抗菌肽對(duì)育成期母貂生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率及腸道菌群的影響

宇曉軍 李丹丹 王路義 郭贄豪 王 光 王利華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島266109)

腸道菌群是腸道功能的重要組成部分，其數(shù)量龐大，與宿主相互依存，可影響腸道內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還與機(jī)體免疫機(jī)能、疾病預(yù)防[1]、腸道健康密切相關(guān)[2]。毛皮動(dòng)物的飼喂以動(dòng)物源性的鮮飼料為主，鮮飼料在炎熱的夏季容易滋生細(xì)菌，引發(fā)腸道疾病[3]，因此保持腸道健康對(duì)于提高毛皮動(dòng)物生產(chǎn)水平、減少經(jīng)濟(jì)損失尤為重要?？咕?antimicrobial peptides，ABPs)是生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲(chóng)，抑殺腫瘤細(xì)胞，具有免疫活性[4-6]等作用的多肽，是機(jī)體對(duì)抗微生物、病毒和真菌的先天防御系統(tǒng)[7]。天蠶素抗菌肽是被發(fā)現(xiàn)最早、研究最徹底、效果最明顯的一類抗菌肽[8]，在畜禽養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用。已有研究表明，添加天蠶素抗菌肽可以改善動(dòng)物腸道黏膜形態(tài)[9]，修復(fù)腸道炎癥損傷[10-11]，改善腸道菌群[12]，降低發(fā)病率，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[13]。腸道健康與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控關(guān)系的研究越來(lái)越備受關(guān)注。因此，本試驗(yàn)以育成期母貂為研究對(duì)象，在飼糧中添加不同水平的抗菌肽，探究其對(duì)育成期母貂生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率和腸道菌群的影響，以確定其在水貂養(yǎng)殖過(guò)程中的作用效果及適宜添加水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

選擇60只65日齡體重相近的健康短毛黑母貂，隨機(jī)分為6組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。

各組飼糧中分別添加0(對(duì)照組)、100、200、300、400、500 mg/kg的抗菌肽(天蠶素活性多肽≥100萬(wàn)單位/g，純度≥98%)?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1982)和文獻(xiàn)[14-16]配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)于2020年7月4日至2020年9月6日在山東省海陽(yáng)市某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，預(yù)試期1周，正試期8周。試驗(yàn)分為1～5周和6～8周2個(gè)階段。試驗(yàn)貂已完成犬瘟熱和細(xì)小病毒疫苗接種。水貂采用棚舍飼養(yǎng)，自然光照，每天05：00和17：00各飼喂1次，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)水貂逐只進(jìn)行空腹稱重，記錄每天采食量，計(jì)算平均日增重(g/d)、平均日采食量(g/d)、料重比(平均日采食量/平均日增重)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組取6只水貂放于水平地面上，測(cè)量鼻尖至尾根的距離，記為活體長(zhǎng)。

1.2.2 養(yǎng)分表觀消化率

分別在正式試驗(yàn)后第3周和第7周，每組選6個(gè)重復(fù)進(jìn)行消化試驗(yàn)。消化試驗(yàn)采用內(nèi)源指示劑法收集新鮮的貂糞，用10%的鹽酸固氮，同時(shí)采集每組飼料樣本。將3 d收集的糞便、飼料樣品分別混合均勻后于65 ℃烘至恒重，制成風(fēng)干樣。樣品粉碎過(guò)40目篩，參照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定糞樣和飼料樣品中的鹽酸不溶灰分(GB/T 23742—2009)、粗蛋白質(zhì)(GB/T 6432—2018)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、水分(GB/T 6435—2014)、鈣(GB/T 6436—2018)、磷(GB/T 6437—2018)含量，并計(jì)算養(yǎng)分表觀消化率：

飼糧中某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-
(A1/A2)×(B2/B1)。

式中：A1為飼糧中鹽酸不溶灰分含量；A2為糞樣中鹽酸不溶灰分含量；B1為飼糧中該養(yǎng)分的含量；B2為糞樣中該養(yǎng)分的含量。

1.2.3 腸道菌群

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019整理，采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。菌群原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 1.2.11軟件質(zhì)控，F(xiàn)LASH軟件進(jìn)行拼接。對(duì)優(yōu)化后的序列根據(jù)97%的相似度進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，并且對(duì)每個(gè)樣本在各個(gè)水平的菌群組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果在I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 抗菌肽對(duì)育成期母貂生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，抗菌肽顯著影響育成期母貂末重、平均日增重和體長(zhǎng)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，200 mg/kg抗菌肽添加組末重、平均日增重顯著升高(P<0.05)，100、200、400、500 mg/kg抗菌肽添加組體長(zhǎng)顯著升高(P<0.05)。

表2 抗菌肽對(duì)育成期母貂生長(zhǎng)性能的影響

續(xù)表2項(xiàng)目Items抗菌肽添加水平 Antimicrobial peptide supplemental levels/(mg/kg)0 (對(duì)照 Control)100200300400500P值P-value平均日采食量(鮮飼糧)ADFI (fresh diet)/(g/d)163.96±32.01173.00±9.72179.30±10.48168.88±13.43172.92±10.63169.67±10.330.60平均日干物質(zhì)采食量ADDMI/(g/d)63.93±3.3463.37±3.6365.66±3.9061.82±4.8863.32±3.9262.12±3.740.48料重比 F/G32.71±10.8925.54±3.4522.52±4.5925.38±7.7528.72±4.9627.81±4.710.08體長(zhǎng) Body length/cm34.67±1.37c36.83±1.83ab37.00±1.41ab36.33±1.03bc38.33±1.97a36.83±1.33ab0.01

2.2 抗菌肽對(duì)育成期母貂養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3可知，抗菌肽顯著影響育成期母貂1～5周粗蛋白質(zhì)表觀消化率和6～8周粗脂肪表觀消化率(P<0.05)，對(duì)干物質(zhì)、鈣、磷表觀消化率無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，200、300、400 mg/kg抗菌肽添加組1～5周粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著升高(P<0.05)，100、200、300、400 mg/kg抗菌肽添加組6～8周粗脂肪表觀消化率顯著升高(P<0.05)。

表3 抗菌肽對(duì)育成期母貂養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 抗菌肽對(duì)育成期母貂腸道菌群的影響

2.3.1 腸道內(nèi)容物有效OTU數(shù)量統(tǒng)計(jì)

由圖1可知，各組直腸內(nèi)容物中共有的OTU數(shù)量為109個(gè)，300 mg/kg抗菌肽添加組特有的OTU數(shù)量最多，為127個(gè)。

由圖2可知，300 mg/kg抗菌肽添加組總物種數(shù)最多，400 mg/kg抗菌肽添加組總物種數(shù)最少。

2.3.2 alpha多樣性指數(shù)

由表4可知，抗菌肽顯著影響育成期母貂腸道菌群Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，200 mg/kg抗菌肽添加組Ace指數(shù)顯著升高(P<0.05)，300 mg/kg抗菌肽添加組Ace和Chao1指數(shù)顯著升高(P<0.05)。

a：對(duì)照組 control group；b：100 mg/kg抗菌肽添加組 100 mg/kg antimicrobial peptide addition group；c：200 mg/kg抗菌肽添加組 200 mg/kg antimicrobial peptide addition group；d：300 mg/kg抗菌肽添加組 300 mg/kg antimicrobial peptide addition group；e：400 mg/kg抗菌肽添加組 400 mg/kg antimicrobial peptide addition group；f：500 mg/kg抗菌肽添加組 500 mg/kg antimicrobial peptide addition group。下圖同 the same as below。

2.3.3 抗菌肽對(duì)育成期母貂腸道菌群的影響

由圖3可知，在門水平上，各組腸道菌群中相對(duì)豐度大于1%的菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Patescibacteria)。由表5可知，與對(duì)照組相比，100、200 mg/kg抗菌肽添加組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，100、200、300 mg/kg抗菌肽添加組變形菌門相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

圖2 基于OTU水平各組總物種數(shù)柱形圖

表4 抗菌肽對(duì)育成期母貂alpha多樣性指數(shù)的影響

由圖4可知，在屬水平上，各組腸道菌群中相對(duì)豐度大于1%的菌屬有伯克霍爾德菌屬和其他菌屬。由表5可知，與對(duì)照組相比，200、300 mg/kg抗菌肽添加組乳酸菌屬相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，400 mg/kg抗菌肽添加組伯克霍爾德菌屬相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，100、200、300、400和500 mg/kg抗菌肽添加組梭菌屬相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

3.1 抗菌肽對(duì)育成期母貂生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽可以提高育成期母貂末重、平均日增重，與徐博成等[17]在仔豬上，王棚等[18]在蛋雞上，Bao等[19]、劉洹兵[20]和李波等[21]在肉雞上的應(yīng)用效果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可以通過(guò)改善腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[22]。腸道健康的改善有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，本研究的消化試驗(yàn)已證實(shí)，抗菌肽能提高粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率，而養(yǎng)分表觀消化率的提高與改善腸道菌群有關(guān)，這說(shuō)明抗菌肽對(duì)于水貂的促生長(zhǎng)作用可能是通過(guò)改善腸道健康，提高養(yǎng)分消化率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門；Patescibacteria：擬桿菌門；Others：其他。

Burkholderia：伯克霍爾德菌屬；Lactobacillu：乳酸菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；Actinomyces：放線菌屬；Mycoplasma：支原體屬；Clostridium：梭菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Rhodopseudomonas：紅假單胞菌屬；Escherichia-Shigella：大腸桿菌-志賀氏菌；Corynebacterium：棒狀桿菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Brevibacterium：短桿菌屬；Paraclostridium：副梭菌屬；Saccharimonadales：糖單胞菌；Enterococcus：腸球菌屬；Others：其他。

表5 抗菌肽對(duì)育成期母貂腸道菌群在門水平、屬水平上相對(duì)豐度的影響

3.2 抗菌肽對(duì)育成期母貂養(yǎng)分表觀消化率的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽可提高水貂粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率。這與Yoon等[23]和李平等[24]在斷奶仔豬上的研究結(jié)果一致。都海明[25]和白建勇等[26]研究表明，在肉雞和仔豬飼糧中添加抗菌肽能夠顯著提高其腸道內(nèi)容物中脂肪酶、蛋白酶等活性，從而提高養(yǎng)分表觀消化率。水貂養(yǎng)分的消化吸收與免疫力及腸道健康狀態(tài)有著密切聯(lián)系[27]。由于抗菌肽具有廣泛的抗菌、耐熱、耐酸等優(yōu)點(diǎn)[28]，使其更容易到達(dá)水貂腸道從而發(fā)揮生物學(xué)作用，改善腸道菌群和形態(tài)，進(jìn)而提高養(yǎng)分表觀消化率。

3.3 抗菌肽對(duì)育成期母貂腸道菌群的影響

動(dòng)物腸道菌群是按一定的比例組合，菌群間互相制約、互相依存，從而構(gòu)建的一個(gè)復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)[29]。腸道菌群的多樣性可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境[30]，提高動(dòng)物的消化吸收能力，有利于保持動(dòng)物機(jī)體的健康[31]。本試驗(yàn)在alpha多樣性分析中發(fā)現(xiàn)，隨著在飼糧中抗菌肽添加水平增加，試驗(yàn)組水貂直腸微生物的多樣性有先升高后下降的趨勢(shì)，這與譚鳳霞等[32]研究結(jié)果一致，這可能是由于抗菌肽具有廣譜殺菌效果，對(duì)不同菌種抑制濃度不同。在飼糧中適量添加抗菌肽能提高腸道菌群的多樣性，改善腸道的微環(huán)境。

范忠原[33]研究發(fā)現(xiàn)，水貂腸道細(xì)菌主要?dú)w類為厚壁菌門(59.99%)、擬桿菌門(16.20%)、梭桿菌門(11.54%)、變形菌門(3.55%)、放線菌門(3.51%)，其中厚壁菌門在水貂遠(yuǎn)端腸道中所占的比例最高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，厚壁菌門和擬桿菌門是水貂腸道內(nèi)相對(duì)豐度較高的菌群，具體相對(duì)豐度偏差可能與水貂遺傳、生長(zhǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門相對(duì)豐度與動(dòng)物腸道中脂肪、蛋白質(zhì)的消化有關(guān)，具有促進(jìn)飼糧營(yíng)養(yǎng)消化吸收的作用[34-37]。這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以提高水貂不同時(shí)期粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率的結(jié)果一致，可能是與添加適量抗菌肽能提高育成期母貂腸道中厚壁菌門、乳酸菌屬相對(duì)豐度，降低變形菌門、梭菌屬相對(duì)豐度，從而改善腸道內(nèi)環(huán)境有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗菌添加水平過(guò)高時(shí)，腸道條件致病菌的組成比例有所增加，有益菌的組成比例下降，菌群多樣性水平下降[32]，可能是由于不同菌種對(duì)抗菌肽敏感度不同，抗菌肽是否存在劑量限制仍需更多試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加100、200 mg/kg抗菌肽可提高育成期母貂末重、平均日增重、體長(zhǎng)，改善粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率，調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性，提高厚壁菌門、乳酸菌屬相對(duì)豐度，降低變形菌門、梭菌屬相對(duì)豐度。