發(fā)酵金針菇多糖通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB-NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)

馬 升 高青瑩 徐建雄

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240)

炎癥反應(yīng)是機(jī)體受到損傷或有害刺激后產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)[1]，其與許多疾病如肝硬化、癌癥和糖尿病等慢性疾病的發(fā)展聯(lián)系密切[2]。巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，可以對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行吞噬和消化，當(dāng)受到脂多糖(LPS)等刺激后會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為一氧化氮(NO)分泌增加，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)升高[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是參與細(xì)胞對(duì)外界刺激響應(yīng)的蛋白，在調(diào)控機(jī)體炎癥中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也是NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)信號(hào)通路激活的啟動(dòng)信號(hào)[4]。NF-κB p65通常與核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白α(IκBα)以非活性形式結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞被細(xì)菌或病毒刺激時(shí)，IκBα和NF-κB p65被降解，從而進(jìn)入細(xì)胞核執(zhí)行其功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3信號(hào)通路可識(shí)別外來微生物感染和細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)[6]，通過NLRP3炎性小體的聚集介導(dǎo)宿主對(duì)微生物感染和細(xì)胞損傷的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白轉(zhuǎn)化為活化的Caspase-1以及細(xì)胞因子前體白細(xì)胞介素-1β(Pro-IL-1β)和前體白細(xì)胞介素-18(Pro-IL-18)轉(zhuǎn)化為成熟的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)[7]。

金針菇(Flammulinavelutipes)學(xué)名毛柄金錢菇，因其營(yíng)養(yǎng)豐富和口感鮮美而備受消費(fèi)者喜愛[8]。金針菇富含多糖、甾醇、蛋白質(zhì)和膳食纖維等多種活性物質(zhì)[9]。金針菇多糖(FVP)是從金針菇中提取的水溶性多糖[10]，具有多種生物活性，體現(xiàn)在抗氧化[11]、促進(jìn)腸道健康[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等方面。FVP能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)、干擾素和細(xì)胞因子等，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抗炎能力[14]。Zhao等[15]發(fā)現(xiàn)FVP可以減輕潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，降低炎癥基因的表達(dá)水平，并增強(qiáng)機(jī)體的代謝和免疫能力。

發(fā)酵具有周期短、成本低、產(chǎn)量大、有工業(yè)化生產(chǎn)前景等優(yōu)勢(shì)，金針菇在發(fā)酵過程中除產(chǎn)生菌絲體外，還會(huì)在發(fā)酵液中產(chǎn)生多糖、多肽、生物堿、酶、氨基酸、維生素和植物激素等活性物質(zhì)[16]。研究表明，很多食用菌液體發(fā)酵的菌絲體多糖含量遠(yuǎn)高于子實(shí)體[17]。曾璇竹等[18]研究了香菇多糖發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性，結(jié)果表明香菇發(fā)酵后多糖提取量和抗氧化活性顯著升高。劉自堯等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槐耳-板藍(lán)根發(fā)酵后發(fā)酵體系中具有抗炎、抗腫瘤作用的多糖含量逐漸升高，且發(fā)酵后的多糖提取物能更明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞NO和TNF-α的分泌。

本課題組前期對(duì)金針菇進(jìn)行發(fā)酵處理并從發(fā)酵金針菇中提取多糖，通過研究發(fā)現(xiàn)，相比FVP，發(fā)酵金針菇多糖(FFVP)分子聚集作用增強(qiáng)，單糖組成中甘露糖比例顯著升高，同濃度下FFVP的抗氧化活性高于FVP[20]。然而，F(xiàn)VP和FFVP調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及可能的機(jī)制還未知。本研究采用LPS誘導(dǎo)構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，探討FVP和FFVP抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制，以期為合理利用金針菇提供理論基礎(chǔ)，并為抑制炎癥反應(yīng)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FVP和FFVP，由本實(shí)驗(yàn)室提取純化[20]；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；LPS，購(gòu)自Sigma公司；杜氏磷酸緩沖液(DPBS)、胎牛血清、雙抗、DMEM培養(yǎng)基、中性紅溶液、脫脂奶粉、RIPA裂解液、BAY11-7082(NF-κB抑制劑)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、NO試劑盒、活性氧(ROS)試劑盒和CCK-8試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物有限公司；一抗IκBα、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和二抗山羊抗兔免疫球蛋白G (goat anti-rabbit IgG)，購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量PCR(q-PCR)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heracell-240i)，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；熒光顯微鏡(ECLIPSE NI)，購(gòu)自尼康儀器有限公司；酶標(biāo)儀(Synergy-2)，購(gòu)自澤泉國(guó)際集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

RAW264.7培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素)和90% DMEM培養(yǎng)基的工作液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3.1.1 LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥反應(yīng)模型的建立

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7按照1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)基。每孔添加100 μL含LPS的工作液，設(shè)置LPS濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 μg/mL，培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.1.2 FVP/FFVP作用濃度的選擇

細(xì)胞接種方式同1.3.1.1，每孔添加100 μL含F(xiàn)VP或FFVP的工作液，設(shè)置FVP或FFVP濃度分別為0、25、50、75、100、125和150 μg/mL，培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.1.3 FVP/FFVP處理LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥反應(yīng)模型

細(xì)胞接種方式同1.3.1.1，將細(xì)胞分為CON組(正常培養(yǎng)基)、LPS組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS)、FVP組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+25、50或100 μg/mL FVP)和FFVP組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+25、50或100 μg/mL FFVP)，培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.1.4 FVP/FFVP及BAY11-7082處理LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥反應(yīng)模型

細(xì)胞接種方式同1.3.1.1，將細(xì)胞分為CON組(正常培養(yǎng)基)、LPS組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS)、LPS抑制組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+10 μmol/L BAY11-7082)(BAY11-7082的濃度參考Ghashghaeinia等[21]的研究)、FVP組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FVP)、FVP抑制組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FVP+10 μmol/L BAY11-7082)、FFVP組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FFVP)和FFVP抑制組(正常培養(yǎng)基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FFVP+10 μmol/L BAY11-7082)，培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.2.1 細(xì)胞活力

按1.3.1.1、1.3.1.2和1.3.1.3處理細(xì)胞，棄去上清液，用DPBS洗滌2次，將CCK-8與工作液按照1∶10的體積比配制CCK-8工作液，每孔加100 μL CCK-8工作液置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值[22]，按下式計(jì)算細(xì)胞活力：

R1(%)=100×(ODT-ODB)/(ODC-ODB)。

式中：R1為細(xì)胞活力；ODT為試驗(yàn)組OD值；ODB為空白組OD值；ODC為對(duì)照組OD值。

1.3.2.2 ROS與NO含量

按1.3.1.3處理細(xì)胞，處理完成后，離心取上清，按試劑盒說明書測(cè)定各組上清液中的NO含量[23]。細(xì)胞用DPBS洗滌2次，將熒光探針2’,7’-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)試劑與工作液按照1∶1 000的體積比配制DCFH-DA工作液，然后每孔加2 mL(6孔板)和100 μL(96孔板)DCFH-DA工作液，培養(yǎng)箱中孵育20 min。用熒光顯微鏡觀察6孔板各孔的熒光并拍照，用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板各孔的熒光強(qiáng)度[24]，根據(jù)下式計(jì)算ROS含量：

R2(%)=100×(FIT-FIB)/(FIC-FIB)。

式中：R2為ROS含量；FIT為試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度；FIB為空白組熒光強(qiáng)度；FIC為對(duì)照組熒光強(qiáng)度。

1.3.2.3 吞噬能力

按1.3.1.3處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入50 μL的0.05%中性紅溶液，培養(yǎng)4 h后棄去中性紅，DPBS洗3次，加入100 μL細(xì)胞裂解液，室溫放置2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處OD值，根據(jù)下式計(jì)算吞噬指數(shù)：

R3(%)=100×ODE/ODC。

式中：R3為吞噬指數(shù)；ODE為試驗(yàn)組OD值；ODC為對(duì)照組OD值。

1.3.2.4 炎癥因子含量

按1.3.1.3處理細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后收集上清液離心，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量[25]。

1.3.2.5 炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量

按1.3.1.3處理細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，使用TRIzol法提取總RNA，加入RNAase-Free水，應(yīng)用紫外法測(cè)定RNA的純度和濃度。按試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。

1.3.2.6 Western blot

BAY11-7082是一種NF-κB抑制劑，抑制TNF-α誘導(dǎo)的IκBα磷酸化(p-IκBα)，可以完全且特異性地廢除NF-κB的DNA結(jié)合，下調(diào)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[26]。為研究FVP和FFVP通過NF-κB-NLRP3信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制，選用BAY11-7082作為NF-κB抑制劑開展Western blot。

按1.3.1.4處理細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入200 μL的RIPA裂解液(含1 mmol/L的PMSF)，4 ℃裂解30 min，離心取上清液。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將上清液與5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液按照體積比4∶1混合后置于沸水中煮3～5 min。上樣完成后在80(20 min)、120 V(60 min)恒定電壓條件下電泳。電泳結(jié)束后，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。室溫下，5%的脫脂奶粉封閉4 h，一抗(IκBα，1∶1 000稀釋；NLRP3，1∶1 500稀釋；Caspase-1，1∶800稀釋；IL-1β，1∶400稀釋；β-actin，1∶5 000稀釋)孵育，4 ℃振蕩過夜。次日于室溫下二抗(goat anti-rabbit IgG，1∶5 000稀釋)孵育1 h，TBST液洗膜(3次，每次10 min)。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化。

表1 引物信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。采用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的形式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活力

LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響如圖1-A所示。相比LPS濃度為0時(shí)，LPS濃度等于或超過0.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；LPS濃度為1.0 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力為L(zhǎng)PS濃度為0時(shí)的38.52%，再繼續(xù)升高LPS濃度，細(xì)胞活力沒有顯著變化(P>0.05)。

FVP/FFVP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響如圖1-B所示。在FVP/FFVP濃度低于100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力呈升高趨勢(shì)，并呈劑量依賴性；當(dāng)FVP/FFVP濃度高于100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明FVP和FFVP濃度在100 μg/mL以上時(shí)對(duì)細(xì)胞存在一定毒性作用。濃度為100和150 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的細(xì)胞活力顯著高于FVP組(P<0.05)。因此本研究選取1 μg/mL的LPS和25、50、100 μg/mL的FVP/FFVP進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響如圖1-C所示。LPS組的細(xì)胞活力為CON組的39.41%(P<0.05)；與LPS組相比，25 μg/mL FVP/FFVP處理后，細(xì)胞活力均無顯著變化(P>0.05)，50和100 μg/mL FVP/FFVP處理后，細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)；濃度為100 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組細(xì)胞活力顯著高于FVP組(P<0.05)。

2.2 ROS和NO含量

FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7 ROS和NO含量的影響如圖2所示。相比CON組，LPS組的ROS和NO含量極顯著升高(P<0.01)；FVP/FFVP處理后，ROS和NO含量出現(xiàn)降低趨勢(shì)，并呈劑量依賴性。相同濃度下，F(xiàn)FVP組的NO含量均低于FVP組(P>0.05)。濃度為100 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的ROS含量顯著低于FVP組(P<0.05)；其他濃度下，F(xiàn)FVP組的ROS含量均低于FVP組(P>0.05)。

圖A：LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖B：FVP/FFVP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。FFVP組數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“#”表示與同濃度的FVP組相比差異顯著(P<0.05)。圖C：FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。LPS組數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“**”表示與CON組相比差異極顯著(P<0.01)。除CON組外，數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 吞噬能力

FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7吞噬能力(以吞噬指數(shù)表示)的影響如圖3所示。相比CON組，LPS組的吞噬能力顯著下降(P<0.01)，添加FVP和FFVP后，吞噬能力呈升高趨勢(shì)，存在劑量依賴性，100 μg/mL的FFVP處理細(xì)胞后吞噬能力最高。在濃度為50和100 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的吞噬能力顯著高于FVP組(P<0.05)。

2.4 炎癥因子分泌及其基因表達(dá)

RAW264.7培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的含量見表2。與CON組相比，LPS組上清液中上述4種炎癥因子的含量均極顯著增加(P<0.01)，而添加FVP/FFVP后上清液中這4種炎癥因子的含量均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，并呈劑量依賴性。在濃度為50 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的IL-18含量顯著低于FVP組(P<0.05)；在濃度為100 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的IL-6和TNF-α含量顯著低于FVP組(P<0.05)。

FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥因子基因表達(dá)的影響見圖4。與CON組相比，LPS組IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，添加FVP/FFVP后上述炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量存在下降趨勢(shì)。FVP和FFVP對(duì)IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響差異最大，3個(gè)濃度下2組間均存在顯著差異(P<0.05)。FVP組和FFVP組的IL-18 mRNA相對(duì)表達(dá)量在濃度為100 μg/mL時(shí)差異顯著(P<0.05)。

圖A和圖C：FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7 ROS含量的影響；圖B：FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7 NO含量的影響。

圖3 FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7

2.5 p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)

p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)如圖5所示。相比CON組，LPS組的p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。相比LPS組，單獨(dú)以BAY11-7082、FVP或FFVP處理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。相比單獨(dú)以FVP或FFVP處理，同時(shí)以BAY11-7082和FVP或FFVP處理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。其中，F(xiàn)FVP抑制組與FFVP組p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量的比例分別為0.12∶0.48、0.12∶0.61、0.08∶0.47和0.07∶0.43。相比FVP組，F(xiàn)FVP組的p-IκBα、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，LPS處理RAW264.7后ROS和NO含量極顯著升高，吞噬能力極顯著降低，IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量及其mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高；FVP/FFVP處理后，ROS和NO含量以及上述炎癥因子的含量和mRNA相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)降低趨勢(shì)，吞噬能力呈升高趨勢(shì)，并呈劑量依賴性。Zhao等[27]研究FVP免疫激活的體內(nèi)外功能時(shí)發(fā)現(xiàn)FVP作為一種激活劑可誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的M1極化。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VP可以提高小鼠結(jié)腸組織免疫調(diào)節(jié)功能和抗炎活性。苗月[28]研究了FVP對(duì)RAW264.7的免疫應(yīng)答作用，結(jié)果表明FVP能顯著促進(jìn)RAW264.7的增殖，提高其吞噬能力，倒置顯微鏡下觀察到FVP處理后RAW264.7的形態(tài)由靜息變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，上述研究結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥因子分泌的影響

圖4 FVP/FFVP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥因子基因表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，LPS處理RAW264.7后p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著升高；相比LPS組，單獨(dú)以BAY11-7082、FVP或FFVP處理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低；相比單獨(dú)以FVP或FFVP處理，同時(shí)以BAY11-7082和FVP或FFVP處理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低。研究表明，多糖可以通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控炎癥[29]。Shen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，木槿多糖可以抑制NF-κB信號(hào)通路中IκBα和p65的蛋白表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)RAW264.7的免疫活性。Gan等[31]的研究表明，枸杞多糖通過上調(diào)Toll樣受體4(TLR4)的蛋白表達(dá)來減輕四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的氧化損傷、炎癥反應(yīng)和NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。NF-κB信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平上可以啟動(dòng)NLRP3炎癥小體[6,32]，其蛋白表達(dá)的升高可增強(qiáng)NLRP3蛋白的表達(dá)[33]。Li等[34]在小鼠腸道和腸上皮細(xì)胞中均檢測(cè)到NF-κB與NLRP3存在正相關(guān)關(guān)系。除此之外，多種抗氧化劑都有抑制NF-κB-NLRP3信號(hào)通路的作用[35]。ROS的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致NF-κB-NLRP3信號(hào)通路激活的一個(gè)重要原因[36-37]。根據(jù)Harijith等[38]的報(bào)道，ROS是在線粒體氧化磷酸化過程中由氧還原產(chǎn)生的高活性分子，被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體激活的常見觸發(fā)因素。韓晨陽(yáng)等[39]研究了樟芝多糖抑制6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)樟芝多糖可以通過抑制ROS的分泌降低NF-κB-NLRP3信號(hào)通路的活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)6-OHDA誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)。本研究中，100 μg/mL的FVP/FFVP處理巨噬細(xì)胞炎癥模型后，ROS含量顯著降低，NF-κB-NLRP3信號(hào)通路中p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，與前人研究結(jié)果一致。

p-IκBα：磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白α phosphorylated nuclear factor-κB inhibitor α；IκBα：核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白α nuclear factor-κB inhibitor α；NLRP3：NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3 NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3；Caspase-1：半胱天冬蛋白酶-1 cysteinyl aspartate specific proteinase-1；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；FVP：金針菇多糖 Flammulina velutipes polysaccharide；FFVP：發(fā)酵金針菇多糖 fermented Flammulina velutipes polysaccharide。

FVP和FFVP的濃度為25 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組細(xì)胞上清液中IL-6含量顯著低于FVP組；濃度為50 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的吞噬能力顯著高于FVP組，IL-18含量顯著低于FVP組；濃度為100 μg/mL時(shí)，F(xiàn)FVP組的ROS、TNF-α含量，IL-18 mRNA相對(duì)表達(dá)量以及IκBα、Caspase-1和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于FVP組。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相比FVP，F(xiàn)FVP呈板狀，分子聚集作用增強(qiáng)，單糖組成比例改變，其中甘露糖比例顯著升高；同濃度下FFVP的抗氧化活性高于FVP，且濃度越高差異越大[20]。一方面，發(fā)酵通過改變FVP的結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其抗炎活性。研究報(bào)道多糖的抗炎作用與多糖鏈構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)等都有關(guān)[40]。掃描電鏡下FFVP呈板狀，說明其分支較多，且聚集鍵很強(qiáng)[41]。原子力顯微鏡下FFVP的分子聚合度高于FVP，這是由于羥基的強(qiáng)烈相互作用而產(chǎn)生的[42]。另一方面，發(fā)酵通過改變FVP的單糖組成增強(qiáng)其抗炎活性。FFVP中甘露糖比例升高，甘露糖屬于功能性糖，具有較高的抗炎活性。吳惠娟等[43]研究了甘露糖對(duì)RAW264.7炎癥反應(yīng)的調(diào)控及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)甘露糖可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-12、TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)，并抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、p65和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化水平的增加，甘露糖單獨(dú)處理可抑制AKT、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和p65的磷酸化。因此，本研究中FFVP抗炎效果優(yōu)于FVP的可能原因包括FFVP中多糖鏈間的強(qiáng)交互作用、多糖分子的高度聚集以及甘露糖比例的升高。

4 結(jié) 論

FVP/FFVP能增強(qiáng)RAW264.7的細(xì)胞活力和吞噬能力，降低ROS和NO含量，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌與基因表達(dá)；相同濃度下，F(xiàn)FVP的抗炎效果優(yōu)于FVP，其可能的機(jī)制為通過抑制NF-κB-NLRP3信號(hào)通路的激活降低NLRP3炎癥小體的活化。