高強度超聲處理對大豆7S和11S球蛋白結構和理化性質的影響

田 然，馮俊然，隋曉楠，江連洲

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

大豆蛋白組分按離心過程中的沉淀性質可以分為四種—2S、7S、11S和15S，其中7S和11S球蛋白是大豆蛋白的主要成分，占總量的65%~80%[1]。7S主要組成部分為β-伴大豆球蛋白，分子量約150~200 kDa，糖含量約為5%，是由β（~47.8 kDa）、α（~63.5 kDa）和α'（~67.2 kDa）三個亞基通過氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用組成的三聚糖蛋白[2]。11S主要組成部分為大豆球蛋白，分子量約為320~375 kDa，是一種六聚體蛋白質，它由兩個重疊的六邊形環(huán)組成，由酸性亞基A（~38 kDa）和堿性亞基B（~20 kDa）通過疏水相互作用和靜電相互作用結合在一起[3]。有研究將六聚體中的五個亞基分為兩個亞基組合，根據(jù)氨基酸序列的特點分為亞基組Ⅰ（A1aB2，A1bB1b和A2B1a）和亞基組Ⅱ（A3B4和A5A4B3）。作為大豆蛋白的兩個主要組成部分，7S和11S由于其結構的固有差異，會影響大豆蛋白的功能特性。然而，天然大豆蛋白具有緊密的球狀結構，因此其功能性會被其復雜的結構所限制。因此，需要對大豆蛋白進行結構改造，使其具有更高的表面活性狀態(tài)，以改善特定的功能性質，這可以通過物理、化學或酶法來實現(xiàn)[4]。

超聲處理是一種非熱加工技術，具有環(huán)境友好、節(jié)能、無毒、相對經濟和易于操作的特點[5]。超聲處理的應用被認為是食品工業(yè)的一個潛在增長領域，在提高食品質量方面具有良好的效果[6]。超聲波可分為兩種類型，即高頻低強度（100 kHz~1 MHz，強度<1 W/cm2）和低頻高強度（16~100 kHz，強度10~2000 W/cm2）[7]。低頻高強度超聲也被稱為“功率超聲”，廣泛用于改變食品的特性[8]。

近年來，高強度超聲處理作為一種可以改變蛋白質結構和性質的物理方法，一直是研究的熱門話題。以往的研究表明，超聲處理可以破壞大豆蛋白的非共價相互作用從而改變其結構[9]。Morales等[10]發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白在20 kHz、4.27 W的超聲處理下，蛋白的粒徑減小。Huang等[1]的研究表明，當超聲時間較短時，大豆蛋白樣品α-螺旋含量較低，無規(guī)卷曲量較高；而在較長時間（超過20 min）處理的中則相反，樣品α-螺旋較高，無規(guī)卷曲含量較低，說明蛋白的二級結構發(fā)生了改變。Zheng等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理還可以有效地提升大豆分離蛋白的疏水性和巰基含量。然而目前，超聲處理對7S和11S的結構和理化性質的影響少有報道，也缺乏關于超聲對二者熱特性影響的研究。另外，在以往的研究中，高強度超聲處理蛋白的應用通常被限制在100 W/cm2以下的相對較小的范圍內。

因此，本研究通過施加更高功率（150 、450 、1350 W）不同時間（15 、30 min）的超聲處理，探究7S和11S二三級結構、粒徑分布、微觀形貌、溶解性、乳化性等結構和功能性質以及熱特性在超聲后的變化，為高強度超聲處理在大豆蛋白開發(fā)利用方面的研究提供進一步的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 東北農業(yè)大學農學院提供；大豆油 九三糧油工業(yè)集團有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）制備試劑盒、2×蛋白上樣緩沖液、彩虹廣譜蛋白分子量標準品 北京索萊寶科技有限公司；尿素（Urea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate,SDS）、甘氨酸 美國Amresco公司；β-巰基乙醇Geniview公司； 考馬斯亮藍R-250 國藥集團化學試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS） 美國Sigma-Aldrich；其它所有化學試劑 均為國產分析純。

XH-300A+電腦微波超聲波組合合成萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；KjelFlex K-370凱氏定氮儀 瑞士步琦公司；Mini-PROTEAN Trtra垂直電泳槽 Bio-Rad公司；Gel DocTM EZ imager 凝膠電泳成像系統(tǒng) Bio-Rad公司；MAGNA-IR560 傅里葉紅外光譜儀 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；RF-6000 型熒光分光光度計 日本島津公司；NANO ZS90粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；DSC Q2000 差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；SU8010 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（配備PP3010T型冷凍傳輸系統(tǒng)） 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 7S和11S的制備 7S和11S按照Matsumura等[12]的方法制備。將成熟大豆磨碎成細粉，按1:5（w/w）的比例用正己烷脫脂。將脫脂豆粉分散在去離子水（1:8，w/v）中，用2.0 mol/L NaOH調pH至8.0，在20 °C下連續(xù)攪拌1 h后，將分散液在10000×g，4 °C下離心30 min收集上清液。收集的上清液中加入1.0 mmol/L的還原劑Na2SO3以增加蛋白質的溶解度，并用2.0 mol/L的HCl調節(jié)溶液的pH至5.8。然后將溶液在6500×g離心30 min，沉淀得到11S粗品。分離后得到的剩余水相部分，用2.0 mol/L鹽酸調節(jié)至pH5.0。將酸化后的樣品在室溫下攪拌1 h，然后在10000×g和4 °C下再次離心30 min。收集上清液，使用2.0 mol/L的HCl調pH至4.5并離心（20 min，6500×g，4 °C），分離得到7S粗品。將分離出的7S或11S粗品分散在去離子水中，用2.0 mol/L的NaOH調節(jié)pH至中性，然后用去離子水洗滌3次。將7S和11S冷凍干燥，并儲存在干燥器中。用凱氏定氮法[13]測定出制得的7S和11S樣品的蛋白質含量分別為92.21%和93.37%。

1.2.2 7S和11S的超聲處理 將等量的7S和11S分散于去離子水（1:25，w/v）中，攪拌2 h，用NaOH（2.0 mol/L）調節(jié)溶液的pH至7.0。分別對7S和11S溶液進行超聲處理，頻率為20 kHz，功率輸出為150、450和1350 W，超聲處理時間設定為15 min和30 min。通過浸泡在冰水浴中，樣品在整個超聲處理過程中一直保持在較低的溫度。然后將7S和11S在4 °C下保存或凍干以備后續(xù)分析。由于超聲系統(tǒng)中能量的損失，介質中的實際超聲能量水平低于設定的輸出功率。因此，實際的超聲強度是通過量熱法[14]確定的，基于實驗前30 s內的溫度升高值進行計算。當輸出功率為150、450和1350 W時，計算出實際超聲強度分別為18.31、44.75和111.86 W/cm2。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）參考Wu等[15]之前描述的方法進行。將凍干的7S和11S溶解在SDS-PAGE緩沖液（0.124 mol/L Tris-HCl，15%甘油，2% SDS，5%β-巰基乙醇和0.0025%溴酚藍，pH=6.8）中，蛋白質濃度為4 mg/mL，然后在100 °C的水中煮沸5 min，以10000×g離心3 min。將10 μL上清液上樣至凝膠上。分別在80 V和120 V的電壓下在濃縮膠和分離膠中進行電泳。用考馬斯亮藍R-250染色，并在脫色液（40%甲醇和10%冰醋酸）中脫色過夜。使用帶有Image Lab軟件的凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠進行拍照。

1.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析 根據(jù)本課題組以前研究中的實驗方法[16]，用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征超聲處理前后7S和11S的二級結構。凍干的7S和11S與KBr按照1:10的比例充分混合進行研磨，壓片放入托盤中。然后，托盤被轉移到樣品架上進行光譜掃描。光譜儀的分辨率設定為4 cm?1，進行11次掃描。用PeakFit Version 4.12軟件對酰胺I、II和III帶的數(shù)據(jù)進行去卷積、峰分離和擬合分析，通過高斯積分面積計算7S和11S二級結構各組分的含量百分比。

1.2.5 內源熒光光譜分析 將超聲處理前后的7S和11S溶解在0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH7.0）中，使樣品最終濃度為0.05 mg/mL。將樣品溶液置于石英比色皿中進行內源熒光光譜分析，激發(fā)波長設置為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為5 nm。發(fā)射波長范圍為300~450 nm，掃描速度為10 nm/s。

1.2.6 粒徑分布分析 由Wu等[15]描述的方法進行粒徑分布測定。將凍干的7S和11S溶解在PBS（0.01 mol/L，pH7.0）中，以達到0.5 mg/mL的最終濃度。然后將分散液通過醋酸纖維素水溶液濾膜（顆粒保留率0.45 μm）過濾，以去除不溶性部分。使用Zetasizer Nano ZS90粒徑電位分析儀將1 mL濾液加入到透明的zeta cell中進行粒度測定。

1.2.7 表面疏水性的測定 根據(jù)Kato等[17]的方法，用1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）作為熒光探針測定表面疏水性。將凍干的7S和11S分散在0.1 mol/L PBS（pH7.0）中，在室溫下攪拌1 h，然后離心（10000×g，30 min）。上清液用0.1 mol/L PBS（pH7.0）稀釋得到0.05~0.4 mg/mL不等的梯度濃度，蛋白質濃度由Lowry法[18]測定。將40 μL ANS溶液（0.008 mol/L ANS溶解在0.1 mol/L PBS緩沖液中，pH7.0）與每個樣品的4 mL混合，并在黑暗中靜置3 min。用熒光光譜儀在波長390 nm（激發(fā)）和470 nm（發(fā)射）下測定樣品熒光強度。繪制熒光強度與蛋白質濃度的關系圖，線性回歸分析計算的初始斜率取為H0。

1.2.8 差示掃描量熱法分析 使用DSC Q2000熱分析儀檢測樣品的熱變化。凍干的7S和11S按照Ren等[19]描述的方法進行處理。準確地稱取每個樣品2 mg放在鋁制坩堝中。然后，用0.01 mol/L PBS（pH7.0）以約1:5（w/v）的比例潤濕樣品后密封。坩堝置于室溫下24 h以達到平衡，然后在氮氣環(huán)境下以5 °C/min的速度從25 °C加熱到110 °C，測定其熱吸收曲線。以密封的空坩堝作為參照物。

1.2.9 溶解度測定 根據(jù)Nazari等[20]的方法測定溶解度。用去離子水稀釋7S和11S分散液至1%（w/w）的濃度，并調整pH至7.0。將等體積的各個樣品在23 ℃下以20000×g離心15 min。使用Lowry法[18]測定上清液中的蛋白質含量，并使用牛血清白蛋白作為標準品。隨后用下式計算蛋白質的溶解度：

式中：m1表示上清液中蛋白質含量，g；m2表示離心前分散液中蛋白質的含量，g。

1.2.10 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 使用Jamdar等[21]的方法稍作修改測定乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）。將7S和11S樣品溶液稀釋至蛋白濃度為2 mg/mL，然后與大豆油以3:1（v/v）混合后在20000 r/min下均質2 min。分別在剛結束均質時和均質后10 min從容器底部吸取乳液（50 μL），然后用0.1%的SDS溶液（0.01 mol/L，pH7.0的PBS制備）將乳液稀釋至5 mL，混勻后用紫外-可見分光光度計在500 nm處測定吸光度，讀取吸光值。EAI和ESI根據(jù)如下公式（2）和（3）進行計算：

式中：DF表示稀釋倍數(shù)（100）；A0表示剛結束均質時乳液的吸光度；A10表示均質后10 min時乳液的吸光度；φ表示比色皿的光程（1 cm）；θ表示油相體積分數(shù)（0.25）；C表示蛋白質的初始濃度，g/mL。

1.2.11 冷凍掃描電子顯微鏡的表征 根據(jù)Whitby等[22]的方法，使用冷凍掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)。將7S和11S蛋白溶液滴入位于支架上的冷凍掃描電子顯微鏡短管中，并在氮氣中進行冷凍。然后，將短管轉移到超真空低溫室中，在?95 °C下切割并蝕刻60 s，切割后的切面涂上鉑金，轉移到掃描電鏡的冷凍室內（?170 °C）。用顯微鏡控制軟件拍攝超聲處理前后的7S和11S的顯微圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究結果以3次平行的實驗數(shù)據(jù)均值±標準差的方式表示。每組數(shù)據(jù)重復3次，利用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan檢驗（P<0.05）作為事后檢驗，以比較3組實驗數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 7S和11S的SDS-PAGE

經超聲處理和未經超聲處理的7S和11S SDSPAGE圖譜如圖1，可以清楚地表明本實驗提取出的7S和11S的分子量，其中7S在約67、71和50 kDa處有條帶，而11S在約35和22 kDa處有條帶，這與過去報道的中的亞基分子量大致相同[23]。然而，超聲處理并沒有改變這兩種蛋白質的分子量，這一點從SDS-PAGE圖像中相似的條帶上可以看出。這說明超聲處理沒有改變蛋白質的主要結構。同樣，O'sullivan等[24]也報道了在超聲處理后豌豆蛋白的分子量幾乎沒有變化。超聲處理后蛋白質的分子量幾乎不變，說明超聲處理可能不會破壞共價鍵，也就是說蛋白質分子的一級結構沒有改變[25]。

圖1 超聲處理前后7S和11S的聚丙稀酸胺凝膠電泳條帶圖Fig.1 SDS-PAGE graph of 7S and 11S with and without ultrasound treatment

2.2 7S和11S紅外光譜分析

傅立葉變換紅外光譜（FTIR）是測定蛋白質二級結構的常用技術[26]。在蛋白質的二級結構中，α-螺旋結構主要通過多肽中CO和NH基團之間的氫鍵來穩(wěn)定。每4個氨基酸形成的α-螺旋結構是非常穩(wěn)定的，因為，每一個氨基酸，其-CO-NH-基團都會參與形成兩個氫鍵。β-折疊結構，無論是平行還是反平行，都是通過氫鍵來穩(wěn)定的。無規(guī)則卷曲則可以賦予蛋白質極大的靈活性，這對蛋白質的功能性質來說是必不可少的。

酰胺I帶（1700~1600 cm?1的光譜區(qū)域）揭示了多肽結構的振蕩與蛋白質連接的C=O鍵的拉伸振動有關[27]。振蕩使得酰胺I帶對蛋白質二級結構的改變很敏感，因此酰胺I帶也被稱為蛋白質二級結構的指紋[28?29]。通過將光譜的酰胺I帶（圖2）進行去卷積來預測二級結構的百分比。從表1中可以看出，超聲處理對7S和11S的二級結構有顯著影響（P<0.05）。超聲處理使7S的β-折疊展開，同時形成α-螺旋、β-轉角和無規(guī)則卷曲。經不同超聲時間和功率條件處理的7S各結構含量差別較小，尤其是無規(guī)則卷曲的含量，各樣品之間差異不顯著（P>0.05）。與未處理組，11S蛋白的二級結構中α-螺旋、β-轉角和無規(guī)則卷曲的含量略有減少，而β-折疊的含量在超聲條件為1350 W、30 min時增加了5.95%。β-折疊一般埋藏在多肽鏈內部[30]，因此β-折疊的減少說明超聲處理改變了蛋白的空間構象，導致蛋白質結構松散。無規(guī)則卷曲含量的增加進一步證實了超聲處理過程中形成了更多無序的分子結構。結構含量的變化可能是由于超聲處理誘導了氫鍵的變化，導致11S的疏水區(qū)域暴露度進一步增強[31]。在以往的研究中，Zou等[32]報道，隨著超聲處理時間的延長，貽貝肌漿蛋白的α-螺旋的含量降低（從36.9%到29.2%），β-折疊含量增加了6.2%。Wang等[33]則報道了超聲處理使α-螺旋結構和β-折疊含量減少。這些研究同樣表明，超聲處理可以破壞蛋白質分子中的氫鍵等分子間相互作用，從而削弱蛋白質的剛性結構，導致二級結構的變化[34]。

表1 7S和11S的二級結構含量Table 1 Secondary structure contents of 7S and 11S

圖2 超聲處理前后7S和11S紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra for the ultrasound treated and untreated 7S and 11S

2.3 7S和11S內源熒光光譜分析

蛋白質中的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr），尤其是Trp殘基，與蛋白質的折疊狀態(tài)密切相關，可以用來描述蛋白質三級結構的變化[5]。而Trp和Tyr基團周圍的局部分子環(huán)境變化可以通過蛋白的熒光光譜反映出來[35]。圖3展示了7S和11S在進行和未進行超聲處理時的內源熒光光譜，可以看出7S和11S的熒光發(fā)射峰的最大吸收波長（λmax）分別在348 nm和352 nm處，并且在超聲處理后保持不變。但未進行超聲處理的7S和11S的熒光強度均為最高，而超聲處理后所有樣品的熒光強度均有不同程度的下降。具體來說，隨著超聲功率的增大，熒光強度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，且在超聲條件為450 W、30 min 時7S和11S熒光強度降低幅度最大，分別高達12.65%和6.82%。超聲處理后熒光強度的降低與Wen等[36]的報道結果一致。熒光強度降低的可能原因是本實驗相對于其他報道中使用了更高的超聲強度，在極端的超聲強度下，蛋白質分子暴露的發(fā)色團被淬滅，從而降低了熒光強度[37]。此外，超聲處理會導致更多的發(fā)色團被埋沒，變得無法檢測，這也可能是熒光強度降低的原因之一[5]。但當超聲功率為1350 W 時，超聲促使蛋白中部分被掩埋的發(fā)色基團重新暴露，形成了一個反復的過程，這使得熒光強度又重新有所升高，但仍低于未經過超聲處理的樣品。這種超聲處理后熒光強度降低但λmax不變的結果表明，超聲處理對Trp和Tyr等發(fā)色團周圍的極性微環(huán)境影響較小，但會影響發(fā)色團的暴露，導致蛋白質的三級結構發(fā)生一些變化[38]。

圖3 超聲處理前后7S和11S內源熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectroscopy of 7S and 11S with and without sonication

2.4 7S和11S粒徑分布分析

蛋白質的聚集程度可以通過測量顆粒的大小來表示[39]。如圖4所示，未經過超聲處理的7S和11S的粒徑分布均呈現(xiàn)雙峰，且峰差明顯。7S的峰值強度分別位于43.8和225 nm處，11S的峰值強度分別位于37.8和220 nm處。出現(xiàn)這種分布，第一個峰可能是由于低聚物或單體的存在，第二個峰則是由于較大的聚集物所致[40]。超聲處理后，7S和11S的粒徑分布均向小顆粒方向移動，且蛋白質的粒徑分布范圍縮小。對于7S，在以450 W持續(xù)超聲處理30 min時，粒徑減小最為明顯；而對于11S，在1350 W的功率下持續(xù)超聲處理30 min時，粒徑減小最為明顯。超聲處理后蛋白質粒徑的減小可能是由于超聲空化和聲流的綜合效應，它們提高了蛋白質顆粒的碰撞速度和強度，導致大的蛋白質聚集體被分解成更小的碎片，同時降低了蛋白質顆粒的粒徑[41?42]。隨著粒徑的減小，蛋白質和水分子之間接觸的表面積增加，這可能會導致蛋白質與水的相互作用增強，進而增加溶解度。多項研究表明，超聲處理可以減小蛋白質的粒徑。Arredondo-Parada等[43]對巨魷地幔的蛋白濃縮物進行超聲處理后，發(fā)現(xiàn)功率為38 W的超聲處理比22 W處理更能降低蛋白的粒徑。然而，與本文結果相反，Gülseren等報道[44]，當超聲處理時間超過40 min時，牛血清白蛋白的平均粒徑隨著超聲處理時間的延長而增加，這種現(xiàn)象的可能原因是過長的超聲處理時間反而促進了蛋白質聚集。

圖4 超聲處理前后7S和11S的粒度分布Fig.4 Particle size distribution of 7S and 11S with and without sonication

2.5 7S和11S表面疏水性分析

蛋白質的表面疏水性（H0）可以用于評價蛋白質受構象變化影響導致的功能特性變化[45]。它衡量蛋白質中暴露的疏水氨基酸殘基的數(shù)量，同時也表現(xiàn)蛋白質親水/疏水基團之間的平衡，反映了蛋白質的展開程度[46]。7S和11S的表面疏水性如圖5所示。從圖中可以看出，隨著超聲強度和時間的增加，樣品的H0逐漸增大。超聲處理后的7S和11S的H0均顯著高于對照樣品（P<0.05）。當超聲處理條件為1350 W，持續(xù)30 min時，7S的H0從16299增加到64608，11S的H0在此條件下也是最高的，比未進行超聲處理的11S增加了約157%。此外，在同樣的超聲處理條件下，11S的疏水性始終高于7S。Zhang等[47]也發(fā)現(xiàn)，超聲處理后，雞胸肉中肌纖維蛋白的H0增強。對這一現(xiàn)象的一種可能的解釋是，超聲處理過程中不同空化水平引起的湍流、剪切和微流體效應導致了蛋白質結構的擾動，促進了蛋白質側鏈的部分展開[48]。這種展開導致之前被阻斷的疏水基團的暴露，進一步導致了探針與之前被阻斷的疏水位點結合時，H0增加[49]。

圖5 不同超聲處理條件對7S和11S表面疏水性的影響Fig.5 Analysis of surface hydrophobicity of 7S and 11S with and without sonication

2.6 7S和11S差示掃描量熱法分析

DSC是一種研究蛋白質熱變性和熱力學性質的通用方法，因為它可以顯示超聲后不同處理條件導致的蛋白質自然結構損傷的空間變化[50]。圖6顯示了經過超聲處理和未經過超聲處理的7S和11S的DSC圖，所有樣品都觀察到了吸熱曲線。同時分析了變性溫度（T峰）以及焓值來評估7S和11S的變性程度。由表2中數(shù)據(jù)可以看出，未經超聲處理的7S和11S的變性溫度分別為77.29和93.93 °C，這與之前的研究結果基本一致[51]。超聲處理后，蛋白質的焓值（ΔH）與對照組相比均出現(xiàn)了減小。一般來說，ΔH與誘導構象變化所需的能量有關，而T峰則反映了蛋白質結構的穩(wěn)定性[20]。在6種超聲處理條件下，7S的ΔH由1.22 J/g最多下降到0.17 J/g，11S的ΔH由1.41 J/g最多下降到0.53 J/g。超聲處理后的7S和11S需要較少的能量來展開蛋白質結構，反映出蛋白原有的空間結構結構被超聲所破壞，從而降低了蛋白質變性所需的能量[52]。而7S和11S之間ΔH變化程度的差異可能是由于11S的結構更為致密，二硫鍵更多更穩(wěn)定。因此，11S受超聲處理的影響比缺乏二硫鍵的7S小。這種穩(wěn)定性的差異也可以通過2.3所述的超聲處理后熒光強度下降的程度反映出來。另外，觀察到T峰位置隨超聲處理而變化，但變化不明顯。T峰與蛋白質結構有關，所以T峰的輕微變化是由于超聲處理后7S和11S的結構變化造成的[33]，而這種結構變化可能是由于蛋白質中疏水鍵的改變。Mir等[53]也報道了藜麥種子分離蛋白的類似結果。超聲處理25 min后，藜麥種子蛋白的ΔH從46.78 J/g下降到38.75 J/g。

圖6 超聲處理前后的7S和11S的DSC圖Fig.6 DSC thermograms of 7S and 11S with and without sonicatio

表2 超聲處理后的7S和11S的DSC分析Table 2 Analysis of DSC of 7S and 11S with and without sonication

2.7 7S和11S溶解度分析

由于溶解度是一種影響蛋白質功能特性的重要性質，本文測定了7S和11S在超聲處理后和未經過超聲處理時的溶解度。如圖7所示，與未經超聲處理的7S相比，所有超聲處理后的7S的溶解度均顯著增加（P<0.05）。在6種不同的處理條件下，7S的溶解度分別增加了3.14%、4.30%、6.18%、3.08%、9.32%和12.85%。在超聲處理條件為450 W、30 min時，7S的溶解度增加最少。11S表現(xiàn)出與7S相似的變化規(guī)律，超聲處理使其溶解度最高增加10.57%。但當強度和時間分別為1350 W和15 min時，11S的溶解度沒有明顯改善（P>0.05）。

圖7 不同超聲處理對7S和11S溶解度的影響Fig.7 The effects of different sonication conditions on solubility of 7S and 11S

在自然狀態(tài)下，蛋白質以聚集的形式存在。而超聲處理破壞了蛋白質的分子內鍵，使肽鏈變得疏松，促進了可溶性蛋白質聚合體或單體的形成[54]。此時蛋白質與水分子結合的能力增強，從而提高其溶解度。Jiang等[55]也提出，蛋白質分子與一些較小顆粒解聚形成亞單位的過程是溶解度提高的有效驅動力。蛋白質溶解度增強的另一個可能原因是超聲處理在蛋白質表面制造了高速的聲波流動，導致蛋白質表面活性增加，親水性增強[56]。然而，隨著超聲功率的持續(xù)增加及時間的延長，7S和11S的溶解度又出現(xiàn)了一定程度的下降。這一現(xiàn)象可能是因為蛋白質分子進一步展開和膨脹，暴露出了更多的疏水基團和巰基[33]。這些結果表明，超聲處理對蛋白質的影響是一個反復的過程，其效果可能因蛋白質和超聲處理條件的不同而不同。

2.8 7S和11S的乳化性及乳化穩(wěn)定性

乳化性能表示蛋白質單位重量穩(wěn)定的界面面積，表征蛋白質對油水界面的吸附能力[57]。超聲處理對7S和11S的乳化性能（EAI和ESI）的影響如圖8所示。兩種蛋白經超聲處理后，EAI均顯著高于對照組樣品（P<0.05）。7S超聲處理條件為1350 W，30 min時，EAI增加80.55%，11S超聲處理條件為450 W，30 min時，EAI增加48.96%。而當超聲處理條件為1350 W時，11S的EAI有所下降，但仍高于未經超聲處理的樣品。7S和11S的ESI與EAI的變化趨勢相似，超聲處理后均顯著升高（P<0.05）。這一發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的幾項研究一致，這些研究報道了超聲處理過的乳清蛋白[15]、小麥谷蛋白[58]的EAI和ESI都有顯著（P<0.05）的改善。超聲處理減小了7S和11S的顆粒大小，部分展開了7S和11S的結構。更無序的結構增加了蛋白質在油水界面的吸附傾向[20]，從而提高了7S和11S的EAI。此外，更高的溶解度也加速了蛋白質在界面上的擴散。ESI與蛋白質的高疏水性之間有很強的正相關性[59]。表面疏水性的增加增強了界面蛋白之間的疏水性相互作用，從而提高了ESI。

圖8 超聲處理對7S和11S EAI和ESI的影響Fig.8 The effects of ultrasound treatment on EAI and ESI of 7S and 11S

2.9 7S和11S冷凍電鏡表征

為了進一步觀察不同超聲處理條件對7S和11S結構的影響，拍攝了如圖9所示的蛋白質溶液冷凍電鏡照片。圖中可以很明顯地觀察到7S和11S在經過和未經過超聲處理時的不同圖像。對于7S，隨著超聲強度和時間的增加，可以觀察到蛋白質結構從有序的致密網(wǎng)狀結構（A~G）逐漸發(fā)生變化。當樣品在150 W的強度下超聲處理30 min時，7S結構已經變得疏松（C）。當超聲處理條件為1350 W，持續(xù)30 min時，蛋白質表面更粗糙，更不規(guī)則（G）。而沒有經過超聲處理的11S則以有序、分散的結構存在（H）。在450 W的功率下，超聲處理后的11S微觀結構長度比對照組變短（K、L）。在超聲功率為1350 W的處理下，11S顯現(xiàn)出更多的無序結構和許多不規(guī)則的孔隙（M、N）。7S和11S發(fā)生這些變化可能是因為超聲處理破壞了蛋白質分子之間的交聯(lián)[60]。這使得分子結構隨著蛋白質的空間構象的變化而展開[29]。這些結果與超聲處理下蛋白質顆粒大小的變化是一致的，并為超聲處理導致蛋白質團聚體破壞的假說增加了證據(jù)。

圖9 超聲處理前后7S（A~G）和11S（H~N）冷凍電鏡分析Fig.9 Cryo-scanning electron microscopy analysis of 7S （A-G） and 11S （H-N） with and without sonication

3 結論

超聲處理不改變7S和11S的分子量，但可以破壞蛋白質分子中的氫鍵等分子間相互作用，削弱蛋白質的剛性結構，導致二級結構的變化。超聲處理使蛋白質分子暴露的生色團淬滅，樣品的熒光強度下降。經超聲處理后，7S和11S樣品焓值下降，展開蛋白質結構所需的能量變少。超聲處理提高了7S和11S的表面疏水性、溶解性和乳化性，減小了平均粒徑，且粒徑分布范圍縮小，7S和11S從較為有序的網(wǎng)狀聚集狀態(tài)轉變?yōu)闊o序的狀態(tài)。

以上結果表明超聲處理能一定程度地調控7S和11S的空間結構，進而改善其理化特性。本研究為超聲處理7S和11S對蛋白結構和理化性質產生的影響提供了部分參考，使超聲改性蛋白的合理應用有一定的理論依據(jù)。