Toll樣受體7/8與腎臟疾病

徐孝東 綜述 劉志紅 審校

腎臟是人類系統(tǒng)性自身免疫性疾病最常受累的器官,組織駐留免疫細胞是對局部損傷做出反應的理想場所。固有免疫是啟動機體免疫應答的先頭部隊,可對自身或外源性抗原做出快速而強有力地回應,加強固有免疫細胞對外源信號分子的響應、分子調控網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點分子和核心功能分子的發(fā)現(xiàn)對于理解腎臟器官區(qū)域免疫激活和疾病的發(fā)生機制都具有重要意義[1]。Toll 樣受體(TLR)是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的表面模式識別受體,通過識別損傷相關模式分子(PAMPs)觸發(fā)分子級聯(lián)事件來誘導促炎因子的合成和分泌,進而激活固有免疫以清除病原體;而在無菌性炎癥中,TLR的持續(xù)活化又增加了自身免疫性疾病發(fā)生的危險。作為特異性單鏈核酸感受器,TLR7/8在腎臟固有細胞和免疫細胞中廣泛表達,是觸發(fā)腎臟器官區(qū)域免疫調控網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點分子,其異常激活可導致多種腎臟疾病[2]。本文就TLR7/8與腎臟疾病的關系做一綜述,以進一步揭示TLR7/8在腎臟器官區(qū)域免疫中的特性和相關機制。

TLR7/8信號通路及激活方式

至今已發(fā)現(xiàn)11種人源性TLR和13種鼠源性TLR[3]。與TLR家族其他成員不同,TLR7/8分布于內體和溶酶體膜中,配體為單鏈RNA(ssRNA)。在蛋白結構方面,TLR7/8均屬Ⅰ型跨膜糖蛋白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內信號轉導區(qū)組成。胞外區(qū)由富含亮氨酸的串聯(lián)重復序列組成,其作用是識別PAMPs;胞內區(qū)為核心區(qū)域,含有Toll和白細胞介素(IL)受體同源的結構域(TIR)信號區(qū),負責激活下游信號級聯(lián)反應。當TLR7/8與配體結合后,通過髓樣分化因子88(MyD88)依次激活IL-1受體相關激酶、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子6,最終通過核因子κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和干擾素調節(jié)因子5(IRF5)三條信號途徑合成和分泌促炎因子(IL-6,TNF-α等)。促炎因子一方面可以誘導組織細胞損傷,另一方面又可吸引和募集更多的炎癥細胞到達炎癥部位,加重組織損傷程度;在無菌性炎癥中,TLR7/8的持續(xù)活化也可導致自身免疫性疾病[4]。雖然TLR7/8識別配體均為ssRNA,但激活方式有很大不同。

TLR7激活方式作為核酸感受器,TLR7的激活受到嚴格控制。生理情況下,TLR7以無活性的單體形式存在,與配體結合后引發(fā)單體二聚化,這是其激活的必要條件。TLR7為雙重核酸感受器,具備兩個配體結合位點。第一結合位點(1st)位于二聚體界面中心位置,配體為鳥苷(G);第二結合位點(2nd)靠近二聚體界面,配體為富含尿苷(U)的ssRNA(≥3-mer)。正常情況下,TLR7單體1st對G親和力較低,無法引起TLR7單體二聚化;但當富含U的ssRNA片段與2nd結合后會使1st對G的親和力提高。所以,存在ssRNA時,G一旦與TLR7的1st結合,會使TLR7構象發(fā)生改變,誘導單體二聚化,產生典型的“M”馬蹄樣結構。最后TLR7通過二聚體的TIR結構域之間的細胞內相互作用誘導信號級聯(lián)反應。TLR7所識別的為ssRNA降解產物,而并非完整的ssRNA序列(圖1)[5]。

圖1 TLR7激活機制[7]TLR7:Toll樣受休7;G:鳥苷；U：尿苷

除ssRNA外,TLR7也可被小分子化合物(如咪唑喹啉類)和G衍生物激活。小分子化合物與TLR7的親和力遠高于G,原因歸因于小分子化合物比G增加了烷基基團,它可以插入到受體的疏水口袋內,增強與TLR7的1st親和力。例如,TLR7對G和雷西莫特(R848)的親和力(Kd)分別為 13.5 μM和0.49 μM,與R848的親和力約為G的27.6倍,在高度親和力的作用下即使缺乏ssRNA也可直接誘導TLR7單體發(fā)生二聚化和激活。但TLR7對G的親和力可以通過ssRNA的結合顯著增加,比如TLR7與ssRNA結合后其1st對G的Kd從13.5 μM提高到0.93 μM,親和力提高了14.5倍[5]。這也就是說明,1st是所有類型配體激活TLR7所必需的,而2nd僅是ssRNA誘導激活所必需的。

通過TLR7對ssRNA序列識別偏好性分析發(fā)現(xiàn),UUU基序為TLR7 2nd識別的最小核酸序列,位于中間的U2與TLR7 2nd的氨基酸殘基之間形成氫鍵被嚴格識別,不能被其他核苷替換,而側翼的U1和U3被松散識別,允許被其他核苷替換。此外,研究發(fā)現(xiàn)攜帶三個U-ssRNA激活TLR7的能力最強,攜帶兩個U-ssRNA又比攜帶一個U-ssRNA展現(xiàn)出較強的TLR7激活能力,但值得注意的是,一些攜帶一個U-ssRNA序列仍然會展現(xiàn)出一定程度的TLR7激活能力。比如含有CUC基序ssRNA比含有GUG/AUA基序的ssRNA具備更強的TLR7激活能力。綜合晶體學、生物物理學和細胞實驗數(shù)據(jù)建立的TLR7-ssRNA序列偏好性的模型認為:TLR7 2nd的所識別第一個核苷優(yōu)選U,其次為 C/A/G;第二個位置嚴選U;第三個位置優(yōu)選U和C,其次為A和G;也就是說ssRNA 基序與TLR7親和力大小依次為:UU (U/C)(高強度結合)>UU (G/A)(中度結合)>XUX (減弱或無結合;X代表A、G或C)[6]。

TLR8激活方式盡管TLR8與TLR7結構及識別配體相似,但激活機制有所區(qū)別。生理情況下,TLR8以二聚體形式存在,在沒有配體結合前TLR8二聚體胞內段TIR信號域距離較遠,沒有生物活性;當TLR8二聚體與配體協(xié)同激活后,二聚體胞內段TIR信號區(qū)域相互靠近,進而募集下游MyD88接頭蛋白觸發(fā)級聯(lián)反應[7]。TLR8在人類和小鼠中的作用存在重要差異,比如人類TLR8可通過識別ssRNA介導宿主天然免疫,但小鼠TLR8對ssRNA刺激不敏感。原因在于嚙齒類動物TLR8缺乏識別配體過程中起著重要作用的5個保守氨基酸基序(RQSYA)[8]。本文主要就人類TLR8進行闡述。

TLR8也具備兩個配體結合位點,為雙配體協(xié)同激活[7]。1st位于二聚化界面的中心,配體為ssRNA降解產物U;2nd位于二聚體的凹面上,配體為含RU基序(R為嘌呤,代表G或A)的ssRNA。生理情況下,TLR8 1st對U親和力較弱,在缺乏RU-ssRNA片段的情況下無法與1st結合;但當RU-ssRNA片段與TLR8 2nd結合后則會顯著提高1st對U的親和力,當TLR8被雙位點協(xié)同激活后,胞內段TIR信號域發(fā)生構象變化而相互靠近,從而觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應。比如,Li等[9]報道ssRNA120 (GUCUGAGUGUGUUCUUG)可激活TLR8并誘導TNF-α的釋放,而將U 替代為A的fake RNA120 (GACAGAGAGAGAACAAG)則失去了對TLR8激活的能力(圖2)。

圖2 TLR8的激活機制[11]TLR8:Toll樣受休8;U：尿苷

盡管TLR8 1st表現(xiàn)出對U的偏好性,但TLR8對U的親和力(Kd=55 μM)仍然低于小分子化合物(如R848的Kd=0.20 μM)。在ssRNA存在的情況下,TLR8對U的Kd值可以增加達到1.0 μM,這意味著在生理條件下,U不能單獨激活TLR8,但ssRNA的存在彌補了U相對較低的親和力的缺點;而小分子化合物本身與TLR8 1st的親和力足夠高,所以在缺乏ssRNA的情況下仍可以激活TLR8。這些結果表明,若ssRNA激活TLR8則必須結合2兩個識別位點,而小分子化合物僅需要與1st結合即可[7]。

既然TLR8通過兩個不同的結合位點來感知RNA降解產物,這表明不同ssRNA對TLR8的刺激可能涉及到一種共同的RNA降解途徑。研究表明,核糖核酸內切酶(RNase T2)是TLR8識別RNA分子的關鍵上游成分,它在有核細胞中廣泛表達。由于RNase T2對ssRNA中的RU基序具有獨特的底物特異性,RNase T2優(yōu)先在R-U之間裂解ssRNA分子,產生R-2’,3’-環(huán)磷酸末端片段,這些寡核苷酸構成了TLR8 2nd的理想配體;此外,RNase T2也會增加對U-磷酸(U>p)的分解代謝,這是激活TLR8的另一個先決條件[10]。TLR8 2nd能容納R端殘基的二核苷酸和三核苷酸,而R之前的核苷酸優(yōu)選U,其次為R(例如(U)UR>p)。通過對TLR8 2nd所識別的ssRNA 基序長度發(fā)現(xiàn),(U)URU構成了ssRNA激活TLR8的最短基序[10]。但另一項研究認為,RNase T2除了可以在R-U殘基之間裂解,也可以在嘧啶(Y,代表C或U)-U之間裂解,剪切位點發(fā)生在U之前。另一種核酸酶RNase 2與RNase T2協(xié)同互補,裂解作用位點發(fā)生在U之后,在兩種核酸酶的作用下導致ssRNA 協(xié)同釋放U和ssRNA短鏈[11]。

TLR7/8與腎臟疾病

TLR7與腎臟疾病Tlr7基因位于X染色體,主要在B細胞和漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中表達,所以女性中的表達量要高于男性,而暴露于TLR7激動劑的女性B細胞比來自男性的B細胞會更有效地分化為抗體分泌細胞[12];這也是女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患病率要高于男性的主要因素之一[13]。

TLR7與自身免疫性疾病中的關系已在SLE小鼠模型中得到充分闡述。比如自身抗原可在B細胞表面被B細胞抗原受體(BCR)識別,從而啟動其細胞內化過程,一旦進入內體,自身抗原可激活B細胞中的TLR7,使B細胞優(yōu)先被招募到生發(fā)中心并分化為CD138+漿母細胞,增加個體對SLE的易感性[14]。在MRL/lpr小鼠模型中,適度增加Tlr7基因拷貝量可促進具有RNA特異性的自身反應性淋巴細胞和髓系細胞的增殖,產生以抗U1小核糖核蛋白抗體(抗RNP抗體)積累為特征的狼瘡樣綜合征[15];大量增加Tlr7基因拷貝量則可發(fā)生致死性炎癥反應,而敲除Tlr7基因可緩解疾病進展和病情嚴重程度,并減少針對自身RNA抗原的抗體水平,抑制淋巴細胞的激活和血清IgG含量[16-17],但不會降低抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體的水平,因為ds-DNA抗體的產生取決于TLR9的表達[18]。本研究團隊近期的一項臨床研究表明,由霉酚酸酯、他克莫司和類固醇組成的多靶點療法比單藥常規(guī)治療更能有效地實現(xiàn)重癥狼瘡性腎炎(LN)患者的完全緩解。為了探索多靶點療法的潛在分子機制,本研究團隊采用單一療法或多靶點療法對MRL/lpr小鼠進行治療,研究發(fā)現(xiàn)與單一療法相比,多靶點療法能顯著改善腎臟預后,通過轉錄組學分析顯示,多靶點療法能顯著抑制小鼠腎臟中的TLR7表達和下游IL-6/Stat3通路激活。隨后該結論在LN患者的腎活檢組織樣本中進一步得到驗證[19]。此外,TLR7同樣在糖尿病中扮演著非常重要的調控作用,比如與野生型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠相比,Tlr7-/-NOD小鼠的發(fā)病時間明顯延遲,1型糖尿病的發(fā)病率也顯著降低;分子機制研究表明Tlr7基因敲除促進了B細胞PD-L1的表達,以此來抑制CD4+T細胞的增殖;并通過下調B細胞主要組織相容性復合體(MHC)分子的表達減弱其抗原呈遞功能,抑制細胞毒性CD8+T細胞的增殖與激活。因此,靶向TLR7的治療可能有助于糖尿病的預防[20]。Zheng等[21]研究發(fā)現(xiàn),IgA腎病患者腎組織中浸潤的B細胞表達TLR7水平與腎功能[估算的腎小球濾過率(eGFR)和血清肌酐]及腎組織病理學指標(腎小管萎縮、白細胞浸潤、腎小管間質纖維化和腎小球硬化)密切相關;浸潤的TLR7+CD19+B細胞不僅在腎臟中上調炎癥因子分泌水平,而且還可通過TLR7-GALT2軸促進半乳糖缺乏型IgA1的合成,加重IgA腎病患者炎癥程度和促進疾病進程。

微小RNA(miRNA)作為ssRNA的一種特殊形式,除了在轉錄后基因調控中的常規(guī)作用,還可以直接作為TLR7的生理配體。最近的研究表明,具有富含UG序列的成熟miRNAs也能激活TLR7。例如,miR-21、miR-29a、miR-25-3p和miR-92a-3p均富含UG序列,可以作為小鼠TLR7配體誘導巨噬細胞分泌促炎因子[22-23]。Lehmann等[24]發(fā)現(xiàn)富含UG序列miRNA let-7b在神經(jīng)元中作為TLR7信號的有效激活因子,誘導神經(jīng)變性。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)肝細胞受損后會以被動形式向循環(huán)中釋放大量的miR-122,miR-122被小鼠肺泡巨噬細胞吸收并作為配體激活TLR7,導致巨噬細胞M1極化和分泌大量炎性細胞因子(如TNF-α和IL-6)。通過組織病理學分析發(fā)現(xiàn)肝損傷小鼠模型的腎臟也出現(xiàn)不同程度損傷,但是否由miR-122通過循環(huán)系統(tǒng)激活腎組織固有細胞或巨噬細胞TLR7而引起腎臟炎癥和組織損傷有待進一步研究。

TLR8與腎臟疾病與TLR7不同,TLR8在pDCs和B細胞中不表達,而在髓系細胞中大量表達,如單核細胞,巨噬細胞和中性粒細胞。因鼠源TLR8不識別ssRNA,為研究人源TLR8的分子機制,Guiducci等[26]建立了多株表達不同人源Tlr8(hTlr8)基因拷貝量的轉基因小鼠,研究發(fā)現(xiàn),表達高拷貝量hTlr8的小鼠逐漸發(fā)展為消瘦性疾病,其胰腺、腎臟、唾液腺和關節(jié)部分出現(xiàn)嚴重炎癥,腎組織病變類型主要為腎盂腎炎和腎小球腎炎,其疾病嚴重程度與hTlr8表達水平密切相關。隨后作者在細胞水平上證實hTlr8是通過上調樹突狀細胞共刺激分子的表達以增強了對T細胞的激活作用。重要的是,雖然TLR7和TLR8在小鼠中的過度表達都會導致致死性炎癥反應,但疾病表型卻截然不同, Tlr7轉基因小鼠發(fā)生腎小球腎炎、肝壞死和嚴重的貧血,但胰腺、關節(jié)和唾液腺不受影響,這使得腎小球腎炎成為兩種模型之間唯一的共同特征。另外在Tlr7轉基因小鼠中,剔除B細胞足以消除疾病癥狀,這表明在該模型中B細胞Tlr7的過度表達驅動了疾病發(fā)展。而在hTlr8轉基因小鼠中,B細胞表達非常低水平的hTLR8,并且不會擴張或浸潤受累器官,所以B細胞不太可能扮演類似的中心角色。而單核細胞和巨噬細胞中的hTLR8激活及所分泌的細胞因子(IL12p70)可以誘導下游Th1細胞反應,促進IL-18和IL-12p70的釋放,進而觸發(fā)NK細胞釋放IFN-g[27]。所以推測hTlr8轉基因小鼠疾病發(fā)展的原因更有可能是DCs和巨噬細胞激活產生促炎因子以及促進Th1啟動和分化導致的器官損傷所致[26]。

盡管鼠類TLR8(mTLR8)不能對ssRNA產生免疫反應,但有研究顯示,在狼瘡小鼠的腎組織中mTLR8 mRNA表達量及下游促炎因子水平要顯著高于正常對照組,而且其mRNA水平與足細胞功能標志物(Nphs1、Nphs2和Synpo)水平呈顯著負相關,與尿白蛋白量呈正相關,研究結果提示mTlr8的過表達與足細胞損傷及疾病進展相關,但狼瘡小鼠mTLR8是如何激活的尚不清楚[28]。另一項研究指出,小鼠單側梗阻致使腎小球和血清miR-21水平升高。miR-21可通過激活足細胞TLR8信號通路并分泌炎性因子進而導致足細胞損傷[29]。但此項研究尚缺乏miR-21激活足細胞TLR8的直接分子生物學實驗。

小結：腎臟作為機體一個功能復雜的重要器官,具備獨特的區(qū)域免疫學特性,對其分子調控網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點分子和核心功能分子的發(fā)現(xiàn)和認識對于理解組織器官區(qū)域免疫在特定疾病發(fā)生機制中的作用具有重要意義。進一步闡明TLR7/8作為觸發(fā)區(qū)域免疫的關鍵因子在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用,將有助于提升對腎組織器官的區(qū)域免疫學特性的了解和促進新免疫治療靶點的發(fā)現(xiàn)。