)次，然后加適量DMEM/F12培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下去除腸道上脂肪和腹膜等；3)將腸道轉(zhuǎn)移至加適量(可完全浸沒腸道組織)DMEM/F12培養(yǎng)基的小燒杯中，將腸道組織剪碎至小于1 mm3的組織塊；4)用約3倍體積的DMEM/F12培養(yǎng)基清洗腸道組織塊，4 ℃、200×g離心5 min，重復(fù)3次；5)加入約4倍體積的蛋白酶消化液[胰蛋白酶0.25%、膠原蛋白酶1 mg/mL、透明質(zhì)酸酶0.16 mg/mL、胎牛血清(FBS)5%、DNase Ⅰ 0.05%溶于DMEM/F12培養(yǎng)基]到15 mL離心管中，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中27 ℃消化；分別在0、20、40、60、80 min時，用槍輕輕吹打混勻，取適量混勻消化液用臺盼藍染色細胞，在顯微鏡下檢查消化情況，并將同一時間點殘留的腸道組織取出適量進行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察腸道消化后的情況，以確定最佳消化終止時間；6)用30 μm細胞篩過濾消化液至50 mL離心管中，4 ℃、200×g離心5 min，重復(fù)2次；最后棄上清，加1 mL DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞。

1.4 黃姑魚腸道上皮細胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：將重懸的細胞調(diào)整細胞密度為1×105個/孔，并將細胞接種到鋪有Ⅰ型膠原蛋白的6孔細胞培養(yǎng)板中。每孔加細胞培養(yǎng)液2 mL[含表皮生長因子(EGF)0.01 mg/L、胎牛血清5%、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.02 mg/mL、胰島素220 U/L、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)70 ng/mL、肝素100 mg/mL、Penicillin-Streptomycin雙抗100 U/mL]，接種后在27 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。根據(jù)成纖維細胞和上皮細胞的貼壁時間不同，成纖維細胞貼壁速度比上皮細胞快，在培養(yǎng)90 min后，把培養(yǎng)液連同未貼壁的細胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。在原代培養(yǎng)過程中，每48 h更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d后基本鋪滿底壁。

傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)7～9 d后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)和形態(tài)特征，當(dāng)細胞生長至80%～90%或鋪滿底壁時，即可進行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時移去培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化液；在倒置顯微鏡下觀察，1～2 min后當(dāng)細胞回縮、變圓、成團的漂浮于消化液中時立即用DMEM/F12含5%血清終止消化，稍傾斜6孔板，加入適量培養(yǎng)液，輕柔吹打直至細胞完全脫離孔板；收集細胞，200×g離心5 min，棄上清，PBS清洗2次；加入適量傳代細胞培養(yǎng)基(含EGF 0.01 mg/L、胎牛血清5%、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.02 mg/mL、胰島素220 U/L、IGF-Ⅰ 70 ng/mL、肝素100 mg/mL、Penicillin-Streptomycin雙抗100 U/mL)，根據(jù)細胞密度以1∶2繼續(xù)接種到新的培養(yǎng)板進行傳代培養(yǎng)。

1.5 生長曲線繪制

用噻唑藍(MTT)法繪制細胞的生長曲線。將傳代培養(yǎng)的細胞以6.0×104個/mL的密度接種于24孔板中，置于27 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第2天起，每天在同一時間分別在24孔板中取3孔細胞，用MTT細胞增殖試劑盒測定在490 nm處的吸光度(OD)值，連續(xù)取8 d。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制細胞的生長曲線。

1.6 黃姑魚腸道上皮細胞CK-18鑒定

將傳代的細胞以2×105個/mL的密度接種至6孔培養(yǎng)板中，進行細胞爬片。具體操作如下：將蓋玻片用洗潔劑清洗干凈，然后用自來水將洗潔劑沖洗干凈，再用純水沖洗3遍，浸泡在75%的酒精中靜置10 min；用鑷子夾起蓋玻片在酒精燈上將酒精燒干(溫度不可過高)；將燒干的蓋玻片放在6孔板中，待冷卻后將細胞懸液(2×105個/mL)滴加在蓋玻片上；5 h后輕輕補加1 mL培養(yǎng)基，置27 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細胞貼在玻片上良好生長，且細胞間留有空隙，未連接成片，此時棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min后，倒掉，然后用PBS清洗3次，每次5 min；爬片稍甩干后加50～100 μL破膜工作液，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min；然后滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；輕輕甩掉封閉液，在細胞孔板里滴加一抗(1∶500稀釋)，細胞培養(yǎng)板平放于濕盒內(nèi)4 ℃冰箱過夜孵育；細胞孔板置于脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。稍甩干后滴加二抗(1∶400稀釋)覆蓋組織，室溫孵育50 min；爬片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min；用抗熒光淬滅封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7 黃姑魚腸道上皮細胞表面標(biāo)志性蛋白熒光定量表達分析

待傳代的黃姑魚腸道上皮細胞培養(yǎng)密度達到90%以上時，提取細胞總RNA，并用分光光度計測定RNA純度和濃度，保證RNA樣品吸光度(OD)260/280的值在1.8～2.0。提取總RNA樣品通過凝膠電泳檢測RNA完整性。提取的總RNA樣品使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)結(jié)束后cDNA樣品保存-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

以黃姑魚β-肌動蛋白(β-actin)為持家基因，根據(jù)課題組獲得的黃姑魚轉(zhuǎn)錄組結(jié)果設(shè)計封閉蛋白(Claudin)、閉合蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein-1，ZO-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)和上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，引物序列如表1所示。使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行實時熒光定量PCR(qPCR)。qPCR程序如下：94 ℃下預(yù)變性10 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，40個循環(huán)，反應(yīng)體積10 μL。Claudin、Occludin、ZO-1、AKP和E-cadherin的mRNA相對表達量使用2-ΔΔCt方法[13]計算。

表1 黃姑魚腸道上皮細胞標(biāo)志性蛋白的qPCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 黃姑魚腸道上皮細胞分離

本試驗采用胰蛋白酶、膠原蛋白酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化法對黃姑魚腸道組織進行不同時間(0、20、40、60、80 min)的消化分離，對所分離的細胞進行了臺盼藍染色，用以檢測所得細胞活性，并對消化不同時間點的殘留腸道組織進行HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，消化0 min時便可以得到少量的腸道上皮細胞，但是此時未見細胞團的出現(xiàn)；消化20 min時得到的腸道上皮細胞也較少；消化40 min時腸道上皮細胞逐漸增多，較小的細胞團開始出現(xiàn)；消化60和80 min時，得到的腸道上皮細胞和細胞團最多，細胞團也較大。相應(yīng)的HE染色分析可以很好地解釋細胞的分離結(jié)果，消化20 min時腸道組織的一些腸絨毛被消化下來，但仍有大部分腸絨毛未被消化，消化40 min時腸道組織的絨毛已經(jīng)有較多的部分被消化下來，消化60 min和80 min時腸道組織的絨毛近乎全部從腸道基膜上消化下來。根據(jù)細胞形態(tài)和細胞團數(shù)目上分析，本研究建議在40～60 min終止細胞消化。

2.2 黃姑魚腸道上皮細胞的原代及傳代培養(yǎng)

取消化50 min的黃姑魚腸道上皮細胞進行原代細胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)90 min后，把培養(yǎng)液連同未貼壁的細胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)3 d時，黃姑魚腸道上皮細胞開始貼壁生長，多數(shù)細胞單個生長(圖2-a)；在培養(yǎng)5 d時，細胞開始鋪展開來，呈“鋪路石”狀(圖2-b)；在培養(yǎng)7 d時，黃姑魚腸道上皮細胞匯合成片，顯微鏡下觀察細胞呈致密單層排列，細胞鋪滿80%底壁，并呈明顯的鋪路石狀(圖2-c)。傳代至第5代培養(yǎng)結(jié)果表明，細胞呈圓形，種類較為單一且細胞界限清晰(圖3)。

2.3 黃姑魚腸道上皮細胞生長曲線

利用MTT細胞增殖試劑盒測得的OD值作腸道上皮細胞生長曲線圖，結(jié)果如圖4所示，腸道上皮細胞的生長曲線呈“S”形，在第4天開始呈指數(shù)期生長，到第7天趨于平緩。

2.4 黃姑魚腸道上皮細胞CK-18蛋白熒光鑒定

CK-18屬于上皮細胞特異性抗原成分之一。本試驗用細胞免疫熒光檢測方法來鑒定所培養(yǎng)的細胞類型。檢測結(jié)果顯示(圖5)，CK-18在傳代細胞中的表達呈陽性，表明本試驗所培養(yǎng)的傳代細胞為腸道上皮細胞。

2.5 黃姑魚腸道上皮細胞標(biāo)志性蛋白的基因表達

本研究分析了腸道上皮細胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin、Claudin、Occludin、ZO-1和AKP在傳代細胞中的表達，qPCR分析顯示這些基因在傳代培養(yǎng)的細胞中均有表達，進一步證明所培養(yǎng)的細胞是黃姑魚腸道上皮細胞。

3 討 論

3.1 黃姑魚腸道上皮細胞消化分離及原代細胞培養(yǎng)方法的建立

腸道上皮細胞是魚類腸道的主要功能細胞，本研究利用酶消化分離法成功從黃姑魚腸道獲得連續(xù)生長的腸道上皮細胞。腸道組織中的隱窩具有增殖分化能力，能支持細胞持續(xù)增殖，是腸道上皮細胞原代培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。消化酶可以將腸黏膜消化成包含隱窩的黏膜細胞團。宋增福等[1]利用膠原蛋白酶Ⅰ 0.2 g/L、乙二胺四乙酸(EDTA)0.02%和膠原蛋白酶Ⅳ 0.2 g/L的消化液，28 ℃水浴振蕩消化20 min獲得了較多的鯽魚腸上皮絨毛隱窩單位和細胞團；姚仕彬等[6]利用膠原蛋白酶Ⅰ和Ⅳ聯(lián)合消化液，28 ℃水浴振蕩消化30 min得到了較多的草魚腸黏膜上皮細胞團。與上述魚類腸道細胞的分離方法相比，本研究在黃姑魚腸道上皮細胞分離過程中，除使用了膠原蛋白酶外，還聯(lián)合使用了胰蛋白酶和透明質(zhì)酸酶，這樣可以加速隱窩的分離并保持隱窩的完整性和細胞活力，減少腸道上皮細胞分離時的損傷[14]，獲得了大量的黃姑魚腸道上皮細胞和細胞團。然而，席柔[15]在雞胚盲腸道上皮細胞分離中發(fā)現(xiàn)膠原蛋白酶Ⅰ要顯著高于膠原蛋白酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化獲得的腸道上皮細胞，此結(jié)果與本研究結(jié)果不同的原因可能是因為魚類和雞的腸道上皮細胞的特性有一定的差別[16]。此外，研究表明酶的消化時間越長對細胞的損傷就會越大，胰蛋白酶會破壞細胞膜表面的鈣黏蛋白和層黏蛋白，致使細胞無法貼壁而死亡[17-18]。然而，酶消化時間太短則不能得到大量的腸道上皮細胞及細胞團。因此，確定腸道上皮細胞最佳消化時間至關(guān)重要。本試驗通過設(shè)定不同消化時間，聯(lián)合使用胰蛋白酶(0.25%)、膠原蛋白酶(1 mg/mL)和透明質(zhì)酸酶(0.16 mg/mL)消化黃姑魚腸道上皮細胞，得出在消化40～60 min時，可以獲得大量的黃姑魚腸道上皮細胞和細胞團。

成纖維細胞是腸道上皮細胞培養(yǎng)的主要污染細胞，一般采用機械刮除法[19]、反復(fù)貼壁法[1,19]及胰蛋白酶消化排除法[14,19]等方法進行純化。本試驗根據(jù)成纖維細胞貼壁速度比上皮細胞快的特點，在培養(yǎng)90 min后，把培養(yǎng)液連同未貼壁的細胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)[1]，得到了生長良好的貼壁腸道上皮細胞。此外，本試驗在黃姑魚腸道上皮細胞培養(yǎng)液中也添加了適當(dāng)濃度的EGF[1]、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素[20]、IGF-Ⅰ[21]及肝素[22]，這些營養(yǎng)素可以促進腸道細胞快速貼壁增殖，并有效抑制成纖維細胞的生長，培養(yǎng)的原代腸道上皮細胞生長狀態(tài)良好。

a、c、e、g、i分別為腸道組織消化0、20、40、60和80 min時殘留腸道組織HE染色圖，b、d、f、h、j分別為腸道組織消化0、20、40、60和80 min時所得細胞臺盼藍染色圖。黃色箭頭為腸道上皮細胞，紅色箭頭為腸道上皮細胞團。

a：培養(yǎng)3 d的黃姑魚腸道上皮細胞；b：培養(yǎng)5 d的黃姑魚腸道上皮細胞；c：培養(yǎng)7 d的黃姑魚腸道上皮細胞。

圖3 傳代至第5代培養(yǎng)的黃姑魚腸道上皮細胞

3.2 黃姑魚腸道上皮細胞傳代培養(yǎng)及鑒定

胰酶可以降低非上皮細胞的貼壁能力，所以細胞在傳代培養(yǎng)時一般用胰酶處理。本研究采用0.25%胰酶消化原代培養(yǎng)的黃姑魚腸道上皮細胞后獲得了連續(xù)生長的傳代細胞，這與Patkaew等[23]結(jié)果一致。而古少鵬等[24]采用0.25%胰酶與0.02% EDTA聯(lián)合消化，并發(fā)現(xiàn)加入EDTA后可以降低胰酶對雞胚盲腸道上皮細胞損傷，傳代培養(yǎng)細胞活性高。后續(xù)研究可加入EDTA進一步優(yōu)化黃姑魚腸道上皮細胞傳代條件。本研究中，傳代后的黃姑魚腸道上皮細胞呈“鋪路石”樣，傳代至第5代培養(yǎng)結(jié)果表明，細胞呈圓形，種類較為單一且細胞界限清晰。

相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

體外培養(yǎng)腸道上皮細胞的鑒別方法主要有形態(tài)學(xué)觀察[25]、細胞免疫熒光檢測法[18,22]和電子顯微鏡觀察[1,14]等方法。本研究中，傳代培養(yǎng)的腸道上皮細胞呈明顯圓形的上皮細胞特征，細胞生長呈鋪路石狀[1,25]，并利用MTT法檢測傳代細胞生長曲線，結(jié)果顯示培養(yǎng)的傳代細胞生長曲線符合上皮細胞典型的“S”形生長特性。CK-18是一種特異性細胞骨架蛋白，是上皮細胞生長、分化及成熟的特征性標(biāo)志物[26-27]。本研究利用特異性抗原細胞CK-18對傳至第5代的細胞進行了細胞免疫熒光檢測，檢測結(jié)果表明，傳代后的黃姑魚腸道細胞免疫熒光呈陽性，說明傳代的細胞仍為腸道上皮細胞[18]。腸型AKP存在于腸道上皮細胞刷狀緣上，是腸道上皮細胞標(biāo)志酶；E-cadherin、Claudin、Occludin和ZO-1均是參與形成和維持上皮細胞之間的重要的連接蛋白。本研究通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)這些腸道上皮細胞標(biāo)志性蛋白在培養(yǎng)的傳代細胞中均有表達，進一步證明本試驗中培養(yǎng)的傳代細胞為黃姑魚腸道上皮細胞[18,22]。

a：CK-18顯色結(jié)果為綠色；b：DAPI細胞核染色為藍色；c：CK-18和DAPI共顯色位置。

圖6 傳代培養(yǎng)細胞中腸道上皮

4 結(jié) 論

本研究建立了黃姑魚腸道上皮細胞的原代及傳代細胞培養(yǎng)方法，為黃姑魚腸道功能研究及病理機制的研究提供體外細胞模型試驗材料，并為其腸道上皮細胞系的建立奠定了基礎(chǔ)，也可為海水魚類腸道功能的研究提供技術(shù)支撐。