乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑安全性與功能性

耿克軍 劉欣

摘 要：目的：研究分析乳礦物鹽與牛磺酸復(fù)合片劑的安全性與功能特性。方法：采用急性毒理學(xué)、遺傳毒理學(xué)和90 d毒性試驗，考察復(fù)合片劑安全性;同時，以高、中、低3個劑量組進行為期30 d的灌胃試驗，分析其對小鼠體重、免疫器官指數(shù)、吞噬指數(shù)等免疫指標變化的影響。結(jié)果：毒理學(xué)試驗表明對小鼠無毒副作用、無致畸、各項生理功能正常;與對照組比較，小鼠的體重與免疫器官指數(shù)均無顯著的影響（P>0.05），但顯著提高了小鼠的細胞免疫功能和單核巨噬細胞吞噬功能等免疫功能（P<0.05）。結(jié)論：研究表明乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑安全無毒副作用，具有增強免疫力的功能。

關(guān)鍵詞：乳礦物鹽;?；撬?安全性;功能性;小鼠

Abstract： Objective： Research and analyze the safety and functional characteristics of milk mineral salt and taurine compound tablets. Methods： Acute toxicology， genetic toxicology and 90-day toxicity tests were used to investigate the safety of composite tablets; at the same time， a 30-day gavage experiment was carried out in three dose groups of high， medium， and low to analyze its effects on the body weight of mice， Visceral-to-body ratio， immune organ coefficient， phagocytic index and other immune index changes. Results： The toxicology test showed that the mice had no toxic side effects， no teratogenicity， and normal physiological functions. Compared with the control group， the body weight and immune organs index of the mice had no significant effect （P>0.05）， but it improved significantly. Immune functions such as phagocytosis index and anti-volume number of mice （P<0.05）. Conclusion： Studies have shown that milk mineral salt compound taurine tablets are safe， non-toxic and side effects， and have the function of enhancing immunity.

Keywords： milk mineral salt; taurine; safety; functionality; mice

乳礦物鹽源于牛乳，是將牛乳中天然存在的鈣及礦物質(zhì)鹽通過膜分離技術(shù)濃縮得到含鈣量較高的乳礦物質(zhì)[1]。乳礦物鹽不僅可補充鈣，還具有降低血壓、防止動脈血管狹窄等保健功能[2]。

?；撬嵋话阋杂坞x形式存在，廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定細胞膜、調(diào)節(jié)鈣水平的重要功能[3]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，?；撬峋哂薪档脱⒏纳铺悄虿?、抗腫瘤等活性，同時還具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。隨著對牛磺酸研究的日益深入，其已成為一種廣泛用于醫(yī)藥、食品、保健品行業(yè)的綠色添加劑。

基于乳礦物鹽與?；撬岬墓δ芴匦?，研究開發(fā)乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合保健功能產(chǎn)品，用以提高特殊人群如兒童、孕產(chǎn)婦、老人等人群的生理功能。因此，本文以乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑為受試樣品，分別進行動物安全性和功能性試驗，分析受試樣品對動物的安全性能和免疫功能的影響，為全面開發(fā)與利用乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

受試樣品為乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑，每片含乳礦物鹽600 mg，含?；撬?00 mg。片劑的服用方法是每日4片。片重1.5 g/片。因此，該片劑人體每日服用6 g，即0.1 g/kg·BW（成人體重按60 kg計）;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供清潔級昆明種小鼠300只，小鼠體重16～22 g，雌雄各半，許可證號：SCXK-（軍）2002-0001;飼料許可證號：清潔級，SCXK-（軍）2002-018。

印度墨汁，刀豆蛋白A（ConA），細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（MTT），1，8-二羥基蒽醌，0.9%NaCl，NaN3，Giemsa染色，碘硝基氯化四氮唑藍（INT），YAC-1細胞，Hanks液（pH值為7.2～7.4），吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、二甲基亞砜、臺酚蘭，1%壬基酚聚氧乙烯醚（NP-40），環(huán)磷酰胺（4 mg/mL），甲醇。

1.2 儀器設(shè)備

BD FACSCanto II流式細胞儀;干燥箱;倒置顯微鏡（OlympusIX71）;打孔器（8 mm）;微量血凝試驗板;離心機（2-16K）;酶標儀（RT-6100）;培養(yǎng)板（96孔）;CO2培養(yǎng)箱（Co-150）;紫外可見分光光度計（UV-1800）;倒置顯微鏡（OlympusIX71）。

1.3 試驗方法

1.3.1 受試樣品及配制

受試樣品為乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑，0.1 g/kg·BW（成人體重以60 kg計）。以去離子水作為對照。

1.3.2 動物分組與給藥

（1）功能性評價。合格證號：SCXK-（軍）2002-001，體重18～22 g清潔級昆明種小鼠雌雄各100只;合格證號SCXK-（軍）2002-018飼料均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級，室溫為20～22 ℃，相對濕度為（48～52）%RH，單籠喂養(yǎng)。試驗動物隨機分組，每組10只，設(shè)低、中、高3個劑量組，分別為0.5 g/kg·BW、1.0 g/kg·BW、3.0 g/kg·BW，每天定點灌胃（早10：00），連續(xù)灌胃30 d后進行試驗。

（2）安全性評價。①急毒試驗：同功能性試驗小鼠20只，且相同飼養(yǎng)條件。受試樣品劑量設(shè)計為20 g/kg·BW，一天兩次定點灌胃（早晚10：00），連續(xù)灌胃14 d，觀察小鼠體征與死亡情況。②遺傳毒性試驗：試驗小鼠75只，且相同飼養(yǎng)條件，群籠飼養(yǎng)，5只/籠;受試樣品劑量設(shè)計分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10 g/kg·BW。陽性組：環(huán)磷酰胺4 mg/mL，每天定點灌胃（早10：00）。灌胃后正常飲食，根據(jù)試驗需要觀察一定時間，分別進行試驗。③90 d經(jīng)口毒性試驗：清潔級昆明種大鼠40只，體重65～79 g，雌性各半，隨機分成4組、每組10只。設(shè)低、中、高3個試驗組，且受試樣品的劑量分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10.0 g/kg·BW，以去離子水為對照。試驗條件：室溫為19～24 ℃，濕度（40～55）%RH，單籠，每天定點灌胃（早10：00），連續(xù)灌胃90 d，自由進食飲水，每周記錄1次體重和2次食物攝入量以及飼料撒漏量。灌胃結(jié)束后進行病例學(xué)檢查，包括肝、脾、腎、胃腸、卵巢及睪丸。

1.3.3 功能性實驗評價

（1）小鼠體重的測定。連續(xù)灌胃30 d，稱量小鼠的初始和終期體重。

（2）免疫器官指數(shù)測定。參考張勇[4]的試驗方法。小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境3 d后，隨機分為對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組各10只。在乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑連續(xù)灌胃30 d并于末次灌胃12 h后，將小鼠脫頸椎處死，稱重，取腹腔液，并在無菌條件下分離稱重肝臟和脾臟。免疫器官指數(shù)計算公式為：

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/體重×100%

（3）單核-巨噬功能測定。①碳廓清試驗。受試樣品末次灌胃12 h后，分別在注射印度墨水2 min、10 min后，迅速取20 ?L的內(nèi)眥靜脈叢血，并與0.1% 2 mL Na2CO3溶液混合，于600 nm處測定吸光度值。同時脫頸椎處死小鼠，稱重肝臟、脾臟。吞噬指數(shù)a計算公式為：

式中：K-吞噬速率;OD1-2 min時的吸光度值;OD2-10 min時的吸光度值;t1-2 min;t2-10 min;a-吞噬指數(shù)。②腹腔巨噬雞紅細胞試驗。在小鼠腹腔內(nèi)注射1 mL 20%雞紅細胞30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死并固定在鼠板上，剪開腹壁皮膚并注入2 mL的生理鹽水，持續(xù)1 min轉(zhuǎn)動鼠板，然后在2片載玻片滴上腹腔洗液，在37 ℃的條件下溫育30 min。對載玻片進行漂洗、固定、染色、蒸餾水漂洗晾干及計數(shù)等操作處理。吞噬率和吞噬指數(shù)α計算公式為：

吞噬率=吞噬細菌的細胞數(shù)/計數(shù)的細胞數(shù)×100%（4）

吞噬指數(shù)α=（100個吞噬細胞吞噬的細菌總數(shù)）/100（5）

（4）細胞免疫功能測定。①ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，按照楊迪[5]的試驗方法。②遲發(fā)型變態(tài)試驗。受試樣品末次灌胃12 h后，將50 ?L的DNFB均勻涂抹于3 cm×3 cm脫毛的腹部皮膚;5 d后，在小鼠的右耳涂抹10 ?L的DNFB溶液，涂抹處理24 h后，取直徑8 mm的左右耳片稱重[6]，左右耳腫脹度差計算公式為：

左右耳腫脹度差=右耳重量-左耳重量（6）

1.3.4 安全性評價

（1）急性經(jīng)口毒性試驗。試驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，選健康成年小鼠20只，雌雄各半，劑量設(shè)計為20 g/kg·BW，每天定點灌胃（早10：00），一天灌胃2次。正常飲食14 d后，觀察記錄實驗動物體征變化。

（2）遺傳毒性試驗。①小鼠骨髓細胞微核試驗。小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，選50只健康小鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，設(shè)低、中、高3個試驗組，每組受試樣品劑量分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10 g/kg·BW，另設(shè)去離子水陰性對照組及環(huán)磷酰胺陽性對照組，采用兩次給藥，間隔24 h，于末次給藥12 h后，取胸骨制片、固定、染色，油鏡下觀察1 000個PCE細胞，計算微核細胞率。②精子畸形試驗。動物適應(yīng)環(huán)境3 d，選用25只健康雄性小鼠，隨機分為5組，每組5只，設(shè)低、中、高3個試驗組，每組受試樣品劑量分別為2.5 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW、10 g/kg·BW，陽性對照為4 mg/mL的環(huán)磷酰胺注射液，陰性對照組為去離子水。試驗組及陰性對照組均經(jīng)口灌胃。于首次給受試物后的第35 d處死小鼠，取附睪制片、染色，于油鏡下對每只動物計數(shù)1 000條精子，計算精子畸形發(fā)生率，采用卡方檢驗進行統(tǒng)計。

（3）90 d經(jīng)口毒性試驗。對選取的試驗組的大鼠連續(xù)灌胃90 d，進行病理組織學(xué)檢查。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均采用3次平行試驗。單因素方差分析采用SPSS軟件。分別采用LSD法和Tamnane法統(tǒng)計分析方差齊性分析與方差不齊統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)顯著為概率值P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對小鼠體重影響的分析

表1為連續(xù)灌胃30 d受試樣品，小鼠體重的變化情況，由表1可知，受試樣品對小鼠體重均無顯著影響，差異不顯著（P>0.05），表明乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑未引起小鼠體重的變化。

2.2 乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

一般機體在健康條件下，各臟器與體重是相對恒定。小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)測定結(jié)果見表2。由表2可知，各組間數(shù)據(jù)均無顯著差異（P>0.05）。表明乳礦物鹽與牛磺酸復(fù)合片劑未能促進小鼠免疫器官的增長，對免疫器官指數(shù)無影響。

2.3 乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對小鼠細胞免疫功能的影響

表3為乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑對小鼠細胞免疫功能的影響。由表3可知，高、中、低各劑量組的ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值顯著高于對照組（P<0.05），高、中、低各劑量組的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的左右耳腫脹度（即抗體水平）顯著優(yōu)于對照組（P<0.05），說明乳礦物鹽和?；撬釓?fù)配片劑顯著增強細胞免疫活性。

2.4 單核-巨噬細胞功能測定

由表4可知，與對照組比較，各組的碳廓清吞噬指數(shù)a、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)差異顯著（P<0.05）。說明受試樣品促進機體免疫細胞的增加，具有抗感染、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

2.5 急性經(jīng)口毒性試驗測定

由表5可知，在急性毒理試驗觀察期內(nèi)，試驗動物生長良好，進食正常，未見中毒特征及死亡，大體解剖未見異常。

2.6 遺傳毒性試驗測定

2.6.1 小鼠骨髓細胞微核試驗

由表6可知，小鼠的微核細胞率均正常，其中陽性對照組微核細胞率明顯高于陰性對照組，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異極顯著（P<0.01），說明受試動物敏感，試驗可靠。PCE/NCE在正常范圍內(nèi)，受試樣品對小鼠骨髓嗜多染紅細胞未見致突變作用，結(jié)果為陰性。

2.6.2 小鼠精子畸形試驗

由表7可知，受試物各劑量組動物精子畸變率均<30%，在正常范圍內(nèi)，陽性對照組精子畸變率明顯高于陰性對照組，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異極顯著（P<0.01），說明受試小鼠敏感，試驗結(jié)果可靠，受試樣品乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑未對小鼠精子產(chǎn)生損傷作用，受試樣品未顯示生殖毒性和對生殖細胞潛在的致突變性，小鼠精子畸形試驗結(jié)果為陰性。

2.6.3 90 d經(jīng)口毒性試驗測定

基于前期試驗觀察，試驗大鼠機體及各項生理指標正常，所以僅設(shè)計對照組與高劑量組，分析受試樣品對大鼠機體各組織器官的影響。各處理組中動物數(shù)均為10只。由表8、表9可知，大鼠的肝、膽管、胃、十二指腸黏膜、睪丸及卵巢等組織正常。胃和十二指腸黏膜完整，無明顯腺體增生萎縮改變。僅出現(xiàn)個別腎髓質(zhì)部可見小囊腫，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤等病理學(xué)改變。綜合可知，各組大鼠無明顯病理變化，受試樣品乳礦物鹽和?；撬釓?fù)合片劑安全、無毒副作用。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，乳礦物鹽與牛磺酸復(fù)合片劑未顯著影響小鼠的體重與免疫器官指數(shù)，卻顯著提高了小鼠的細胞免疫能力和單核巨噬細胞吞噬能力。另外，通過急性毒理學(xué)、遺傳毒理學(xué)和90 d毒性試驗發(fā)現(xiàn)，乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑安全無毒副作用。綜合可知，乳礦物鹽與?；撬釓?fù)合片劑具有較高的安全性與免疫調(diào)節(jié)功能，可用于保健食品開發(fā)利用。

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