石油污染土壤中苯的微生物去除

林國慶，張麗春，初 慧，陳美滿，王明明

（1. 中國海洋大學 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；2. 山東省海洋環(huán)境地質(zhì)工程重點實驗室，山東 青島 266100）

齊魯石化廠位于山東省淄博市臨淄區(qū)。監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，該廠區(qū)附近地下水中的有機污染物濃度整體呈上升趨勢，主要有機污染物為苯。苯在含水層中的遷移轉化過程主要受介質(zhì)吸附和微生物降解的影響。目前針對苯的吸附已有大量研究。吸附作用雖可降低水體中苯的濃度，但未從根本上解決問題。生物降解是地下水中苯無害化的主要途徑，研究發(fā)現(xiàn)微生物對苯的降解效果與降解菌的濃度、土壤養(yǎng)分含量等因素有關。SOUZA等利用微生物將苯的去除率提高到60%~80%。YANG等通過添加微量元素提高了菌株對苯的去除率。YOU等分離出了可將苯完全去除的菌株。而不同深度土壤介質(zhì)中，微生物的種群特征及養(yǎng)分供給量均不同。因此，污染物在向下遷移的過程中，微生物對苯降解的貢獻率仍需進一步評估。

本工作通過靜水實驗分析了不同埋深的無菌和有菌土壤介質(zhì)對苯的自然降解規(guī)律，并通過土柱實驗探究天然和人工馴化微生物對苯的去除規(guī)律。為弄清微生物降解的潛力及生物強化修復的可行性，采取高通量測序手段分析微生物群落結構特征，為現(xiàn)場生物修復提供理論支撐。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

苯：優(yōu)級純；HgCl：分析純。

微生物菌種：分別取齊魯石化廠區(qū)附近200~300 m深度處的灰?guī)r及石油烴污染土壤（油污土）各200 g，粉碎后用無菌去離子水浸泡24 h，經(jīng)0.2 μm濾膜抽濾截留微生物，得到巖土菌種和油污土菌種。

實驗土壤：采自廠區(qū)附近未受污染的可耕農(nóng)田，取土深度為0.5，1.0，1.5 m，分別記為淺層土、中層土、深層土。經(jīng)風干、除雜、研碎后，過2 mm篩。滅菌實驗土壤：使用前將實驗土壤在121℃滅菌鍋中高溫滅菌30 min。

地下水：采自當?shù)匚词芪廴镜牡叵滤?，依?jù)《地下水環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（HJ164—2020），經(jīng)0.2 μm濾膜過濾去除懸浮顆粒物，4 ℃保存。滅菌地下水：使用前將地下水在121 ℃滅菌鍋中高溫滅菌20 min。

含苯滲流液：采用（甲醇）∶（滅菌地下水）= 1∶100的甲醇-水溶液配制苯質(zhì)量濃度為20 mg/L的苯-甲醇-水溶液。

牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.4~7.6。

無機鹽培養(yǎng)基： NaHPO4 g，KHPO1.5 g，NHCl 1 g，MgSO·7HO 0.2 g，CaCl0.02 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.03 g，NaNO1.0 g，MnSO·5HO 4.3 mg，ZnSO·7HO 4.3 mg，CuSO·5HO 4.0 mg，CoCl·6HO 0.25 mg，去離子水1 000 mL，pH 7.4~7.6。

營養(yǎng)液：按微生物生長所需的營養(yǎng)元素比例（C）∶（N）∶（P）=100∶10∶1配制，其成分包括葡萄糖、NHCl、KHPO、NaCl等。

HQ30D型水質(zhì)分析儀：美國HACH公司；GI54TR型滅菌鍋：美國ZEALWAY公司；AIRTECH型超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司；6890N/5975B型氣相色譜質(zhì)譜儀：安捷倫科技公司；UV-6000PC型紫外-可見分光光度計：惠普公司； TGL型高速離心機：上海器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯降解菌的培養(yǎng)馴化

在兩個500 mL 棕色廣口瓶中分別加入巖土菌種和油污土菌種，再加入牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基500 mL，密封在（25±1） ℃恒溫條件下避光連續(xù)培養(yǎng)3 d，分別得到巖土菌種子液和油污土菌種子液。

在兩個1 L的棕色微生物培養(yǎng)馴化瓶中各加入500 mL無機鹽培養(yǎng)基及作為唯一碳源的苯，再分別加入300 mL巖土菌種子液和油污土菌種子液，于（28±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。7 d后取1 mL培養(yǎng)液測定苯質(zhì)量濃度。剩余培養(yǎng)液在3 000 r/min下離心10 min后去除上清液，將底部沉淀物轉接至500 mL新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，再次加入苯。重復上述過程，在馴化過程中逐步提高苯濃度，直到苯質(zhì)量濃度從10 mg/L提高至20 mg/L。穩(wěn)定培養(yǎng)2周，得到巖土菌懸液及油污土菌懸液。

1.2.2 微生物降解苯的靜水實驗

分別取20 g不同取樣深度的實驗土壤，置于100 mL滅菌玻璃瓶內(nèi)，加入含苯地下水溶液80 mL，封口后15 ℃避光靜置，各設置3組平行樣。按相同方法設置無菌對照組：采用滅菌實驗土壤，加入0.02 mg/L HgCl作為抑菌劑。分別在不同降解時間取樣，每次抽取0.5 mL上清液測定苯的質(zhì)量濃度，并測定溶液的氧化還原電位（ORP）。

1.2.3 垂直入滲條件下微生物降解苯的土柱實驗

土柱實驗裝置示意見圖1。有機玻璃柱（長30 cm，內(nèi)徑5 cm）用紫外燈滅菌30 min。在柱內(nèi)由下至上分別裝填等質(zhì)量的不同取土深度（1.5，1.0，0.5 m）處的3種實驗土壤，柱兩端各裝填1 cm厚度的石英砂。

圖1 土柱實驗裝置示意

分別設計4組土柱實驗（A，B，C，D組），每組各3個土柱作為平行樣。A，C，D組中填充滅菌實驗土壤，B組填充實驗土壤。各土柱用無菌去離子水飽水24 h后從柱頂通入含苯滲流液。其中A組的含苯滲流液中加入0.02 mg/L HgCl作為抑菌劑，B，C，D組加入營養(yǎng)液。C和D兩組分別緩慢注入10 mL油污土菌懸液及巖土菌懸液。實驗過程中維持流出液流量為5.2~5.5 mL/h，定期收集并測定流出液中苯的質(zhì)量濃度和ORP值。

1.3 分析方法

苯質(zhì)量濃度的測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：DB-5毛細管柱；載氣為He氣，流量1 mL/min，分離比5∶1；進樣溫度為250 ℃；升溫程序起始溫度為40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min的升溫速率升至300 ℃，保持15 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30~500/。

馴化得到的苯降解菌的高通量測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

土壤有機質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法 （HJ 615—2011）。

溶液ORP的測定采用水質(zhì)分析儀。

2 結果與討論

2.1 苯降解菌的種類

通過高通量測序得到巖土和油污土菌懸液中微生物的豐度，見圖2。由圖2可見：從巖土中馴化出的苯降解菌主要來自不動桿菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、紅球菌屬（）和假單胞菌屬（），其中紅球菌屬的微生物豐度最高；油污土菌懸液中包含了不動桿菌屬（）、紅球菌屬（）和假單胞菌屬（）的微生物，其中假單胞菌屬的微生物占有較高的豐度。有報道表明，假單胞桿菌和不動桿菌是環(huán)境中非常重要的兩類降解菌。

圖2 巖土和油污土菌懸液中微生物的豐度

2.2 靜置條件下苯的降解效果

靜水實驗中苯質(zhì)量濃度的變化見圖3。由圖3可見：實驗運行的第1天，無菌和有菌條件下苯的質(zhì)量濃度即出現(xiàn)明顯差異，無菌條件下含不同深度實驗土壤的地下水中的苯質(zhì)量濃度從20 mg/L降至10 mg/L左右，而有菌條件下苯的質(zhì)量濃度從20 mg/L降到8 mg/L左右；隨著時間的延長，有菌和無菌條件下苯濃度降低趨勢的差異更加顯著，無菌條件下呈現(xiàn)輕微下降的趨勢，而有菌條件下則顯著降低，如無菌條件下淺層土中苯質(zhì)量濃度在30 d內(nèi)由10 mg/L僅降到9 mg/L，而有菌條件下由8 mg/L顯著降低至2 mg/L，這說明除吸附過程外，微生物對苯的去除起到了重要作用；有菌條件下淺層土、中層土、深層土的苯質(zhì)量濃度在第30天分別為2.1，2.4，3.7 mg/L，苯去除率分別為89%，88%，82%，較無菌環(huán)境下的苯去除率（53%，52.5%，50%）提高了約30百分點；并且埋深越深的土壤介質(zhì)對水溶液中苯的去除率越低，呈負相關關系，原因可能是深層土中有機質(zhì)含量相對較少，約為3.83%（表1），供給微生物生長的養(yǎng)分不足，使得微生物對苯的降解效果減弱。

表1 實驗土壤中的有機質(zhì)含量 w，%

圖3 靜水實驗中苯質(zhì)量濃度的變化

ORP可以反映出好氧微生物對石油烴的降解性能。靜水實驗中ORP的變化見圖4。由圖4可見，無菌條件下反應液的ORP在30 d內(nèi)均維持在225 mV左右；在有菌條件下，反應液的ORP有明顯的下降趨勢，第9天時ORP降低到200 mV以下，最終維持在160 mV左右。苯提供了充足的碳源，微生物降解苯的過程中消耗了溶解氧，ORP隨之降低。但隨著溶液中苯濃度的降低，生物降解速度變緩，ORP又逐漸趨于穩(wěn)定。

圖4 靜水實驗中ORP的變化

2.3 垂直入滲條件下苯的降解效果

土柱實驗中苯質(zhì)量濃度的變化見圖5。由圖5可見：4個土柱流出液中苯的質(zhì)量濃度均在18 d后達到相對穩(wěn)定；裝有滅菌土的A柱主要是對苯的吸附效果進行研究，流出液中苯的質(zhì)量濃度在第18天達到最高值，約為4.6 mg/L，苯去除率為77%；含有微生物的B柱、C柱、D柱的流出液苯質(zhì)量濃度均在第22天達到最高值，苯去除率為79%~86%。

圖5 土柱實驗中苯質(zhì)量濃度的變化

土柱中苯降解貢獻率分析表見表2。由表2可見：不含微生物的A柱對苯的最低去除率為77%，可代表實驗土壤對苯的吸附量，設定此時吸附對苯去除的貢獻率為100%；含有天然微生物的B柱是土壤吸附和天然微生物降解協(xié)同去除苯，在穩(wěn)定階段苯的去除率為79%，其中生物降解的貢獻率約為2%（以A柱數(shù)據(jù)為基準折算，下同）；加入不同來源馴化微生物的C柱和D柱是采用土壤吸附和生物強化降解苯，在穩(wěn)定階段苯的最低去除率分別為86%和84%，其中生物降解的貢獻率分別為9%和7%，較存在天然微生物的B柱提高了3~4倍。從分析結果來看，自然環(huán)境中含有苯降解菌，但其豐度較低，導致了生物降解作用所占的比重偏低，苯的自然降解緩慢；加入馴化的微生物后，生物降解的貢獻率有所提高。在降解污染物時，混合菌種往往比單一菌種更為有效，能夠充分發(fā)揮各菌種之間的協(xié)同作用。因此，還需要進行長時間的自然選擇和馴化，才會使生物降解在土壤介質(zhì)內(nèi)的作用進一步增強。

表2 土柱中苯降解貢獻率分析表

土柱實驗中ORP的變化見圖6。由圖6可見：隨降解時間的延長，ORP總體呈下降趨勢；其中，加入馴化降解菌的C柱和D柱的流出液的ORP值均較低，最終維持在150~200 mV，其原因是添加的微生物在生物降解過程中需消耗溶解氧，ORP隨之降低，進而整個體系的氧化性降低。

圖6 土柱實驗中ORP的變化

3 結論

a）含有微生物的土壤在30 d內(nèi)對地下水中苯的去除率可達到80%以上，較無菌環(huán)境下苯的去除率提高了30百分點。地下水中苯的去除率與土壤的埋深呈負相關關系。

b）進入含水層中的苯容易被土壤所吸附。在土柱滲流系統(tǒng)中，苯的吸附去除約占77%；吸附和天然微生物協(xié)同作用對苯的去除率約占79%；加入馴化微生物后，苯的去除率達到了84%~86%。

c）天然微生物對苯降解的貢獻率約為2%。加入馴化微生物后，微生物的生物降解貢獻率可提高3~4倍。其中，紅球菌（sp.）和假單胞菌（sp.）等好氧菌是石油污染場地降解苯的主要微生物。