藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及體外抗氧化與結(jié)合膽酸鹽能力研究

古麗米熱·祖努納，王偉雄，呂 澤，黎進(jìn)雪，雷 靜，買哈巴·庫爾班，米克熱衣·衣沙克江，武 運(yùn),

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆吐魯番 838000）

新疆藥桑具有多年的種植歷史[1]。藥桑因含有多種氨基酸和豐富的藥用活性成分，在民間作為藥材，常被用于消炎、補(bǔ)血和鎮(zhèn)靜[1?2]。隨著科技的發(fā)展，藥桑果實(shí)和葉中的活性成分陸續(xù)被開發(fā)及利用，尤其是多酚和黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用備受關(guān)注[3]。已有研究表明，藥桑比其它桑品種具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和果用價(jià)值[4]，可作為藥用果用專用桑品種加以推廣[5]。雖然對(duì)藥桑的研究越來越多，但總體來說其利用率并不高，原料浪費(fèi)問題依然嚴(yán)重[6]。藥桑的化學(xué)成分和藥理研究還不完善，使藥桑沒有得到充分的利用[7]。將易腐敗變質(zhì)、易損壞、易霉變的藥桑椹制成果酒，可長(zhǎng)久保藏且避免浪費(fèi)，又能延長(zhǎng)果桑的產(chǎn)業(yè)鏈[8]，提高果桑附加值，還可豐富市面上果酒的種類[9]。

葡萄是全球種植面積最廣的水果之一[10]，隨著世界葡萄產(chǎn)量與葡萄酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)的葡萄種植及葡萄酒產(chǎn)量整體呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的發(fā)展趨勢(shì)[11]。葡萄酒中含有糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等多種物質(zhì)[12]。葡萄酒能夠提高食欲，促進(jìn)消化，對(duì)結(jié)腸炎有一定的療效，因此深受人們的喜愛[13]。

隨著果酒行業(yè)的快速發(fā)展，復(fù)合果酒已經(jīng)成為了研究的熱點(diǎn)，越來越受到消費(fèi)者的青睞[14]。果酒的營(yíng)養(yǎng)成分豐富，在發(fā)酵過程中，水果中的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到了很大程度的保留，且發(fā)酵后果酒中會(huì)產(chǎn)生各種醇類、酯類、有機(jī)酸等物質(zhì)[15]。有研究表明，果酒富含酚類化合物，能夠在體內(nèi)顯示抗氧化特性，顯著降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[16]，長(zhǎng)期適量飲用果酒能抗衰老，預(yù)防動(dòng)脈硬化、高血壓、心腦血管等疾病，還能調(diào)節(jié)情緒[14]。根據(jù)每種水果的不同營(yíng)養(yǎng)成分及保健價(jià)值[17]，可以將不同水果按一定比例進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，從而得到口感更好、營(yíng)養(yǎng)更全面且具有更好的保健價(jià)值的復(fù)合果酒[18?19]。

本研究以新疆地產(chǎn)釀酒赤霞珠葡萄和藥食兩用植物藥桑為原料，以藥桑葡萄酒的總酚和黃酮含量為考察指標(biāo)，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面法篩選藥桑葡萄酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，通過測(cè)定最佳工藝條件下發(fā)酵的藥桑葡萄酒對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率和與甘胺膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結(jié)合率來評(píng)價(jià)藥桑葡萄酒的抗氧化活性和體外降血脂效果。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖浅浞钟行Ю眯陆幨硟捎弥参镔Y源，降低藥桑損失率，保留更多藥桑葡萄功能性成分，開發(fā)特色復(fù)合酒類新產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥桑 果桑品種為黑桑種，紫黑果，2020年6月采自新疆阿克蘇市，在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)628食品生物發(fā)酵與質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室冷凍保存；葡萄 赤霞珠葡萄2020年9月采自烏魯木齊安寧渠新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗(yàn)場(chǎng)果園；果膠酶（酶活力4000 U/g）、焦亞硫酸鉀、白砂糖 均為食品級(jí)，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；干酵母D254 安琪酵母股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 均為分析純，麥克林生化科技有限公司；沒食子酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸、過硫酸鉀、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘氨膽酸鈉（SGC） 日本TCI公司；?；悄懰徕c（STC） Sigma公司；胰酶（胰蛋白酶4000 U/g，胰淀粉酶7000 U/g，胰脂肪酶4000 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

LE2002E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；OK1310B料理機(jī) 歐科股份有限公司；FE20 PLUS pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；MJX-160-Z霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司； B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；H1750臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀儀器（長(zhǎng)沙）有限公司；PAL-1型手持糖度計(jì) 北京陽光億事達(dá)科技有限公司；SXKW數(shù)顯控溫電熱套北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝

1.2.1.1 工藝流程 鮮葡萄、冷凍藥?！鈨觥?種水果破碎打漿混合均勻→酶解→調(diào)糖→添加偏重亞硫酸鉀→接種酵母→發(fā)酵→過濾分離→藥桑葡萄酒

1.2.1.2 操作要點(diǎn) 藥桑、葡萄：新鮮采摘的藥桑果經(jīng)過挑選之后放入?18 ℃冰箱冷凍保存，解凍后進(jìn)行破碎打漿，得到藥桑果漿，跟葡萄果漿混合進(jìn)行全果汁與果肉發(fā)酵。

酶解、調(diào)糖：用白砂糖調(diào)節(jié)果漿的初始糖度為24 °Bx，在葡萄和藥桑果漿自然pH條件下，加入0.1%的果膠酶，提高果漿的出汁率，攪拌均勻，靜置2 h。

添加偏重亞硫酸鉀：果漿中添加偏重亞硫酸鉀使得SO2的質(zhì)量濃度為80 mg/L，可起到殺菌、抗氧化和護(hù)色的作用[20]。

接種、發(fā)酵：稱取干酵母D254于5%糖水中37 ℃活化30 min備用。將調(diào)整好成分、添加了偏重亞硫酸鉀和酵母的藥桑和葡萄混合漿裝入消毒后的發(fā)酵瓶中置于不同的溫度條件下發(fā)酵。每天測(cè)定殘?zhí)橇孔兓闆r，以確保發(fā)酵正常進(jìn)行，殘?zhí)橇坎辉僮兓瘯r(shí)結(jié)束發(fā)酵[21]。

過濾：發(fā)酵結(jié)束后，將藥桑葡萄發(fā)酵液進(jìn)行皮渣分離，壓榨過濾。

1.2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酵母接種量的確定 取一定量的藥桑葡萄果漿于潔凈的錐形瓶中，控制發(fā)酵溫度為25 ℃，葡萄與藥桑的果漿質(zhì)量比為1:3，分別接種0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為7 d。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、殘?zhí)橇恳约翱偡印⒖傸S酮含量，確定最適的酵母菌接種量。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度的確定 取一定量的藥桑葡萄果漿于潔凈的錐形瓶中，酵母接種量為0.3%，葡萄與藥桑的果漿質(zhì)量比為1:3，溫度分別控制在19、22、25、28、31 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為7 d。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、殘?zhí)橇恳约翱偡印⒖傸S酮含量，確定最適的發(fā)酵溫度。

1.2.2.3 發(fā)酵時(shí)間的確定 取一定量的藥桑葡萄果漿于潔凈的錐形瓶中，控制發(fā)酵溫度為25 ℃，酵母接種量為0.3%，葡萄與藥桑的果漿質(zhì)量比為1:3，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為6、7、8、9、10 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定測(cè)定酒精度、殘?zhí)橇恳约翱偡?、總黃酮含量，確定最適的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.2.4 原料質(zhì)量比的確定 取一定量的藥桑葡萄果漿于潔凈的錐形瓶中，控制發(fā)酵溫度為25 ℃，酵母接種量為0.3%，發(fā)酵時(shí)間為7 d，葡萄與藥桑的果漿質(zhì)量比分別設(shè)為1:5、1:3、1:1、3:1、5:1。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、殘?zhí)橇恳约翱偡?、總黃酮含量，確定最佳的果漿原料質(zhì)量比。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 為優(yōu)化藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、葡萄藥桑原料質(zhì)量比（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，以總酚含量（Y1）和黃酮含量（Y2）為響應(yīng)值，采用四因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，探究不同因素和水平對(duì)藥桑葡萄酒的影響，利用優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.4.1 殘?zhí)橇亢途凭鹊臏y(cè)定 糖度：參照NY/T 2637-2014折射儀法進(jìn)行測(cè)定。酒精度的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.2 總酚含量的測(cè)定 總酚含量采用Y15全自動(dòng)葡萄酒檢測(cè)儀（Biosystems Barcelona Spain）測(cè)定，采用雙試劑終點(diǎn)法在波長(zhǎng)670 nm進(jìn)行全自動(dòng)操作。原理是樣品中的總酚與福林酚試劑在堿性介質(zhì)中發(fā)生反應(yīng)，顏色的增加與樣品的總酚濃度成正比。

1.2.4.3 總黃酮含量的測(cè)定 總黃酮含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)NaNO2-Al（NO3）3顯色法[21?22]進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確稱取蘆丁5 mg，使用60%無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度線。分別量取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL蘆丁溶液置于10 mL容量瓶中，放入5% 0.3 mL的NaNO2溶液，搖勻，靜置，加入10% Al（NO3）3溶液 0.3 mL，搖勻，靜置，加入4%的NaOH 溶液4 mL，搖勻，用少量60%無水乙醇定容，靜置，在505 nm處測(cè)定其吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.2575x+0.002，R2=0.999。

式中：Y為藥桑總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為原浸提液體積（mL）； W為用的樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5 藥桑葡萄酒體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.5.1 藥桑葡萄酒對(duì)DPPH自由基的清除作用對(duì)DPPH·的清除能力測(cè)定參照吳均等[23]方法略調(diào)整。吸取2.0 mL，樣液體積濃度為（0.01、0.025、0.04、0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL/mL）的藥桑葡萄酒于試管中，加入0.2 mmoL/L的DPPH溶液2 mL混勻，避光反應(yīng)30 min，無水乙醇為參比，517 nm 測(cè)吸光值（A1）。測(cè)相同體積無水乙醇、DPPH溶液混勻的吸光值（A0）及2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻的吸光值（A2）。以0.20 mg/mL的VC作對(duì)照，計(jì)算DPPH·清除率。

式中：A0表示空白組的吸光度；A1表示樣品溶液的吸光度；A2表示用無水乙醇代替 DPPH 時(shí)測(cè)得的對(duì)應(yīng)濃度的吸光度。

1.2.5.2 藥桑葡萄酒中ABTS+·清除能力的測(cè)定對(duì)ABTS+·的清除能力測(cè)定參照李湘利等[24]方法略調(diào)整，吸取2.0 mL，樣液體積濃度為（0.01、0.025、0.04、0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL/mL）的藥桑葡萄酒于試管中，加入3.8 mL ABTS+·測(cè)試液，混勻靜置5 min后于734 nm 處測(cè)吸光值（A1）；測(cè)定同體積蒸餾水加3.8 mL ABTS+·測(cè)試液的吸光值（A0）及同體積果酒加3.8 mL蒸餾水的吸光值（A2），以0.2 mg/mL的VC溶液作對(duì)照，計(jì)算ABTS+·清除率。

式中：A0表示空白對(duì)照液的吸光度；A1表示樣品測(cè)定管的吸光度；A2表示樣品本底管的吸光度。

1.2.5.3 藥桑葡萄酒中·OH清除能力的測(cè)定 對(duì)·OH的清除能力測(cè)定參照程宏楨等[25]方法略調(diào)整，吸取2.0 mL，樣液體積濃度為（0.01、0.025、0.04、0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL/mL）的藥桑葡萄酒于試管中，和2 mL FeSO4（6 mmol/L）、2 mL水楊酸（6 mmol/L）混勻后，加入2 mL H2O2（6 mmol/L）引發(fā)反應(yīng)。37 ℃下反應(yīng)30 min后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；以蒸餾水替代樣品為空白對(duì)照（A0）；以蒸餾水替代水楊酸（A2）；以0.2 mg/mL的VC溶液作對(duì)照，計(jì)算·OH清除率。

1.2.6 藥桑葡萄酒與膽酸鹽的結(jié)合能力模擬體內(nèi)試驗(yàn) 參照劉淑敏等[26?28]文獻(xiàn)的方法，略作修改。取1 mL，樣液體積濃度為0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL/mL藥桑葡萄酒溶液，與1 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液混勻，在37 ℃條件下消化1 h 并且恒溫振蕩（模擬胃消化環(huán)境），以0.10 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.30，隨后加入4 mL 10 mg/mL胰酶（以pH6.30的0.10 mol/L磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩消化1 h（模擬腸道環(huán)境）。每個(gè)樣品中加入4 mL膽酸鹽溶液（牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉0.30 mmol/L，pH6.30的0.10 mol/L磷酸緩沖液），37 ℃條件下振蕩1 h。將制得的混合物重新轉(zhuǎn)入到離心管中，4500 r/min下離心20 min，取上清液，用比色法于387 nm處測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算剩余甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽含量，所加入甘氨膽酸鹽或?；悄懰猁}總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結(jié)合率，以百分比表示。計(jì)算公式如下：

式中：C0為甘氨膽酸鈉加入量，μmol；C1為甘氨膽酸鈉剩余量，μmol。

式中：C2為?；悄懰徕c加入量，μmol；C3為?；悄懰徕c剩余量，μmol。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.0、SPSS 25.0和Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酵母接種量對(duì)藥桑葡萄酒發(fā)酵的影響 從圖1可知，葡萄與藥桑原料質(zhì)量比1:3時(shí)，殘?zhí)橇侩S著接種量的增加出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在接種量為0.1%~0.3%時(shí)，殘?zhí)橇侩S接種量增加出現(xiàn)下降，酒精度出現(xiàn)上升。當(dāng)接種量增加至0.4%時(shí)，殘?zhí)橇砍霈F(xiàn)緩慢上升，酒精度也開始下降，這可能是因接種密度過大，造成溶氧降低，從而抑制了酵母的生長(zhǎng)[29]。隨著酵母接種量的增加，藥桑葡萄酒中總黃酮含量呈先上升后大幅下降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為0.3%，此時(shí)藥桑葡萄酒的總黃酮含量處于最大值，達(dá)170.1 mg/g。多酚含量在接種量0.3%時(shí)達(dá)到最高，為2729 mg/L，當(dāng)接種量進(jìn)一步升高，多酚含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)?？傸S酮含量與總酚含量的變化趨勢(shì)一致，在0.3%時(shí)含量最高，接種量進(jìn)一步升高會(huì)導(dǎo)致含量下降。由此可知，0.3%接種量為最適水平，此時(shí)不僅酵母代謝旺盛，同時(shí)也有利于發(fā)酵液中酚類化合物的溶出[30]。根據(jù)指標(biāo)結(jié)果，選擇接種量范圍為0.2%、0.3%、0.4%。

圖1 接種量對(duì)藥桑葡萄酒總酚和總黃酮的影響Fig.1 Influence of inoculation amount on total polyphenols and total flavonoids of medicine mulberry and grape wine

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)藥桑葡萄酒發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度會(huì)影響酵母的活性，隨著溫度的升高，酵母的生長(zhǎng)代謝不斷增強(qiáng)。如圖2所示，葡萄與藥桑原料質(zhì)量比1:3時(shí)，隨著溫度的升高，藥桑葡萄酒殘?zhí)橇砍尸F(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，酒精度呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，酒精度最高，為12.89%vol，此時(shí)殘?zhí)橇恳草^低。而在31 ℃時(shí)，高溫抑制酵母活性，加快衰亡速度，發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵底物利用率降低，使得發(fā)酵液殘?zhí)橇科撸凭绕汀?/p>

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)藥桑葡萄酒總酚和總黃酮的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on total polyphenols and total flavonoids of medicine mulberry and grape wine

發(fā)酵溫度會(huì)直接影響酵母的生長(zhǎng)代謝能力以及黃酮和多酚的溶解度，進(jìn)而造成發(fā)酵后的藥桑葡萄酒中總黃酮和總酚含量的不同[31]。隨著發(fā)酵溫度的提高，藥桑葡萄酒中總黃酮含量呈先增大后降低趨勢(shì)，25 ℃時(shí)達(dá)到最大值180.3 mg/g。不同溫度之間的總酚含量也有一定差異，隨著溫度的升高，總酚含量也呈快速上升態(tài)勢(shì)，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，藥桑葡萄酒總酚含量最高，達(dá)2757 mg/L，在25 ℃后總酚含量逐漸下降。根據(jù)指標(biāo)結(jié)果，采用22、25、28 ℃為適宜發(fā)酵溫度。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藥桑葡萄酒發(fā)酵的影響 如圖3所示，葡萄與藥桑原料質(zhì)量比1:3時(shí)，隨發(fā)酵時(shí)間梯度的增加，發(fā)酵過程中酒精度呈先升高后明顯接近于平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)，殘?zhí)橇砍式档挖厔?shì)并逐漸趨于平穩(wěn)。藥桑葡萄酒發(fā)酵前7 d，酒精度急劇上升，從0升高至11.59%vol，到發(fā)酵第8 d時(shí)，酒精度達(dá)到最高的12.35%vol，此后，發(fā)酵液酒精度呈緩慢平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)為12.15%vol。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，藥桑葡萄酒中總酚和總黃酮含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵第8 d時(shí)總酚含量達(dá)到最大值2805 mg/L，在發(fā)酵第9 d時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值181.14 mg/g。在第9 d后總酚和總黃酮含量都逐漸下降。這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增加，酵母菌體開始大量死亡[32]，單寧類等物質(zhì)發(fā)生聚合以及在發(fā)酵過程中多酚發(fā)生自然氧化和微生物所產(chǎn)生的酶使黃酮發(fā)生降解，使得含量下降[33]，且不同品種原料的內(nèi)在因素和理化性質(zhì)也影響著在發(fā)酵過程中的變化[34]。根據(jù)指標(biāo)結(jié)果，建議采用7、8、9 d為適宜發(fā)酵時(shí)間。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藥桑葡萄酒總酚和總黃酮的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total polyphenols and total flavonoids of medicine mulberry and grape wine

2.1.4 原料質(zhì)量比對(duì)藥桑葡萄酒發(fā)酵的影響 由圖4可知，不同原料質(zhì)量比的藥桑葡萄發(fā)酵后總酚和總黃酮含量存在不同程度的變化，不同原料合適的配比可以最大限度地保留藥桑和葡萄中的總酚和總黃酮含量。葡萄與藥桑的原料質(zhì)量比在1:3時(shí)，總酚和總黃酮含量達(dá)到最大值，分別為2782 mg/L、179.8 mg/g，隨著葡萄果漿添加量的增加，總酚和總黃酮含量呈下降趨勢(shì)。葡萄與藥桑的原料質(zhì)量比為3:1時(shí)，酒精度為12.63%vol，總酚和總黃酮含量較低。因此考慮各方因素，選擇原料質(zhì)量比范圍為葡萄比藥桑為1:1、1:3、1:5用于后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 原料質(zhì)量比對(duì)藥桑葡萄酒總酚和總黃酮的影響Fig.4 Influence of raw material mass ratio on total polyphenols and total flavonoids of medicine mulberry and grape wine

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立及分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、葡萄藥桑原料質(zhì)量比（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因子，以總酚含量（Y1）和總黃酮含量（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以優(yōu)化藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2，采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果如表3和表4所示。用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸方程擬合，獲得以總酚和總黃酮為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸擬合方程：

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 以藥桑葡萄酒總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface test results based on total flavonoids content of medicine mulberry and grape wine as evaluation indexes

總酚含量Y1=2837.20+56.67A+79.42B+48.67C+88.42D?16.25AB+28.50AC?4.75AD+56.50BC+67.50 BD?12.50CD?189.85A2?116.22B2?205.10C2?245.72D2

總黃酮含量Y2=172.20+7.37A+8.38B+5.60C+5.83D+0.27AB?2.16AC?0.62AD?3.32BC+4.60BD?0.92CD?12.61A2?9.50B2?13.05C2?12.96D2

結(jié)果表明，總酚含量（Y1）和總黃酮含量（Y2）的回歸模型顯著性結(jié)果顯示P<0.001，為極顯著，總酚含量（Y1）失擬項(xiàng)為P=0.4468，總黃酮含量（Y2）失擬項(xiàng)為P=0.4411，失擬項(xiàng)結(jié)果為不顯著（P>0.05），兩個(gè)模型的擬合系數(shù)為R2（Y1）=0.9626，R2（Y2）= 0.9787，校正系數(shù)為RAdj2（Y1）=0.9252，RAdj2（Y2）=0.9574，說明兩個(gè)模型的回歸擬合度較好，更接近實(shí)際試驗(yàn)，說明藥桑葡萄酒總酚和總黃酮含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，所得的回歸方程能夠較準(zhǔn)確地對(duì)藥桑葡萄酒總酚和總黃酮含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：對(duì)于總酚含量（Y1），一次項(xiàng)A、B、D的影響極顯著（P<0.01），C的影響顯著（P<0.05）；交互項(xiàng)BC和BD的影響顯著（P<0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的影響極顯著（P<0.01）；此外，通過F值大小可判斷各因素對(duì)藥桑葡萄酒總多酚的影響程度依次為：發(fā)酵時(shí)間（D）>發(fā)酵溫度（B）>接種量（A）>原料質(zhì)量比（C），即發(fā)酵時(shí)間的影響最大，原料質(zhì)量比的影響最小。對(duì)于總黃酮含量（Y2），一次項(xiàng)A、B、C、D的影響極顯著（P<0.01）；交互項(xiàng)BC影響顯著（P<0.05），BD的影響極顯著（P<0.01）；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的影響極顯著（P<0.01）；由交互項(xiàng)F值可以判斷各響應(yīng)面因素對(duì)藥桑葡萄酒總黃酮的影響排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度（B）>接種量（A）>發(fā)酵時(shí)間（D）>原料質(zhì)量比（C），即發(fā)酵溫度的影響最大，原料質(zhì)量比的影響最小。

2.2.2 因素交互作用對(duì)藥桑葡萄發(fā)酵后總酚和總黃酮含量的響應(yīng)面分析 通過Design Expert V8.0.6軟件分析，得出圖5所示的響應(yīng)曲面圖，從圖中可以看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響和因素間的交互作用。根據(jù)藥桑葡萄發(fā)酵液的總酚和總黃酮含量回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖，由圖可知，在Y1模型中BC、BD和Y2模型中BC所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中較陡峭，等高線呈橢圓形，表明交互作用達(dá)到顯著效果，在Y2模型中BD的交互作用對(duì)黃酮含量的影響大，達(dá)到極顯著效果。結(jié)果與回歸分析的結(jié)果吻合。

圖5 各因素交互作用對(duì)藥桑葡萄酒總酚與總黃酮影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on the total phenols and total flavonoids of medicine mulberry and grape wine

2.2.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面軟件分析得出4個(gè)響應(yīng)因素對(duì)總酚和總黃酮影響所得工藝參數(shù)分別為接種量0.32%、主發(fā)酵時(shí)間8.26 d、發(fā)酵溫度26.39 ℃、原料質(zhì)量比是1:2.9，此時(shí)所釀造出來的藥桑葡萄酒總酚含量可達(dá)2872.48 mg/L，總黃酮含量可達(dá)176.42 mg/g。為檢驗(yàn)該模型的準(zhǔn)確性以及可操作性，將藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝條件調(diào)整為接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度26 ℃、葡萄藥桑原料質(zhì)量比是1:3。驗(yàn)證分析得到，3組平行試驗(yàn)的總酚和總黃酮含量分別為2872.48 mg/L、176.42 mg/g，與理論值差異不顯著（P>0.05），說明響應(yīng)面試驗(yàn)和回歸方程預(yù)測(cè)值基本吻合。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化藥桑葡萄酒發(fā)酵工藝條件具有良好的可靠性與實(shí)用性。

2.3 藥桑葡萄酒的體外抗氧化結(jié)果與分析

2.3.1 DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果 由圖6可知，藥桑葡萄酒中含有大量的酚類物質(zhì)及黃酮類化合物。由圖6a可知，DPPH自由基清除率隨樣液體積濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)樣液體積濃度在0.01~0.25 mL/mL之間時(shí)，樣品的DPPH自由基清除率呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，當(dāng)樣液體積濃度為0.05 mL/mL時(shí)，藥桑葡萄酒的DPPH自由基清除率達(dá)到了91.94%，VC溶液的清除率是93.93%，樣品體積濃度0.25 mL/mL時(shí)，均已達(dá)到較高的清除效果，樣品體積>0.5 mL/mL時(shí)，藥桑葡萄酒和VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除率增長(zhǎng)逐漸趨于平穩(wěn)態(tài)勢(shì)。在相同體積濃度下，VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除率均高于藥桑葡萄酒。

2.3.2 ABTS+·清除率測(cè)定結(jié)果 由圖6b可知，當(dāng)樣液體積濃度為<0.25 mL/mL時(shí)，ABTS+·清除率隨樣品用量體積的增加而增強(qiáng)。當(dāng)樣液體積濃度為0.25 mL/mL時(shí)，藥桑葡萄酒對(duì)ABTS+·清除率為96.28%，VC溶液的清除率為96.44%。樣液體積濃度>0.25 mL/mL時(shí)，藥桑葡萄酒和VC溶液對(duì)ABTS+·的清除率的增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)態(tài)勢(shì)，ABTS+·清除率與VC相近。相同體積的藥桑葡萄酒的ABTS+·的清除能力低于VC溶液。

圖6 不同濃度果酒與相應(yīng)濃度VC的抗氧化能力對(duì)比Fig.6 Comparison of antioxidant capability of different concentrations of fruit wines and VC

2.3.3 羥自由基清除率測(cè)定結(jié)果 由圖6c可知，藥桑葡萄酒在體積濃度為0.5 mL/mL時(shí)已達(dá)到較高的自由基清除效果，清除率為98.53%，此時(shí)VC的清除率為96.62%，此用量體積濃度后藥桑葡萄酒對(duì)·OH清除率的增長(zhǎng)緩慢。樣品體積濃度在（0.01~0.5 mL/mL）時(shí)，藥桑葡萄酒和VC溶液對(duì)·OH清除率在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈持續(xù)上升的態(tài)勢(shì)。隨著樣品用量體積的增加，藥桑葡萄酒對(duì)·OH清除率顯著高于VC。結(jié)果表明藥桑葡萄酒對(duì)·OH清除能力很強(qiáng)。鐘石等[1]對(duì)藥桑體外抗氧化活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，藥桑桑椹中含有的總酚和總多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除效率顯著高于果桑品種大10，新疆藥桑桑椹總多酚、總多糖的質(zhì)量濃度在0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率分別高達(dá)91.48%和90.19%。藥桑椹體外抗氧化能力與其含有豐富的生物活性物質(zhì)有密切關(guān)系[35]。

2.4 藥桑葡萄酒與膽酸鹽的結(jié)合能力

本試驗(yàn)?zāi)M人胃和腸道的環(huán)境，選取甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c作為結(jié)合對(duì)象，分析藥桑葡萄酒對(duì)二者的結(jié)合能力，評(píng)價(jià)其降血脂效果。

?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉的回歸方程依次為：y=0.3201x+0.1277，R2=0.9989；y=0.3251x+0.068，R2=0.998。2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可計(jì)算膽酸鹽濃度。

從圖7可以看出，藥桑葡萄酒對(duì)?；悄懰猁}和甘氨膽酸鹽均有一定的結(jié)合能力。藥桑葡萄酒與?；悄懰徕c的結(jié)合能力顯著高于與甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力，即藥桑葡萄酒與牛磺膽酸鹽的結(jié)合能力更強(qiáng)，并且二者的結(jié)合量均隨藥桑葡萄酒樣品用量體積的增加而升高，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)藥桑葡萄酒的樣品用量體積濃度達(dá)到1.0 mL/mL時(shí)，藥桑葡萄酒與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合率分別達(dá)到69.36%、73.28%。當(dāng)藥桑葡萄酒樣品用量體積濃度達(dá)到0.75 mL/mL時(shí)，藥桑葡萄酒與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合率分別達(dá)到61.74%和68.94%。僅是藥桑葡萄酒樣品用量體積濃度為1.0 mL/mL時(shí)結(jié)合率的0.89和0.94倍。初步證實(shí)藥桑葡萄酒具有較好的體外降血脂活性。

圖7 藥桑葡萄酒對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力Fig.7 The ability of medicine mulberry and grape wine to bind cholate

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和原料質(zhì)量比為影響因子，以藥桑葡萄酒的總酚和總黃酮含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藥桑葡萄酒的發(fā)酵工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度26 ℃、葡萄藥桑原料質(zhì)量比是1:3。在此條件下所釀造的藥桑葡萄酒具有較高的總酚和總黃酮活性成分，為保留藥桑葡萄酒中較高的生物活性成分釀造提供良好的基礎(chǔ)。

本研究通過測(cè)定藥桑葡萄酒DPPH、ABTS、OH自由基清除率水平評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性，結(jié)果表明藥桑葡萄酒具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)·OH清除能力很強(qiáng)。與甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉的結(jié)合能力較強(qiáng)。隨著藥桑葡萄酒體積濃度的升高，藥桑葡萄酒與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。新疆藥桑氨基酸組成比例較為合理，礦物質(zhì)元素種類豐富，因此利用藥桑復(fù)合發(fā)酵制備出的藥桑葡萄酒具有較強(qiáng)的體外抗氧化與降血脂能力，為推廣藥桑深加工和綜合利用提供了新思路。