凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI改善脂多糖損傷蛋雛雞腸道作用的研究

胡 婷 張 華 吳 瓊 周 波 盧天航 崔德鳳* 張永紅*

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京102206；2.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定071000；3.中牧實業(yè)股份有限公司，北京100070)

革蘭氏陰性細菌主要存在于機體的腸道內(nèi)，而脂多糖(LPS)則是革蘭氏陰性細菌的內(nèi)毒素物質(zhì)。機體在受到應激或者感染時革蘭氏陰性細菌大量繁殖，會破壞腸道屏障，細菌死亡后，大量LPS進入血液，作用于細胞膜受體[1-2]，激活某些通路，如Toll樣受體4(TLR4)信號通路，通過一系列物質(zhì)的磷酸化，生成核因子-κB (NF-κB)，再誘導機體產(chǎn)生大量促炎因子，導致腸道絨毛脫落，腸道通透性升高，從而使機體出現(xiàn)代謝紊亂、發(fā)熱等多種炎癥癥狀[3]。研究表明，益生菌通過調(diào)節(jié)細胞因子，調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白表達，抑制TLR4信號通路的激活，改善腸道屏障功能，降低腸道通透性，進而阻止有害物質(zhì)侵入而引起的炎癥反應[4-6]。王焱[7]的試驗證明，凝結(jié)芽孢桿菌LT3通過調(diào)控炎癥和氧化信號通路以及腸道菌群對LPS誘導的大鼠盲腸損傷起到保護作用。凝結(jié)芽孢桿菌作為一種新型益生菌對LPS誘導的腸道損傷作用具有一定的改善效果，其具有良好的耐熱性，適合添加在飼糧中[6-7]。而且本課題組同期研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI通過降低腸道黏膜通透性，提高腸道黏膜屏障的保護作用及吸收功能，降低蛋雛雞料重比，提升其生長性能[8]。因此，本試驗使用本實驗室提取并驗證后制成的凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI菌粉，檢測其對30日齡蛋雛雞灌服2 mg/kg LPS 200 μL 6 h后的腸道黏膜通透性及TLR4信號通路相關(guān)基因表達和蛋白表達，旨在探究凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI調(diào)控LPS損傷腸道的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI菌粉由北京農(nóng)學院中獸醫(yī)實驗室提取并驗證后制備[8]。

1.2 試驗設(shè)計

選取1日齡京紅蛋雛雞180只，隨機分為5組，每組6個重復，每個重復6只，重復之間體重接近?？瞻讓φ战M(CON組)和模型組(LPS組)飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平同本課題組同期試驗[8])，連續(xù)灌服生理鹽水，3個益生菌組飼喂基礎(chǔ)飼糧，同時分別連續(xù)灌服低、中、高劑量的凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI(濃度分別為106、107、108CFU/mL)，灌服28 d，28 d后灌服LPS，灌服濃度為2 mg/kg，灌服劑量為200 μL/只，試驗周期為6 h，分別記為LOW+LPS、MID+LPS、HIGH+LPS組。蛋雛雞自由采食，充分飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。

1.3 樣品采集

采集蛋雛雞的十二指腸、空腸和回腸腸道組織，每段約5 cm，用于測定腸道組織結(jié)構(gòu)。用1 mL針管對蛋雛雞進行心臟采血，采血量3～4 mL，室溫放置至少0.5 h，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清轉(zhuǎn)移到1.5 mL滅菌的EP管中，用于測定血清二胺氧化酶(DAO)活性及D-乳酸(D-Lac)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。采集約5 cm的蛋雛雞空腸縱向剖開，用0.9%生理鹽水緩慢沖去食糜，避免將腸絨毛沖掉，用消毒后的無齒鑷沿同一方向輕輕刮取黏膜，裝入EP管中，包上錫箔紙，放入-80 ℃保存，用于測定空腸黏膜黏液蛋白2(MUC2)和緊密連接蛋白mRNA相對表達量、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)和白細胞介素-10(IL-10)含量及TLR4信號通路相關(guān)基因與蛋白表達量。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 腸道組織結(jié)構(gòu)

采集的腸道組織用清水稍微清洗一下，放入4%多聚甲醛固定24 h，制備組織切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，用熒光顯微鏡觀察且測量不同腸道的絨毛長度與隱窩深度，計算腸道絨隱比。

1.4.2 血清DAO活性及D-Lac、TNF-α含量

用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法測定血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，試驗按照說明書操作。

1.4.3 空腸黏膜MUC2和緊密連接蛋白mRNA相對表達量

用實時熒光定量PCR的方法測定空腸黏膜中MUC2、閉合蛋白(Occludin)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的mRNA相對表達量。試驗步驟以及引物序列信息等參考本課題組同期研究[8]。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。

1.4.4 空腸黏膜SIgA和IL-10含量

采用ELISA的方法測定空腸黏膜中SIgA和IL-10的含量，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，試驗按照說明書操作。

1.4.5 空腸黏膜TLR4信號通路相關(guān)基因與蛋白表達量

分別采用實時熒光定量PCR和Western blot的方法測定蛋雛雞空腸黏膜TLR4信號通路中TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)mRNA相對表達量和蛋白表達量。試驗步驟以及引物序列信息等參考本課題組同期研究[8]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 7.00軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)表示，用t檢驗(t-test)分析差異顯著性，P>0.05為無顯著差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞腸道結(jié)構(gòu)的作用

LPS組蛋雛雞灌胃LPS 6 h后出現(xiàn)食欲不振、腹瀉等臨床癥狀，益生菌組未出現(xiàn)明顯腹瀉。

由表1可知，LPS組十二指腸絨毛長度顯著低于CON組(P<0.05)，而回腸的隱窩深度則顯著高于CON組(P<0.05)，與CON組相比，各腸道絨隱比顯著降低(P<0.05)，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI極顯著提高十二指腸的絨隱比(P<0.01)；與LPS組相比，飼喂不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI均提高腸道的絨毛長度，降低隱窩深度，其中高劑量效果顯著(P<0.05)，中、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI極顯著提高各腸道的絨隱比(P<0.01)。

表1 蛋雛雞腸道絨毛長度、隱窩深度及絨隱比

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量的影響

由表2可知，與CON組相比，LPS組的血清DAO活性極顯著增加(P<0.01)，D-Lac和TNF-α含量顯著增加(P<0.05)；與LPS組相比，3個劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI均極顯著降低血清DAO活性(P<0.01)，顯著降低血清TNF-α含量(P<0.05)；中劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI顯著降低血清D-Lac含量(P<0.05)，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI極顯著降低血清D-Lac含量(P<0.01)。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞空腸黏膜MUC2和緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

由圖1可知，與CON組相比，LPS組的空腸黏膜MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相對表達量均極顯著降低(P<0.01)，低、高劑量+LPS組的空腸黏膜MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，中劑量+LPS組空腸黏膜MUC2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，空腸黏膜ZO-1的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以顯著提高空腸黏膜MUC2的mRNA相對表達量(P<0.05)，中劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以顯著提高空腸黏膜Occludin的mRNA相對表達量(P<0.05)，低、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以顯著提高空腸黏膜ZO-1的mRNA相對表達量(P<0.05)。

表2 蛋雛雞血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量

與CON組相比，“*”為P<0.05；“**”為P<0.01；與LPS組相比，“#”為P<0.05；“##”為P<0.01。下圖同。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞空腸黏膜SIgA和IL-10含量的影響

由表3可知，與CON組相比，LPS能夠極顯著提高空腸黏膜SIgA含量(P<0.01)，顯著提高空腸黏膜中IL-10含量(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI也能極顯著提高空腸黏膜中SIgA含量(P<0.01)，顯著提高空腸黏膜中IL-10含量(P<0.05)，但與LPS組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.5 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導蛋雛雞空腸黏膜TLR4/NF-κB信號通路的作用

由圖2、圖3可知，與CON組相比，LPS組蛋雛雞空腸黏膜中TLR4和NF-κB的mRNA相對表達量和NF-κB的蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.05)；不同劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對空腸黏膜TLR4的mRNA相對表達量和蛋白表達量會有不同程度的抑制作用，尤其是中、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI抑制作用極顯著(P<0.01)，甚至與CON組也出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞腸道組織形態(tài)的影響

LPS能使動物機體產(chǎn)生異常生理行為，且影響其正常的飲食消化。其腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)決定吸收能力，絨毛長度代表吸收面積，隱窩深度反映上皮細胞的增殖和成熟情況[9-10]，而二者的比值更能體現(xiàn)小腸功能的強弱，比值越大，黏膜功能越強，比值越小，消化吸收功能越受限，黏膜損傷越嚴重[11]。凝結(jié)芽孢桿菌能改善LPS作用后的腸道損傷。本試驗的結(jié)果也表明，LPS作用后，蛋雛雞腸道絨隱比降低，說明蛋雛雞腸道受到損傷，而飼喂凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI的蛋雛雞會改善這種損傷現(xiàn)象。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞空腸MUC2和緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

腸黏膜屏障作為機體抵抗外界刺激的第1道關(guān)卡，其完整性對于維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)尤為重要[12]，其中黏液蛋白和緊密連接蛋白是維護上皮細胞極性和調(diào)節(jié)腸道屏障完整性的重要物質(zhì)[13]。研究表明，LPS能破壞腸黏膜上皮緊密連接完整性，損傷腸黏膜，增加腸道通透性，導致LPS以細胞旁作用穿過腸道屏障進入腸內(nèi)，引起促炎細胞因子大量分泌，加劇腸道炎癥[14]。Wu等[12]在細胞上的研究表明，用LPS刺激IPEC-J2后，Occludin、緊密連接蛋白-1(Claudin-1)和ZO-1基因表達會下調(diào)。益生菌對于腸道屏障功能的改善具有良好效果，它通過增加黏液蛋白和緊密連接蛋白的表達來加強腸道結(jié)構(gòu)完整性，提高腸道黏膜保護作用，降低炎癥發(fā)病率。在一項研究中，VSL#3(8種不同的革蘭氏陽性菌組成的凍干粉)能顯著增加Wistar大鼠結(jié)腸炎模型中結(jié)腸黏液蛋白分泌，主要是MUC2 mRNA的表達，但是對黏液蛋白1 (MUC1)和黏液蛋白3(MUC3)基因表達的調(diào)節(jié)作用并不明顯[15]。宋曉珍[16]的試驗證實，復合益生菌能顯著提高炎癥性腸病小鼠模型下小鼠結(jié)腸組織中Occludin的基因表達。本試驗發(fā)現(xiàn)與CON組相比，LPS組MUC2和緊密連接蛋白(Occludin和ZO-1)的mRNA相對表達量極顯著降低；與LPS組相比，中劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能顯著提高空腸黏膜Occludin的mRNA相對表達量，高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能顯著提高空腸黏膜MUC2的mRNA相對表達量，中、高劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI均能顯著提高空腸黏膜ZO-1的mRNA相對表達量，因此，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能通過提高腸道緊密連接能力來增強腸道通透性，減少LPS的損傷作用。

表3 蛋雛雞空腸黏膜中SIgA和IL-10含量

圖2 蛋雛雞空腸黏膜TLR4、NF-κB的mRNA相對表達量

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞血清中DAO活性和D-Lac含量的影響

腸黏膜受損時，血液DAO活性會增加[17]。DAO是腸道黏膜中物質(zhì)，只有當腸黏膜細胞損傷，腸道通透性增加時，才會進入血液，因此，DAO在血清中活性可作為評價腸道黏膜完整性的指標[18]。雞血清中D-Lac含量與LPS的含量呈正比例變化，也是LPS導致腸道黏膜通透性增加的標志物之一[19]。益生菌通過降低血清DAO活性和D-Lac含量來修復損傷的腸黏膜，降低腸道通透性，促進腸道屏障功能恢復，維護腸道健康[20]。江巧麗等[21]試驗證明益生菌制劑(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的聯(lián)用)可降低肝硬化患者血清DAO活性以及LPS含量，降低患者腸道黏膜通透性，改善肝功能。本試驗中也得出飼喂不同劑量凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能下調(diào)LPS刺激后血清DAO活性和D-Lac的含量，改善腸道損傷的結(jié)論。

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對LPS誘導的蛋雛雞空腸黏膜免疫的作用

當LPS作用腸道時，易產(chǎn)生大量促炎因子，破壞腸道屏障，進入血液，其中TNF-α是主要因子，其具有多種生物學活性，涉及炎癥反應[22]。蘭斌等[23]發(fā)現(xiàn)與空白組相比，給白兔耳緣注射0.3 mL/kg的LPS使血清TNF-α含量顯著升高。在LPS誘導炎癥因子產(chǎn)生的同時，也會激活黏膜免疫系統(tǒng)[24]，分泌抗體與抑炎因子。SIgA是腸道黏膜中最豐富的非炎性免疫球蛋白抗體，IL-10則是主要抗炎因子[25]。劉紹瓊[26]的試驗通過飼喂肉雞500 μg/kg BW的LPS激發(fā)免疫應激，增加腸道SIgA含量，其中空腸SIgA含量在15 h有顯著增加。也有試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS作用后腸道SIgA和IL-10含量會下降，可能的原因是LPS的劑量不同，激發(fā)免疫應答的效果也不一樣[27]。益生菌具有加強黏膜免疫作用。石夢玄[28]的試驗表明，預先口服雙歧桿菌BAA6能顯著提高結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-10含量，尤其高劑量組(1×1010CFU/mL)效果最佳。本試驗LPS灌服后，血清TNF-α、空腸黏膜SIgA和IL-10含量顯著增加，而凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI能下調(diào)血清TNF-α含量，但對空腸黏膜SIgA和IL-10的含量增強效果不顯著，從而凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI通過增強免疫功能緩解LPS對腸道的損傷。

圖3 蛋雛雞空腸黏膜TLR4和NF-κB的蛋白表達量

3.5 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI/NF-κB對LPS誘導蛋雛雞空腸黏膜TLR4信號通路的作用

LPS是誘導TLR4信號通路的主要物質(zhì)，其含量的增加能促使TLR4信號通路活化，產(chǎn)生一系列促炎因子，包括TNF-α、IL-1β等，從而誘導機體發(fā)生炎癥。TLR4和NF-κB是LPS作用后發(fā)生變化的主要信號物質(zhì)，其中NF-κB是主要調(diào)控炎癥因子釋放的一種轉(zhuǎn)錄因子，當其進入到細胞核內(nèi)，啟動轉(zhuǎn)錄程序后就會釋放大量炎癥因子，造成炎癥級聯(lián)放大反應[29-30]，因此二者表達的改變能反映TLR4誘導的炎癥信號通路的變化，從而判斷炎癥發(fā)生程度。益生菌會抑制此通路基因表達，從而減少促炎因子產(chǎn)生，降低炎癥發(fā)生率。郝雅蓉等[31]通過實時熒光定量PCR測定TLR4和NF-κB的mRNA表達發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS處理的肉雞其肝臟中的TLR4/NF-κB的信號通路表現(xiàn)出較強活性，從而產(chǎn)生更多如白細胞介素-6(IL-6)等促炎因子，但益生菌處理過則能明顯抑制這條通路，降低炎癥因子產(chǎn)生的數(shù)量，緩解肝臟炎癥的發(fā)生。本試驗中，LPS能顯著上調(diào)蛋雛雞空腸黏膜TLR4和NF-κB的mRNA相對表達量和蛋白表達量，而凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI則會抑制此通路中這2種基因的mRNA相對表達量和蛋白表達量，因此，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的表達來減少促炎因子的生成，避免炎癥發(fā)生。

4 結(jié) 論

① LPS灌服蛋雛雞后會導致其腸道黏膜受到損害，提高血清DAO活性及D-Lac、TNF-α含量，同時會降低空腸黏膜MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相對表達量，啟動腸道黏膜免疫應答，激活TLR4/NF-κB信號通路。

② 連續(xù)飼喂凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路中TLR4和NF-κBmRNA相對表達量和蛋白表達量，改善LPS灌服后的腸道損傷，提高蛋雛雞腸道健康。

致謝：

感謝北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院童津津博士對文稿所提的寶貴意見。