北蒼術(shù)種子DNA條形碼研究及序列特征分析

謝紅波，趙 晴，穆威杉，史萌萌，石林春，劉金欣*，趙春穎*，李云峰

（1.承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院＆北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所）

蒼術(shù)，為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.）DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，具有健脾燥濕、祛風(fēng)散寒、明目的功效[1,2]。自2003年“非典”事件之后，蒼術(shù)市場(chǎng)需求量逐年上漲，野生資源日益枯竭，市場(chǎng)供需矛盾尖銳，急需擴(kuò)大蒼術(shù)商品生產(chǎn)規(guī)模[3-6]。然而，蒼術(shù)自然狀態(tài)下的結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)低于關(guān)蒼術(shù)Atractylodes japonica Koidz.和白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.[5]。同時(shí)，部分地區(qū)常將關(guān)蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)Atractylodes koreana (Nakai) Kitam.混作北蒼術(shù)用于入藥[7]，造成了蒼術(shù)種子市場(chǎng)存在種源混亂、種質(zhì)混雜現(xiàn)象的主要原因。種子作為中藥材生產(chǎn)的源頭，保證其基原的準(zhǔn)確性顯得尤為重要。DNA條形碼技術(shù)是通過(guò)利用不同生物基因組中一段通用的、具有差異特征的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定，可以不受外界環(huán)境影響及經(jīng)驗(yàn)的限制，具有客觀、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，其歷經(jīng)20余年的發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物類及動(dòng)物類中藥材鑒定領(lǐng)域[8-10]。與中藥材相比，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)中藥材種子鑒定研究主要面臨以下問(wèn)題[11,12]：（1）中藥材種子大小不一，微小種子的DNA難以提??；（2）種子通常含有大量的油脂或淀粉類物質(zhì)，抑制PCR的擴(kuò)增效率；（3）對(duì)于異花授粉植物，種子多為雙親遺傳的雜交體，雜交對(duì)測(cè)序質(zhì)量的影響尚需驗(yàn)證。本研究嘗試基于ITS2和psbA-trnH序列對(duì)北蒼術(shù)種子進(jìn)行鑒定研究及序列特征分析，探討北蒼術(shù)種子DNA條形碼技術(shù)鑒定的可行性，以期為保障北蒼術(shù)種子基原的準(zhǔn)確鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

SQP型電子天平（德國(guó)Sartorius公司），MM400型球磨儀（德國(guó)Retsch公司），T100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司），NanoDropTM One型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司），SZX16型高級(jí)研究體視顯微鏡（日本Olympus公司），植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.2 樣品收集

從蒼術(shù)種植基地和市場(chǎng)收集北蒼術(shù)種子12份，包括河北省承德市、張家口市、保定市以及遼寧省、甘肅省等地區(qū)，種子經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院趙春穎教授鑒定（表1）。所有樣品存放于承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

表1 種子樣品的采集信息

1.3 種子的形態(tài)學(xué)觀察

隨機(jī)挑取北蒼術(shù)種子20粒，利用體視顯微鏡觀察種子的外觀形態(tài)特征（形狀、大小、顏色、表面紋理等），使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（上海史丹利五金工具有限公司）測(cè)量種子的長(zhǎng)度和寬度。參照《農(nóng)作物種子檢測(cè)規(guī)程》GB/T3543.7-1995，采用百粒法測(cè)定種子的千粒重。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

隨機(jī)挑選顆粒飽滿的種子1粒，用75%酒精棉對(duì)種子表面進(jìn)行消毒，稱重后研磨。剩余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取種子的總DNA，并調(diào)整其水浴條件為56℃，水浴8~12 h或過(guò)夜。ITS2序列和psbA-trnH序列的擴(kuò)增引物、PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后使用ABI 3730XL型測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定種子DNA的濃度和純度，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算其PCR擴(kuò)增成功率；利用CodonCode Aligner V9.0.1對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估、預(yù)處理及序列拼接?；陔[馬爾可夫模型（hidden markov model，HMM）對(duì)獲得的ITS2序列進(jìn)行注釋[13]。psbA-trnH序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上的參考序列進(jìn)行處理，其中，psbA的保守區(qū)序列為CGAAGCTCCATCTACAAATGGATAA，trnH的保守區(qū)序列為GGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAG。利用MEGA-X進(jìn)行多序列比對(duì)和序列特征分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 北蒼術(shù)種子形態(tài)特征

北蒼術(shù)種子為瘦果，倒卵圓形或長(zhǎng)橢圓形，偶有彎曲，長(zhǎng)5.33~7.91mm，寬1.87~3.28mm；表面褐色，有不規(guī)則條紋狀縱溝，密被白色長(zhǎng)直毛，有時(shí)稀疏，順向貼服；頂端有羽毛狀冠毛，黃褐色，易脫落；基部呈環(huán)狀，萌發(fā)時(shí)胚根由此突破種子；胚直立，具有2片子葉，肉質(zhì)，無(wú)胚乳。北蒼術(shù)種子的千粒重約為14.01g。北蒼術(shù)種子外觀形態(tài)特征如圖1。

圖1 北蒼術(shù)種子的外觀形態(tài)特征

2.2 DNA提取結(jié)果及PCR擴(kuò)增成功率

北蒼術(shù)單粒種子的重量在13.87~26.35 mg之間，根據(jù)趙晴等[11]提出的“中藥材種子DNA條形碼分子鑒定原則”，采用單粒取樣的方式。DNA提取結(jié)果顯示，北蒼術(shù)種子樣品的DNA濃度均在148.4~418.4ng/μL范圍內(nèi)，平均值為268.89ng/μL，其在260nm和280nm處的吸光度比值A(chǔ)260nm/A280nm處于2.0~2.1之間，表明所提取的種子DNA質(zhì)量良好，均可滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增要求（表2）。使用ITS2和psbA-trnH通用引物對(duì)所獲得的種子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，所有種子樣品的PCR產(chǎn)物均可檢測(cè)到1條清晰、明亮的條帶，PCR擴(kuò)增成功率為100%（圖2）。

表2 北蒼術(shù)種子的DNA提取質(zhì)量

圖2 北蒼術(shù)種子的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 DNA測(cè)序及序列質(zhì)量分析

去除低質(zhì)量區(qū)域和引物序列后，ITS2單向測(cè)序的Contig information顯示堿基質(zhì)量Q（quality value）≥20的比例為99.1%，且經(jīng)雙向測(cè)序拼接后均可獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果，拼接結(jié)果長(zhǎng)度均＞225 bp，其Contig information顯示Q30的堿基數(shù)量占比99.6%（圖3）；盡管獲得的psbA-trnH序列由于串聯(lián)重復(fù)序列單元（poly A/T），導(dǎo)致部分序列測(cè)序時(shí)發(fā)生信號(hào)減弱的現(xiàn)象，但其單向測(cè)序結(jié)果的Contig information顯示Q20的堿基數(shù)量比例高達(dá)98.2%；經(jīng)雙向測(cè)序拼接后的序列長(zhǎng)度均＞385 bp，且Contig information顯示Q30的堿基數(shù)量占比98.2%，序列質(zhì)量良好（圖4）。

圖3 北蒼術(shù)種子樣品HSZZ2894_2F的ITS2序列峰圖

圖4 北蒼術(shù)種子樣品HSZZ2894_PA的psbA-trnH序列峰圖

2.4 北蒼術(shù)種子DNA條形碼序列特征分析

共獲得北蒼術(shù)種子DNA條形碼序列24條，包括12條ITS2序列和12條psbA-trnH序列。其中ITS2的序列長(zhǎng)度為228~230 bp，比對(duì)后長(zhǎng)度230 bp，GC含量在68.7%~69.3%之間，平均值為68.02%；獲得的12條ITS2序列除220和223位點(diǎn)存在插入/缺失外，尚無(wú)發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，序列特征（圖5）。

圖5 北蒼術(shù)種子ITS2序列的序列特征

12條北蒼術(shù)種子的psbA-trnH序列長(zhǎng)度為389~398 bp，比對(duì)后序列長(zhǎng)度為401 bp，GC含量在23.8%~24.3%之間，平均值為24.05%；含有3個(gè)變異位點(diǎn)，分別為32、77位點(diǎn)的A-G變異，86位點(diǎn)的C-A變異；在50、154、340、365位點(diǎn)分別存在一個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，在233~238位點(diǎn)存在一個(gè)6 bp的插入/缺失區(qū)域；12條psbA-trnH序列分為4個(gè)單倍型，H1為主導(dǎo)單倍型，包含9條序列，H2、H3和H4單倍型各包含1條序列，其主導(dǎo)單倍型序列特征（圖6）。

圖6 北蒼術(shù)種子psbA-trnH序列主導(dǎo)單倍型H1的序列特征

3 討論

3.1 DNA條形碼技術(shù)可以用于中藥材北蒼術(shù)種子的鑒定

北蒼術(shù)種子含有豐富的油脂類成分[15]，在研磨時(shí)容易被氧化，影響DNA的提取質(zhì)量和濃度[9]。本研究在DNA提取過(guò)程中，采用單粒取樣的方式，可以有效避免不同北蒼術(shù)種子之間遺傳物質(zhì)的相互干擾。分別使用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)和氯仿/異戊醇（24:1）進(jìn)行抽提，加入與上清液等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇進(jìn)行DNA沉淀，所有樣品均可獲得高質(zhì)量的北蒼術(shù)種子DNA，滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增需求。采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有種子樣品的PCR產(chǎn)物均可檢測(cè)到1條清晰、明亮的條帶，PCR擴(kuò)增成功率為100%。盡管部分種子樣品由于插入/缺失以及poly結(jié)構(gòu)導(dǎo)致單向序列的測(cè)序質(zhì)量較低，但雙向拼接后皆可獲得較高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。對(duì)北蒼術(shù)種子的ITS2和psbA-trnH序列特征分析表明，不同產(chǎn)地、不同批次的北蒼術(shù)種子種內(nèi)變異較小，遺傳穩(wěn)定性好。由此可見(jiàn)，基于DNA條形碼技術(shù)可以穩(wěn)定獲得北蒼術(shù)種子的ITS2和psbA-trnH序列，利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)北蒼術(shù)種子的基原物種進(jìn)行鑒定分析具有一定的可行性。

3.2 DNA條形碼技術(shù)有利于推進(jìn)蒼術(shù)種子標(biāo)準(zhǔn)化

當(dāng)前，我國(guó)中藥材種子種苗尚缺乏系統(tǒng)的質(zhì)量管理體系，現(xiàn)有的中藥材種子種苗相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中僅有少部分品種如人參、三七等是專門針對(duì)中藥材而制定的，大部分歸屬于農(nóng)業(yè)和林業(yè)，涉及的中藥材不足《中國(guó)藥典》收載的20%，有待進(jìn)一步完善[16]。種子種苗是中藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，保障中藥材種子種苗的真實(shí)性是中藥材安全生產(chǎn)的首要條件和重要前提[17]。然而，傳統(tǒng)的中藥材種子真?zhèn)舞b定往往依靠種子的形態(tài)特征和顯微特征進(jìn)行，對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)具有較高的要求，特別是對(duì)于同屬植物或細(xì)小類種子的鑒定存在一定困難[12,17]。相對(duì)于其他傳統(tǒng)及分子鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)具有三大明顯優(yōu)勢(shì)：鑒定結(jié)果可重復(fù)性良好，方法通用性強(qiáng)，可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù)和鑒定平臺(tái)，易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化[18]。劉金欣等[19]基于構(gòu)建的黃芩DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)市售黃芩種子進(jìn)行鑒定，表明基于ITS2序列可用于黃芩種子的物種鑒定。石林春等[12]通過(guò)對(duì)51份知母種子進(jìn)行鑒定研究，建議psbA-trnH作為知母種子鑒定的DNA條形碼序列，可用于知母種子的真實(shí)性鑒定。本研究利用ITS2和psbA-trnH序列對(duì)北蒼術(shù)種子進(jìn)行鑒定研究及序列特征分析，進(jìn)一步證明DNA條形碼技術(shù)可以有效應(yīng)用于中藥材種子的鑒定，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材種子的數(shù)字化監(jiān)管，推進(jìn)中藥材種子標(biāo)準(zhǔn)化工程，對(duì)于中藥現(xiàn)代化具有重要的意義。